抗體偶聯(lián)藥物中的生物分析_圖文_百度文庫

1、抗體偶聯(lián)藥物研發(fā)中的生物分析李秀立, 陳笑艷, 鐘大放*(中國科學(xué)院上海藥物研究所, 上海藥物代謝研究中心, 上海201203摘要: 抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugates, ADCs 是一類單克隆抗體通過一段連接臂共價偶聯(lián)細(xì)胞毒性小分子化合物而成的復(fù)合物, 可以提高抗腫瘤藥物的靶向性并減少毒副作用。ADCs結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性并且其藥物抗體比值(drug-to-antibody ratio, DAR 在體內(nèi)呈動態(tài)變化, 其生物分析面臨著巨大的挑戰(zhàn), 常用的定量分析包括酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA和液相色譜質(zhì)譜分析(LC-MS。ADCs同其他生物制品一樣, 在體內(nèi)可能會產(chǎn)生抗

2、藥抗體(anti-therapeutic antibody, ATA, 影響其藥效、藥動學(xué)及安全性, 因此有必要評價其免疫原性。本文綜述了在ADC研發(fā)過程中常見的基于ELISA和LC-MS方法的待測物分析, 包括DAR分布、總抗體、結(jié)合型抗體、結(jié)合型藥物、游離藥物以及ATA分析, 可為我國的ADCs研發(fā)提供參考。關(guān)鍵詞: 抗體偶聯(lián)藥物; 藥物抗體比值; 免疫原性; 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng); 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中圖分類號: R917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號: 0513-4870 (2016 04-0517-12Bioanalysis in the development of antibody-dru

3、g conjugatesLI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang*(Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, ChinaAbstract: Antibody-drug conjugates (ADCs are complex molecules with cytotoxic small molecula

4、r drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioana

5、lysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA, which could affect its efficacy, phar

6、macokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibod

7、y, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China.Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS抗體偶聯(lián)藥物(antibody-drug conjugates, ADCs 是一類單克隆抗體通過一段連接臂(

8、linker 共價偶收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11.*通訊作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792聯(lián)細(xì)胞毒性小分子化合物而成的復(fù)合物, 用于治療惡性腫瘤。單克隆抗體可以靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原, 通過細(xì)胞內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后, 其結(jié)構(gòu)中的小分子藥物在溶酶體低pH環(huán)境或蛋白酶作用下釋放出來, 發(fā)揮細(xì)胞毒作用。由于單克隆抗體的靶向性, 正常組織細(xì)胞內(nèi)藥物濃度較低。因此與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比, ADC的系統(tǒng)毒性減少13。ADC由于自

9、身的優(yōu)勢, 逐漸成為工業(yè)界新藥研發(fā)的熱點。目前已經(jīng)有3個ADC上市: Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, 2000年上市, 由于安全性問題2010年主動撤市4、Adcetris (brentuximab vedotin, 2011年上市5和Kadcyla (trastuzumab emtansine, T-DM1, 2013年上市。Immunomedics公司的sacituzumab govitecan (IMMU-132 在2015年進(jìn)入FDA快速審評通道。截止2013年, 已有30多個ADC處于臨床試驗, 涉及20多個靶點, 分別針對血液腫瘤和實體瘤68。目前

10、國內(nèi)多家制藥企業(yè), 如山東齊魯制藥、江蘇恒瑞、浙江海正和正大天晴等公司紛紛開展ADC的研究; Li等9也合成了多種新型高活性抗CD20抗體偶聯(lián)藥物, 其中2F2抗體的突變體定點偶聯(lián)MMAE (monomethyl-auristatin E 而成的ADC體內(nèi)外抗腫瘤活性提高。在藥物研發(fā)過程中, 生物分析對于藥動學(xué)(PK 測定、PK/PD關(guān)系和安全性評價具有重要意義。隨著ADC的研發(fā)熱潮, ADC生物分析面臨的挑戰(zhàn)也凸顯出來。本文首先概括了ADC生物分析需要考慮的因素, 并總結(jié)了基于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA 和LC-MS方法

11、的ADC 相關(guān)物質(zhì)的生物分析。1 ADC生物分析的考慮因素1.1 ADC的異質(zhì)性ADC中抗體與小分子藥物通過一段連接臂共價鏈接, 小分子藥物可以通過該連接臂與抗體中的賴氨酸側(cè)鏈氨基結(jié)合, 如T-DM110; 或者與抗體鏈間的二硫鍵還原后得到的巰基結(jié)合, 如抗CD30的IgG1單克隆抗體cAC10-MMAE偶聯(lián)物11,12; 或者與抗體上特定位點引入的工程化半胱氨酸殘基結(jié)合, 如THIOMAB-藥物偶聯(lián)物13,14。通過前兩種形式得到的ADC中小分子藥物數(shù)目以及連接位置可能會不一致15, ADC實際為混合物。有文獻(xiàn)報道T-DM1的藥物與抗體比值(drug-to-antibody ratio, D

12、AR 在08之間, 平均DAR值為3.516, 通過鏈間二硫鍵還原得到的ADC DAR值通常為偶數(shù)17。通過抗體特定位點引入工程化半胱氨酸而得到的ADC異質(zhì)性較低, 如有文獻(xiàn)14報道可以獲得DAR值為2的同源ADC。1.2 DAR值體內(nèi)動態(tài)變化ADC中連接臂的化學(xué)穩(wěn)定性、連接位置和溶劑可接觸性(solvent accessibility 等因素均會影響ADC 的穩(wěn)定性18。盡管連接臂在設(shè)計時考慮到與靶標(biāo)結(jié)合之前的pH值和蛋白酶等因素, 理論上ADC在血漿中是穩(wěn)定的, 但是連接臂仍可能會在某些特殊情況下斷裂, 小分子藥物解離。例如, 以腙為基礎(chǔ)的連接臂在血液中性(pH 7.37.5 環(huán)境下穩(wěn)定,

13、 在溶酶體酶或低pH環(huán)境中小分子化合物可能會解離19; 通過二硫鍵或者半胱氨酸形成的ADC可能會對內(nèi)源性含游離巰基的肽類或蛋白比較敏感, 如谷胱甘肽和白蛋白等, 連接臂小分子藥物會轉(zhuǎn)移至谷胱甘肽或白蛋白結(jié)構(gòu)中18, 20。小分子藥物的解離會改變ADC的DAR值比例或出現(xiàn)新的DAR值A(chǔ)DC, 如抗體鏈間二硫鍵還原后得到的ADC在體內(nèi)可能會出現(xiàn)奇數(shù)DAR 值17, 21。huC242-DM1 (即Cantuzumab mertansine 實驗中觀察到結(jié)合型ADC比未結(jié)合的抗體清除快, 推測與藥物的解離有關(guān)系22, 有文獻(xiàn)23表明ADC的清除率隨DAR值增加而加快; T-DM1的體內(nèi)研究表明隨著時

14、間的推移, T-DM1的平均DAR值逐漸降低21。盡管工程化的ADC異質(zhì)性較低, 但是它在體內(nèi)也可能會部分解離, 形成異質(zhì)的混合物。小分子藥物的解離和不同DAR值A(chǔ)DC清除率的不同, 造成ADC在體內(nèi)動態(tài)變化。1.3待測物的選擇對于小分子藥物和蛋白類藥物, 一般測定原形藥物即可了解其暴露量與藥效應(yīng)答(exposure- response, ER 的關(guān)系。但是ADC中同時具有抗體和小分子藥物部分, 體內(nèi)DAR值動態(tài)變化, 再加上目前ADC臨床數(shù)據(jù)有限, 難以判斷哪一種待測物決定或影響了ADC的ER關(guān)系。一般來說, 在ADC研發(fā)初期, 盡可能測定多種待測物以了解ADC中各個組成部分的PK特征。這些

15、待測物一般包括: 總抗體(DAR0, 包括結(jié)合型抗體和游離的抗體、結(jié)合型ADC (結(jié)合型抗體和結(jié)合型藥物 和游離小分子藥物21, 24?？偪贵w的測定可以用于考察其PK特征是否符合一般的抗體PK特征, 不會因為藥物結(jié)合而發(fā)生改變21。結(jié)合型抗體可以從兩個角度進(jìn)行考察: 測定結(jié)合型的抗體或藥物, 后者可以提供抗體載藥量的直接信息, 結(jié)合后者與總抗體的數(shù)據(jù), 可以大致評估ADC平均DAR值的變化21。游離小分子藥物的濃度被認(rèn)為與其毒性相關(guān), 如果游離小分子藥物廣泛分布在血漿中, 可能發(fā)生脫靶作用, 產(chǎn)生毒性24。上述待測物的信息綜合起來有助于了解ADC的ER關(guān)系。除上述待測物外, DAR值的測定還可

16、以提供ADC體內(nèi)變化的信息, 有助于選擇合適的分析技術(shù)21。此外, ADC作為生物大分子進(jìn)入體內(nèi)后, 可能會引起免疫原性, 產(chǎn)生抗體(anti-therapeutic antibody, ATA, A TA 可能會導(dǎo)致ADC清除加快或藥效降低, 或者ADC被李秀立等: 抗體偶聯(lián)藥物研發(fā)中的生物分析·519·ATA帶至其他部位產(chǎn)生毒性, 因此在ADC研發(fā)過程中有必要評估ATA21, 24, 25。1.4 生物分析平臺的選擇傳統(tǒng)上, 體內(nèi)生物大分子的定量分析采用ELISA 方法26,27, 小分子藥物采用LC-MS/MS方法27。如上所述, ADC在研發(fā)過程中均需要對其抗體部分

17、和小分子藥物部分進(jìn)行生物定量, 因此ELISA和LC-MS/ MS的方法成為ADC分析的常用方法。ELISA方法可以用于抗體和小分子藥物測定15,21,24,28, LC-MS/ MS目前主要用于測定游離小分子21,24,28。近年來出現(xiàn)親和捕獲LC-MS/MS方法, 該方法首先采用親和捕獲的方法純化樣品, 隨后經(jīng)過酶消化過程測定代表性肽段或小分子藥物, 從而實現(xiàn)對總抗體、結(jié)合型抗體和結(jié)合型藥物的測定21,29。與小分子藥物的生物分析不同, ADC生物分析中所用的對照品實際為混合物, 且由于ADC的DAR值在生物體內(nèi)動態(tài)變化, 因此所使用的對照品并不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)樣品的真實濃度21。不同DAR

18、值的ADC與實驗中捕獲試劑或檢測試劑的結(jié)合能力可能不同, 影響總抗體和結(jié)合型抗體分析的準(zhǔn)確度17,23,24,30。有文獻(xiàn)21報道, 某抗前列腺1的六跨膜上皮抗原(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 1, STEAP1 的ADC在DAR值過高或過低時會由于立體位阻或低親和力而不能被準(zhǔn)確測定。目前的生物分析方法尚不能對單個DAR值的ADC進(jìn)行定量, 為準(zhǔn)確測定樣品濃度, 應(yīng)盡量選擇對DAR值不敏感的生物分析方法24。在分析方法建立時, 可以用純化或富集的ADC和未結(jié)合抗體的對照品驗證該方法對DAR值的不敏感性24。如果不能獲得純化或富

19、集的ADC,以總抗體分析為例, 可以嘗試在體外基質(zhì)(如血漿 中37孵育ADC一段時間, 假設(shè)在該時間內(nèi)ADC會發(fā)生藥物解離, 采用LC-MS方法鑒定樣品中DAR值分布變化, 然后用不同的總抗體方法測試DAR值分布改變的樣品, 如果所有樣品測試結(jié)果一致, 則該總抗體方法對DAR 值不敏感, 可以準(zhǔn)確測定不同DAR值的ADC21?；贏DC的復(fù)雜性, Genentech公司21、輝瑞公司15以及美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會24總結(jié)了針對ADC研發(fā)中的待測物的常用分析方法(表1, 以下將重點介紹各類待測物的生物分析方法及其應(yīng)用。2 ADC的生物分析經(jīng)典的ELISA方法為首先在載體表面(如96孔板包被捕獲試劑,

20、如重組抗原胞外結(jié)構(gòu)域(extracel-lular domain, ECD、互補決定區(qū)(complementarity determining region, CDR 的單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb、抗人IgG的mAb等, 然后加入待測物樣品, 孵育一定時間后, 再加入檢測試劑, 如偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP 的抗人IgG的mAb、生物素偶聯(lián)抗CDR的mAb/鏈霉親和素偶聯(lián)HRP, 此時形成一個三明治結(jié)構(gòu), 再加入酶的底物(如3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB 和

21、反應(yīng)終止液, 檢測特定波長下的吸收度, 計算其濃度(圖121。LC-MS/MS方法多用于測定小分子化合物, 目前也逐漸用于蛋白大分子的定量。與ELISA方法相比, LC-MS/MS方法對專屬性重要試劑的依賴性低, 方法開發(fā)和轉(zhuǎn)移相對簡單, 且可以同時檢測多個候選藥物(表231。對于分子質(zhì)量大于10 kDa的蛋白類大分子, 一般采用間接法進(jìn)行定量, 即檢測酶切產(chǎn)生的一條或多條特異性肽段, 用以表征蛋白濃度(圖2。在樣品預(yù)處理過程中, 首先利用蛋白沉淀法提取蛋白或利用親和捕獲的方法富集待測物, 隨后進(jìn)行酶切和LC-MS/MS檢測31,32。該方法中內(nèi)標(biāo)可選擇穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isoto

22、pe labeled, SIL 的蛋白、兩端添加36個氨基酸的SIL特異性肽段、SIL 特異性肽段或未標(biāo)記的蛋白/肽段類似物, 不同的內(nèi)標(biāo)在樣品處理過程中加入的時間不同, 對樣品處理Table 1Analytes commonly assessed for antibody-drug conjugates. ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay; HIC: Hydrophobic interaction chromatography; PD: Pharmacodynamics; PK: Pharmacokinetics; DAR: Drug-to-a

23、ntibody ratioAnalyte type Analyte detail Analysis method Objectivein vitro and in vivo DAR distribution DAR Affinity capture LC-MS, Affinitycapture HICCharacterize DAR changes in serum/plasma;Identify ELISA reagentsTotal Antibody DAR 0 ELISA, Affinity capture LC-MS/MS Evaluate the protein component

24、of ADC;Characterize if it has the general PKcharacteristics of an antibody Conjugated antibody DAR 1 ELISA, Affinity capture LC-MS/MS Evaluate the conjugate exposure Antibody conjugated drug Drug conjugated to antibody Affinity capture LC-MS/MS, ELISA Evaluate the conjugate exposureFree drug Unconju

25、gated drug Competitive ELISA, LC-MS/MS Assess safety characteristicAnti-therapeutic antibody (ATA Antibodies directed against antibodycomponent of ADC, linker or drugBridging ELISAEvaluate safety, relationship with PK/PD· 520 · 藥學(xué)學(xué)報 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (4: 517528 Figure 1 EL

26、ISA assays of total antibody (A, conjugated antibody (B, conjugated drug (C and free drug (D. ADC: Antibody-drug conjugates; anti-CDR: Anti-complementarity determining region; HRP: Horseradish peroxidase; ID: Idiotype; mAb: Monoclonal antibody; SA-HRP: Streptavidin-horseradish peroxidaseTable 2 Comp

27、arison of LC-MS/MS and ELISA for peptide/protein quantitationItemLC-MS/MSELISAAntibody requirement Usually not required, or one antibody is required for affinity captureTwo antibodies required Development time Short, days to weeks Long, weeks to monthsSpecificity High Low to high, depending on cross

28、-reactivity Dynamic range103105Usually 102Variability and interferenceLow; less susceptible to interference from endogenous target and anti-drug antibody High; susceptible to interference from endogenous target and anti-drug antibody Sensitivity ng ·mL 1g ·mL 1 pg ·mL 1 Throughput Low

29、 to moderateHighAssay transferrable Relatively easy to transfer between matrix and species Matrix and species selective Catabolism informationObtainableUnobtainable Figure 2 Affinity capture LC-MS/MS. IS: Internal standard;SIL: Stable isotope-labeled過程的校正作用也不同3133。親和捕獲LC-MS/MS 方法測定ADC 的相關(guān)捕獲試劑、檢測試劑及內(nèi)

30、標(biāo)見表3。目前在LC-MS/MS 法測定生物大分子方面尚沒有相關(guān)法規(guī), 關(guān)于其方法開發(fā)和驗證可以參見美國藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會發(fā)表的白皮書32。 2.1 DAR 分布ADC 在體內(nèi)隨著小分子藥物的解離或不同DAR值A(chǔ)DC 清除率的不同, 其DAR 值分布也在發(fā)生變化。研究DAR 值分布有助于了解ADC 的整體命運, 為ADC 體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。以上所說的ELI SA 和LC-MS/MS 方法并不能測定DAR 值。UV/VIS 光譜廣泛用于測定抗體濃度和DAR 值34。Yu 等35利用LC-MS 方法和紫外分光光度法測定了通過賴氨酸側(cè)鏈殘基偶聯(lián)的抗Her2抗體-SMCC N -琥珀酰亞胺- 4-

31、(N -馬來酰亞胺基環(huán)己烷-1-羧化物-DM1, 但是該方法為緩沖液體系, 不能適用于血漿/血清等復(fù)雜生物體系。Genentech 公司的科學(xué)家開發(fā)出兩種可以用于測定血漿/血清樣品中DAR 值分布的方法: 親和捕獲LC-MS 方法和親和捕獲疏水作用色譜 (hydrophobic interaction chromatography, HIC (圖321,29,36, 這兩種方法均可檢測完整的分子量, 用不同DAR 值A(chǔ)DC 去卷積化后的峰面積表征不同DAR 值的相對豐度。親和捕獲LC-MS 方法利用直接或間接固定在磁珠上的抗原、抗小分子藥物的抗體來捕獲目標(biāo)ADC, 隨后經(jīng)過洗滌和洗脫等過程,

32、樣品進(jìn)行毛細(xì)管柱李秀立等: 抗體偶聯(lián)藥物研發(fā)中的生物分析·521·Table 3Reagents used for ADC affinity capture LC-MS/MS assayObjective Capture probe Internal standard Detection specie Total antibody Generic: protein A/G, anti-Fc mAb; Specific: antigen, anti-ID mAb Extended SIL-universal peptide Universal peptide Conjugat

33、ed drug Generic: protein A/G, anti-Fc mAb; Specific: antigen, anti-ID mAb SIL-drug DrugConjugated antibody Anti-drug mAb Extended SIL-universal peptide Universal peptide Figure 3Antibody-drug conjuates drug-to-antibody ratio dis-tributions characterization. A: Affinity capture LC-MS; B: Affinity cap

34、ture HIC. ECD: Extracellular domainLC-MS分析(圖3A; 由于本方法在變性條件下完成, 非共價連接的輕鏈和重鏈會分開, 因此本方法只適用于含有鏈間二硫鍵且共價結(jié)合的ADC, 包括通過賴氨酸側(cè)鏈氨基或工程化半胱氨酸連接而成的ADC21,36。使用本方法的前提條件為在檢測過程中各DAR值A(chǔ)DC的離子化效率相同或相似, 這樣各DAR的峰面積才能用于表征各自的相對豐度21,36。Genentech的科學(xué)家利用此方法研究了通過工程化的半胱氨酸分別引入到抗體的重鏈和輕鏈上所得的兩種mAb A-vc (valine-citrulline, 纈氨酸瓜氨酸-MMAE ADC

35、 (DAR 值為2 在食蟹猴體內(nèi)的DAR值變化36。結(jié)果顯示給藥后21天, 血漿內(nèi)重鏈ADC以DAR1為主, 而輕鏈ADC仍以DAR2為主, 這表明連接臂的位置影響ADC的穩(wěn)定性, 連接在重鏈的藥物更容易解離36, 這與之前的研究結(jié)果類似18。偶聯(lián)位置影響ADC的穩(wěn)定性, 推測可能與馬來酰亞胺交換和丁二酰亞胺環(huán)水解機(jī)制有關(guān), 前者使得小分子藥物解離, 后者則通過抑制馬來酰亞胺交換使得ADC保持相對穩(wěn)定18。T-DM1的體外和體內(nèi)實驗結(jié)果均表明隨著時間的延長, T-DM1在血漿中高DAR值A(chǔ)DC相對豐度降低, 低DAR值A(chǔ)DC相對豐度增加, 平均DAR值降低21,36。工程化定點合成的抗MUC1

36、6 TDC在食蟹猴、大鼠和人血漿中37孵育96 h后, 其DAR2比例由初始的93%降到35%45%, DAR1由初始的7%升高到43%48%, DAR0增加到13%17%; 而在PBS緩沖液中DAR值沒有發(fā)生改變, 表明抗MUC16 TDC在血漿中存在藥物解離現(xiàn)象29。對于通過巰基鏈接的ADC, 變性條件如LC-MS 條件下, 抗體的輕鏈與重鏈分開, 此時僅能獲得分開后的輕鏈或重鏈的分子量和相對豐度, 推測得到平均DAR值21。與親和捕獲LC-MS方法不同, HIC和親和捕獲HIC是在非變性條件下完成的, 因此可以測定通過鏈間二硫鍵還原形成的ADC的完整分子量。Boswell等37利用HIC

37、研究了兩種抗STEAP1 ADC標(biāo)準(zhǔn)品的DAR值分布。親和捕獲HIC是將稀釋后的樣品用蠕動泵泵入偶聯(lián)了ECD或抗CDR抗體的小柱, 在該過程中ADC被捕獲; 隨后經(jīng)過洗滌和洗脫等過程獲得富集了ADC的樣品, 進(jìn)行HPLC檢測21,36 (圖3B。該方法與親和捕獲LC-MS方法相比, 靈敏度較低(g·mL1級別。Genentech科學(xué)家利用親和捕獲HIC方法研究某ADC (mAb B-vc-MMAE, DAR值為2和4 在體外血漿中的穩(wěn)定性, 結(jié)果顯示37孵育48 h后, 豐度最高的DAR4呈降低趨勢, 而新出現(xiàn)的DAR1和DAR3呈增加趨勢, 在后面的時間點中DAR1豐度相對較高36

38、。由于HIC與質(zhì)譜離子化不匹配, 因此逐漸趨向于利用納噴霧或中性條件下采用分子排阻色譜質(zhì)譜方法獲得鏈間二硫鍵還原形成的ADC的完整分子量38, 39。Seattle Genetics公司的科學(xué)家利用非變性分子排阻色譜(size exclusion chromatography, SEC 除鹽結(jié)合LC-MS方法測定了鏈間二硫鍵還原形成的兩種ADC的完整分子量, 該方法測試結(jié)果與HIC結(jié)果無顯著性差異, 但是該方法尚不能用于血漿/血清體系38。離子淌度質(zhì)譜(ion mobility mass spectrometry, IMMS 也被越來越多的用于DAR分布研究40,41, 如非變性MS (nat

39、ive MS 協(xié)同離子淌度(ion mobility 可以用于測定T-DM1的DAR分布和平均DAR值41。分子排阻色譜質(zhì)譜方法、離子淌度質(zhì)譜等方法目前尚未應(yīng)用于生物樣品分析, 今后與親和純化過程結(jié)合后, 有望用于血漿/血清等生物樣品分析研究。2.2 總抗體分析總抗體分析測定樣品中所有的抗體, 包括結(jié)合型的抗體(DAR1 和未結(jié)合的抗體(DAR=0, 可以用于評估ADC是否符合單克隆抗體的一般PK特性。如果總抗體分析表明ADC快速清除, 則提示ADC不能與靶標(biāo)有效結(jié)合, 不適用于后期開發(fā)?？偪贵w分析傳統(tǒng)上采用ELISA方法(圖1A。對于非臨床PK和TK實驗, 由于專屬性試劑難以獲得, 通常采用

40、通用型分析方法, 即捕獲試劑和檢測試劑均為抗人IgG的抗體。這些經(jīng)過親和純化后的試劑往往已商業(yè)化并且不會與非臨床生物基質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。如Xie等22利用山羊抗人IgG抗體作為捕獲試劑, 利用偶聯(lián)有HRP的驢抗人IgG抗體作為檢測試劑, 測定了huC242-DM1在小鼠血漿中的濃度, 其定量下限可以達(dá)到10 ng·mL1; 猴血清吸附后的抗人IgG的抗體可以用于測定猴血漿/血清中抗體的濃度, 但是不能用于測試臨床樣品42。對于臨床樣品, 一般需要用到重組抗原、抗ID (idiotype 的抗體或抗CDR的抗體作為捕獲試劑, 用抗人IgG的抗體、抗ID的抗體或抗CDR的抗體作為檢測試劑,

41、 以最大程度的減少基質(zhì)蛋白的干擾21。如Gemtuzumab ozogamicin中總抗體的測定利用CD33抗原作為捕獲試劑, 用鼠源抗人IgG4-HRP作為檢測試劑, 檢測其臨床II樣品43。T-DM1總抗體分析利用重組HER2 ECD作為捕獲試劑, 用山羊抗人IgG Fc 片段的F(ab'2-HRP偶聯(lián)物作為檢測試劑, 檢測非臨床或臨床樣品, 其定量下限為0.16 ng·mL116, 28。Hamblett等23首先采用抗cAC10的抗體來捕獲抗體cAC10, 用小鼠抗人IgG抗體偶聯(lián)HRP作為檢測試劑; 隨后類似的方法也用于小鼠血漿中抗PSMA抗體-DM1 ADC的藥動

42、學(xué)測試44。為測定小鼠中1F6- C4v2-bac (bromoacetamide caproyl, 溴乙酰胺己酰- MMAF (monomethyl auristatin F 抗體1F6-C4v2的總濃度, 采用抗1F6 ID的抗體捕獲1F6抗體, 用抗MMAF的抗體偶聯(lián)生物素/鏈霉親和素偶聯(lián)HRP作為檢測試劑45,46。為測定大鼠血漿中抗STEAP1抗體- vc-MMAE ADC中抗體的總濃度, 采用抗ID的抗體5093或驢抗人Fc的抗體作為捕獲試劑, 利用偶聯(lián)有HRP的山羊抗人IgG或Fc的抗體作為檢測試劑37。近年來出現(xiàn)了親和捕獲LC-MS/MS檢測總抗體的方法(圖2A和表3, 其融合

43、了ELISA和LC-MS/ MS的特點, 首先用捕獲試劑(如蛋白A、重組抗原、抗ID抗體等 來親和富集抗體, 酶切水解后, 利用LC-MS/MS測定專屬性肽段進(jìn)行定量分析。類似的親和捕獲LC-MS/MS方法已經(jīng)用于多種單克隆抗體藥物的定量4751。無論利用ELISA方法還是利用LC-MS/MS方法測定總抗體濃度, 均需要保證體內(nèi)各DAR值A(chǔ)DC均能被準(zhǔn)確檢測。DAR值高的ADC可能會由于小分子藥物的立體位阻效應(yīng), 影響抗體與捕獲試劑或檢測試劑的結(jié)合。Stephan等17研究了不同ELISA方法對兩種具有異質(zhì)性的ADC抗CD22抗體-MCC (succinimidyl-4-(N-maleimid

44、omethlycyclohexane-1- carboxylate, 琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷-1-羧化物-DM1和抗CD22抗體-MC (maleimido-caproyl, 馬來酰亞胺己酰-MMAF中總抗體測定的影響。實驗中平均DAR值不同的ADC分別用CD22 ECD或兔抗人IgG (Fc 抗體作為捕獲試劑, 用山羊抗人IgG (Fc-HRP或抗人IgG F(ab'2-HRP作為檢測試劑, 結(jié)果顯示抗CD22抗體-MCC-DM1除通用型人IgG (Fc ELISA形式外, 其他3種方法均對DAR 值敏感, 推測抗體上偶聯(lián)的DM1數(shù)量增加可能會影響抗體與抗原或檢測

45、試劑抗人IgG F(ab'2-HRP的結(jié)合; 但是上述4種檢測方式對于抗CD22抗體-MC- MMAF的DAR不敏感。鑒于不同ADC對不同形式的ELISA方法敏感度不一樣, 因此在方法開發(fā)階段, 可以比較未結(jié)合的抗體、純化或富集的DAR組分以及平均DAR ADC 對照品的回收率, 如果回收率的偏差在±20%之內(nèi), 則表示該方法可以用于PK樣品分析, 因為20%的差異不會顯著影響PK參數(shù)的計算21,24,30。Kozak 等52研究發(fā)現(xiàn), 與傳統(tǒng)的ELISA方法相比, 半均相(semihomogeneous assay, SHA ELISA分析對DAR值最不敏感, 各DAR值A(chǔ)

46、DC回收率偏差接近且均在20%之內(nèi)。在SHA ELISA中, 將ADC樣品添加至捕獲試劑(如生物素化的ECD、抗ID的抗體或抗人IgG 抗體 和檢測試劑(抗人IgG-HRP 的混合溶液中, 孵育一段時間后形成三明治結(jié)構(gòu), 轉(zhuǎn)移部分孵育液至鏈霉親和素或中性親和素包被的板子中, 加入底物進(jìn)行檢測; 不同分析方式的回收率分別為通用型SHA>專屬性SHA>通用型ELISA>專屬性SHA52。但是不同的ADC可能會對不同的試劑和檢測方式響應(yīng)不同, 因此需要針對具體情況選擇合適的試劑和檢測方式。2.3 結(jié)合型ADC測定測定結(jié)合型ADC有兩種方式: 測定結(jié)合型的抗體, 其DAR1; 或者測

47、定結(jié)合型的小分子藥物, 后者可以反映結(jié)合在抗體上的小分子藥物的變化情況, 與總抗體的數(shù)據(jù)相結(jié)合, 可以用于評估體內(nèi)基質(zhì)中ADC平均DAR值的變化。Genentech公司的科學(xué)家認(rèn)為在技術(shù)可行時, 優(yōu)先選擇測定結(jié)合型小分子藥物。2.3.1 結(jié)合型抗體測定結(jié)合型抗體即與小分子藥物結(jié)合的抗體, 其DAR1。與總抗體相比, 其不包含未結(jié)合抗體。結(jié)合型抗體的測定多采用ELISA方法(圖1B, 利用抗小分子藥物的抗體作為捕獲試劑, 用重組抗原、抗CDR mAb、抗人IgG抗體作為檢測試劑16,17,22,28,37,53,54。如, 在T-DM1 PK分析中, Genentech公司的科學(xué)家用鼠源抗DM1

48、的抗體作為捕獲試劑, 用重組HER2 ECD-生物素/鏈霉親和素- HRP作為檢測試劑; 該方法對平均DAR在1.904.10內(nèi)的ADC均能準(zhǔn)確檢測16, 28。Hu等55用抗DM1抗體作為捕獲試劑, 用猴血清吸附后的羊抗人IgG- HRP作為檢測試劑, 檢測獼猴血清中T-DM1的含量。Xie和Kovtun等22, 53利用鼠源抗DM1的抗體作為捕獲試劑, 用驢抗人IgG抗體-HPR作為檢測試劑, 檢測huC242-DM1。Advani等54利用兔抗卡奇霉素的多克隆抗體捕獲CMC-544 ADC, 用生物素化的CD22-Fc/鏈霉親和素-HRP作為檢測試劑。與通用型檢測試劑(如抗人IgG抗體

49、相比, 專屬性檢測試劑可以減少背景干擾, 但是有時候會低估結(jié)合型ADC濃度。如, Xu等36研究了利用工程化半胱氨酸產(chǎn)生的Tmab-MC-vc-PAB-MMAE (DAR4, Tmab重鏈和輕鏈上各有兩個MMAE在食蟹猴體內(nèi)的總抗體和結(jié)合型抗體的PK。針對結(jié)合型抗體作者考察了通用型和專屬性ELISA兩種方式, 采用抗MMAE的抗體作為捕獲試劑, 用山羊抗人IgG抗體(通用型 或HER2 ECD (專屬性 作為檢測試劑。結(jié)果顯示, 通用型ELISA檢測到的結(jié)合型抗體濃度與總抗體濃度相近, 而專屬性ELISA測得的濃度比通用型低。利用親和捕獲LC-MS對血漿樣品中的DAR 分布研究發(fā)現(xiàn), 在后期時

50、間段ADC以DAR3為主要存在形式, DAR0極少。由于DAR0代表了總抗體與結(jié)合型抗體之間的差異, 因此認(rèn)為在本研究中通用型ELISA方法測定的數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。理論上利用抗小分子藥物的抗體作為捕獲試劑的方法對DAR值不太敏感, 能夠捕獲至少連接一個小分子藥物的ADC。但是實際中, 每個抗小分子藥物抗體親和力不同, 捕獲低DAR值A(chǔ)DC的能力也不同, 有時會因為結(jié)合能力低而低估結(jié)合型抗體的濃度。Stephan等17利用抗DM1的抗體捕獲抗CD22抗體-MCC-DM1, 用生物素化CD22-ECD/鏈霉親和素-HRP或山羊抗人IgG (Fc 抗體偶聯(lián)HRP作為檢測試劑, 每種檢測方法對富集的不同D

51、AR的ADC結(jié)果相近, 推測抗DM1的抗體對抗體載藥量不敏感, 抗體上有一個DM1即可有效捕獲。與抗CD22抗體- MCC-DM1相反, 用抗MMAF的抗體捕獲抗CD22抗體-MC-MMAF后, 用生物素化CD22-ECD/鏈霉親和素-HRP或山羊抗人IgG (Fc 抗體偶聯(lián)HRP作為檢測試劑, 結(jié)果顯示每種檢測方法對富集的不同DAR 的ADC結(jié)果差異較大,推測實驗中所用抗MMAF的抗體依靠親和力來捕獲MMAF ADC, DAR低的ADC 不容易被捕獲。因此, 在方法建立時需要篩選合適的抗小分子藥物的抗體, 保證該抗體捕獲不同DAR (DAR1 結(jié)合型抗體的能力相同。目前尚未有利用親和捕獲LC

52、-MS/MS測定結(jié)合型抗體的報道, 但是從理論上來說可行。與ELISA 一樣, 首先用抗小分子藥物的抗體親和捕獲結(jié)合型抗體, 隨后經(jīng)過酶切消化后利用LC-MS/MS檢測特異性肽段(圖2和表3。無論選擇ELISA方法還是選擇親和捕獲LC-MS/MS方法, 均需要選擇合適的抗小分子藥物的抗體, 保證能夠捕獲所有DAR1的ADC, 且回收率偏差在±20%以內(nèi)24。2.3.2 結(jié)合型藥物測定與結(jié)合型抗體不同, 結(jié)合型藥物是從小分子藥物的角度去衡量結(jié)合型ADC, 用于測定所有結(jié)合在抗體上的小分子藥物的總濃度。這項分析能夠直接提供抗體載藥量的信息, 并對抗體載藥量的變化高度敏感。結(jié)合型藥物的測定

53、可以選用ELISA方法, 也可以采用親和捕獲LC-MS/MS方法。ELISA方法測定結(jié)合型藥物, 捕獲試劑與檢測試劑的選用恰好與結(jié)合型抗體ELISA方法相反: 結(jié)合型藥物分析中選用抗ID抗體、抗原ECD或抗人IgG 抗體捕獲ADC中的抗體部分, 用抗小分子藥物的抗體作為檢測試劑(圖1C14,17,45,56,57。Tolcher等56利用抗huC242抗體作為捕獲試劑捕獲huC242-DM1, 用生物素化抗DM1抗體/鏈霉親和素-HRP檢測huC242-DM1。Stephan等17用不同的捕獲試劑如CD22 ECD、山羊抗人IgG (Fc 或F(ab'2捕獲抗CD22抗體-MCC-DM

54、1或抗CD22抗體-MC-MMAF, 分別用抗DM1或抗MMAF的抗體進(jìn)行檢測, 研究發(fā)現(xiàn)信號與ADC中載藥量呈正比。Sanderson等57用抗ID cAC10抗體作為捕獲試劑, 用抗MMAE抗體作為檢測試劑, 評價不同DAR值抗CD30 ADC的穩(wěn)定性, 研究結(jié)果表明DAR2 ADC的信號比DAR4 ADC 信號低。親和捕獲LC-MS/MS方法中首先需要用捕獲試劑(如蛋白A、抗ID抗體、抗原等 捕獲結(jié)合型ADC, 隨后切除連接臂, 進(jìn)行LC-MS/MS分析(圖2和表321,58。因為實驗中需要切除連接臂, 因此該方法只適用于連接臂可通過酶切除或化學(xué)切除的ADC, 不適用于連接臂不可切除的A

55、DC, 如T-DM121,28。利用通用型試劑如蛋白A、蛋白酶等, 可以快速比較相同連接臂不同抗體組成的ADC21。Genentech公司的科學(xué)家報道了一例利用親和捕獲LC-MS/MS方法測定抗STEAP1 ADC中結(jié)合型小分子藥物的案例, 數(shù)據(jù)顯示在食蟹猴血漿中孵育96 h后結(jié)合型藥物降低30%, 該結(jié)果與DAR分布變化相一致21。與總抗體和結(jié)合型抗體分析類似, 結(jié)合型小分子藥物分析方法的建立也需要考慮試劑和分析形式對DAR的敏感性, 保證小分子藥物被準(zhǔn)確測定24。2.4 游離小分子藥物測定游離小分子藥物是從抗體中解離下來的藥物部分。游離小分子藥物的測定可以采用競爭性ELISA方法(圖1D2

56、2, 43, 53, 54, 56, 57和LC-MS/MS方法18, 25, 28, 37, 45, 58, 59。競爭性ELISA方法可以用BSA-小分子藥物包被板子53, 56, 也可以用抗小分子藥物抗體包被板子57。以游離DM1的測定為例, 樣品首先利用乙腈沉淀去除蛋白, 含有游離DM1的上清液與生物素化鼠源抗DM1抗體混合, 隨后轉(zhuǎn)移至包被有BSA-DM1的板子中, 樣品中DM1會與包被的BSA-DM1競爭性結(jié)合抗DM1抗體, 樣品中DM1濃度越高, BSA-DM1結(jié)合的DM1抗體越少, 最后通過檢測試劑鏈霉親和素-HRP檢測得到的信號越低53。Sanderson等57測定了cAC1

57、0-Val (valine, 纈氨酸-Cit (citrulline, 瓜氨酸-MMAE體內(nèi)樣品在組織蛋白酶B作用下水解得到的游離MMAE的濃度, 水解樣品與HRP-MMAE 混合后, 轉(zhuǎn)移至包被有抗MMAE抗體的96孔板, 樣品中游離MMAE濃度與檢測信號呈反比。ADC中抗體部分的分解代謝一般不涉及CYP450酶, 但是小分子藥物可能會在CYP450酶作用下產(chǎn)生代謝物。與ELISA方法相比, LC-MS/MS方法在檢測小分子藥物的同時, 可以監(jiān)測代謝物的產(chǎn)生并對其定量。Boswell等37利用LC-MS/MS方法研究了抗STEAP1抗體-vc-MMAE(ADC和巰基-抗STEAP1抗體-vc

58、-MMAE (TDC在大鼠體內(nèi)游離MMAE的濃度, 樣品采用蛋白沉淀方法, 內(nèi)標(biāo)選用MMAF, 結(jié)果表明ADC中游離MMAE的濃度比TDC高, 可以合理解釋盡管兩者總抗體結(jié)果相似, 但是ADC結(jié)合型抗體濃度比TDC結(jié)合型抗體濃度低的現(xiàn)象。LC-MS/MS 樣品預(yù)處理過程可以采用蛋白沉淀和/或固相萃取(SPE方法, 隨后進(jìn)行LC-MS/MS分析。有時根據(jù)待測物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)添加合適的樣品預(yù)處理步驟, 有助于準(zhǔn)確定量分析。例如, T-DM1結(jié)構(gòu)中DM1解離后含有游離巰基, 巰基可能會與自身或基質(zhì)中含巰基的谷胱甘肽、白蛋白等結(jié)合形成二硫鍵, 影響檢測分析。在DM1的樣品預(yù)處理過程中, 首先采用3-(2-羧乙基 膦還原樣品中的二硫鍵, 隨后用乙腈沉淀蛋白, 為防止自身產(chǎn)生二聚體, 取上清液用N-乙基馬來酰亞胺衍生化, 衍生化樣品進(jìn)行SPE后即可進(jìn)行LC-MS/MS分析28。實驗中發(fā)現(xiàn)DM1的濃度在第一個給藥時間點濃度最高, 與理論曲線不同, 推測可能是在還原過程中T-DM1中少量通過半胱氨酸殘基或氧化硫醚連接的DM1從抗體部分解離, 高估了樣品中游離DM1的濃度28。近期Genentech公司的科學(xué)家用離子排阻色譜協(xié)同反相HP