細胞培養(yǎng)操作步驟(共4頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上培養(yǎng)基的配置：基礎培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml凍存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置移液器1套（2.5l、20l、200l、1ml），酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（502），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200l、10l），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，保種管所需試劑：gibco高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材放于超凈工作臺內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實驗臺

2、面，并關閉工作臺打開紫外燈照射30min后開始實驗操作。首次傳代前細胞的復蘇，首先用一大燒杯盛滿37的溫水放于液氮罐旁邊，待細胞株取出后留上端1/3于37水面上盡最大速搖動管使其在2min內(nèi)迅速融化。若種管頂部含有凍存的細胞液在搖動期間用力甩動使其降于管底后再搖動。這一過程可在超凈工作臺外操作。實驗步驟一、原代細胞的培養(yǎng)1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將

3、培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。3. 取1個高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側，把保種管在超凈臺外用酒精棉球擦拭下2/3后拿進超凈臺內(nèi)在酒精燈上消毒保種管口2-3次放于臺面左手邊，取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取保種管內(nèi)的細胞液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋

4、在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實驗標記。5. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。6. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h，瓶蓋擰緊后拿出培養(yǎng)箱，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，及細胞形態(tài)。最后更換培養(yǎng)液。二、 培養(yǎng)液的更換1 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后

5、，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，4 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放。5 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消

6、毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。6. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。三、 細胞傳代1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位

7、置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 將培養(yǎng)瓶平放使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，這時為胰酶消化的最適時機。若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光

8、觀察細胞情況，可反復幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的最佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。6. 取2或3個高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到3或4個培養(yǎng)瓶內(nèi)（注意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進行1傳3或1傳4的培養(yǎng)。7. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整

9、個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實驗標記。8. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。9. 將培養(yǎng)瓶放于28,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。四、 細胞株的保存1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2. 將所需

10、的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈最近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。4. 將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，

11、立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，這時為胰酶消化的最適時機。若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細胞情況，可反復幾次，直至出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的最佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。5. 吸取1ml細胞凍存液于培養(yǎng)瓶內(nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。6. 將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。7. 將培養(yǎng)

12、基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8. 將保種管先放于4冰箱 30min后拿出放置-20冰箱過夜，次日再放于-80的冰箱內(nèi)3-4天，最后存放于-196的液氮灌內(nèi)長期保存。注此過程也可簡化因實際操作過程中經(jīng)驗所得：步驟7結束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80冰箱也可保存細胞株2-3月。五、 細胞轉染操作前：紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。1. 預混液A fugeneHD 5ul/孔 + OPTI-MEM 45ul/孔 室溫溫育10

13、min2. 預混液B arr 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室溫溫育5min3. 預混液C 空載 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室溫溫育5min4. 預混液D arr 12ul/孔 + ops 12ul/孔 + OPTI-MEM 26ul/孔室溫溫育5min注：fugeneHD為轉染試劑 ，arr，空載，ops為模板？OPTI-MEM為空培養(yǎng)基5. 將步驟2,3,4中的預混液B,C,D中分別加入步驟1中的等體積的預混液A，輕柔混勻，室溫溫育15min，再次輕柔混勻后室溫溫育15min。6. 取出6孔培養(yǎng)板，將每培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基全部吸凈，無殘留，是為了防止殘留的雙抗和胎牛血清影響轉染效果。加入1.5-