重組狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介導(dǎo)體外表達(dá)的研究

1、重組狗凝血因子的慢病毒介導(dǎo)體外表達(dá)的研究         08-03-03 13:15:00     編輯：studa20      作者：孫海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐開林【摘要】  本研究的目的是制備攜帶狗凝血因子（cF）基因的慢病毒載體，探討慢病毒載體能否介導(dǎo)cF在體外的有效表達(dá)。用構(gòu)建攜帶cF基因的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動(dòng)子）和pTK162（含2OH1啟動(dòng)子），同時(shí)

2、構(gòu)建含綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動(dòng)子）和pTK162（含2OH1啟動(dòng)子）的方法，分別與包裝質(zhì)粒NRF、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，將包裝好的病毒顆粒再感染293T細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度和培養(yǎng)細(xì)胞上清中cF活性。結(jié)果顯示：經(jīng)限制性酶切鑒定，成功構(gòu)建了pTK161、pTK162、pTK161和pTK162正向連接載體；pTK161和pTK162的病毒滴度分別為1.54×106 U/ml和2.83×106 U/ml；pTK161、pTK162感染靶細(xì)胞后24小時(shí)細(xì)胞上清中即可檢測(cè)到cF的表達(dá)，72小時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰。pTK162載體cF表

3、達(dá)活性接近正常狗血漿F活性，而且明顯高于pTK161(p<0.05)，6周后cF表達(dá)活性仍達(dá)最高值的1/4。結(jié)論：構(gòu)建的自身失活慢病毒載體可攜帶較大片段的cF基因，并在體外可獲得有效表達(dá)；本研究為慢病毒載體介導(dǎo)的血友病A的基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  慢病毒     Expression of Recombinated Canine Factor In Vitro Mediated by  Lentiviral Vector      Abstract &#

4、160;  The study was purposed to prepare the recombinant lentiviral vector pTK161 and pTK162 carrying Bdomaindeleted canine factor (BDDcF) gene, and to investigate whether the canine F(c) can be expressed in vitro. The BDDcF gene was ligated behind PUB and 2OH1 promotors to create lentiviral vec

5、tors  pTK161 and pTK162. Meantime lentiviral vectors pTK161 and pTK162 were  produced  by cloning a green fluorescent protein (GFP) into pTK151 and pTK152, which was driven by PUB and 2OH1 promotors respectively. Vector supernatant were prepared by using transfer calcium phosphate med

6、iatedcotransfection of 293T cells. The virus vector, NRF packagingplasmid, and VSVG envelopeplasmid was assayed by titers and cF activity in cell culture supernatant after infection into  293T cells. pTK161, pTK162, pTK161 and pTK162were identified by restriction enzyme analyzing. The results s

7、howed that the lentiviral vectors pTK161,pTK162, pTK161 and pTK162 were successfully constructed, and  the titers of pTK161and pTK162 reached to 1.54×106 U/ml and 2.83×106 U/ml; the activity of cF could be detected at 24 hours after  infection of 293T cells  by pTK161 

8、and pTK162, and achieved the highest level at 72 hours later. The higher level of cF activity was achieved by transfected with pTK162 than that of  pTK161 (p<0.05), which  closed to the cF activity in normal dog plasma. 1/4 of the highest level could be detected 6 weeks later.  It

9、is concluded that  the prepared HIV1based lentiviral vectors can  infect 293T cells to express cF effectively. The results provide the basis for further studying  HIV1based lentiviral vector gene therapy for hemophilia A.    Key words     lentiviral

10、vector；canine factor ；hemophilia A；gene therapy       血友病A是凝血因子（F）基因缺陷導(dǎo)致凝血因子缺乏的X隱性連鎖的出血性疾病。目前該病的治療方法主要是輸注血漿源性F制品或基因重組F產(chǎn)品，這種蛋白替代療法療效肯定，但存在費(fèi)用昂貴、血源性病毒感染、反復(fù)輸注會(huì)產(chǎn)生抑制性抗體等許多棘手的問(wèn)題1-3。由于血友病A是一種單基因遺傳病，基因治療可望成為一種有效治療手段4。 本研究分別構(gòu)建了含有 PUB 啟動(dòng)子和2OH1啟動(dòng)子cF的慢病毒表達(dá)載體pTK161和pTK162，采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，檢

11、測(cè)感染細(xì)胞上清中的cF活性，為血友病A慢病毒載體介導(dǎo)基因治療尋求有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。     主要試劑    各種工具酶、1 kb DNA Ladder、質(zhì)粒小量提取試劑盒WizardTM Plus SV Minipreps DNA Purification Systerm、目的基因純化試劑盒WizardTM PCR DNA Purification System、線性化載體純化試劑盒WizardTM DNA CleanUp System均購(gòu)自Promega 公司，凝血因子F活性檢測(cè)試劑盒CoamaticR 

12、0; Factor 購(gòu)自Chromogenix公司。    質(zhì)粒、菌種、包裝細(xì)胞    慢病毒載體pTK151（含有PUB啟動(dòng)子）、慢病毒載體pTK152（含有2OH1啟動(dòng)子）由本室構(gòu)建，pBKCMV（含B區(qū)缺失型FcDNA，BDDFcDNA）由北卡大學(xué)基因治療中心晁恒軍博士惠贈(zèng)，包裝質(zhì)粒NRF、包膜質(zhì)粒VSVG、感受態(tài)大腸桿菌、包裝細(xì)胞293T等均由本室制備或保存。    載體的構(gòu)建及鑒定    用Xba I和EcoR V雙酶切pBKCMV，得到4 400 bp的BDDFc

13、DNA片段,用低熔點(diǎn)凝膠進(jìn)行電泳，WizardTM PCR DNA Purification System 純化后作為插入片段。用Xba I和Hpa I雙酶切pTK151，與純化后的BDDFcDNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后的載體用BamH酶切鑒定，將正確的載體命名為pTK161。用Afe I單酶切pTK152，CIAP去5P，WizardTM DNA CleanUp System純化后，將插入片段BDDFcDNA插入到pTK152的Afe I酶切位點(diǎn)上，連接后載體用BamH鑒定，將正確的載體命名為pTK162（圖 1）。    Figure 1. 

14、60; Construction  map  of  Lentiviral  vector  including  BDDFcDNA.  重組慢病毒的包裝    采用磷酸鈣共沉淀法5將重組質(zhì)粒pTK161、pTK162（各15 g）分別與包裝質(zhì)粒NRF（10     g）、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG（5 g）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過(guò)夜，12小時(shí)后更換 無(wú)血清培養(yǎng)液，于37、5% CO2條件下 繼續(xù)培養(yǎng)。60小時(shí)后收集病毒上清，過(guò)濾后

15、-80保存。此外，在pTK151的PUB后插入綠色熒光蛋白（GFP）基因（pTK161）和在pTK152的2OH1后插入GFP后（pTK162），觀察GFP表達(dá)情況。    病毒滴度的測(cè)定    將293T細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板上，吸附6小時(shí)后，將所收集的含pTK161和pTK162病毒上清分別按對(duì)數(shù)級(jí)稀釋，將1 ml稀釋后的病毒上清分別加入到相應(yīng)的孔中，過(guò)夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液，48小時(shí)后，于熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)熒光陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，用下面的公式計(jì)算病毒滴度，并用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 

16、;   病毒滴度（U/ml）=GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×    相應(yīng)的稀釋倍數(shù)6    狗的凝血因子F活性測(cè)定    用pTK161和pTK162感染293T細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，按照CoamaticR  Factor 試劑盒操作說(shuō)明，用發(fā)色底物法檢測(cè)細(xì)胞上清中cF的活性，以感染前的細(xì)胞上清作為空白對(duì)照，并以正常狗的混合血漿作為參比血漿，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（選擇0-1.5 U/ml范圍），將測(cè)得的分光光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀數(shù)。    結(jié)    果