腎寧水丸治療系膜增生性腎小球腎炎的實驗研究(一)

1、腎寧水丸治療系膜增生性腎小球腎炎的實驗研究(一)    作者：李宏偉 張春戩 萬喜超 王鐵良【摘要】 目的 探討腎寧水丸治療系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）的作用機(jī)制。方法 通過建立牛血清白蛋白(BSA)所致MsPGN動物模型，運用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡及原位雜交技術(shù)等檢測手段，全面深入地探討了腎寧水丸治療MsPGN的作用機(jī)理。 結(jié)果 （1）MsPGN動物模型復(fù)制成功，光鏡、電鏡下病理檢測類似人類MsPGN的病理變化；（2）腎寧水丸具有顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞（MC）增生、系膜基質(zhì)（MM）增多的作用；（3）腎寧水丸有顯著減少免疫復(fù)合物在腎小球系膜和基底膜

2、（GBM）沉積的作用；（4）腎寧水丸可誘導(dǎo)MC凋亡。結(jié)論 腎寧水丸能夠通過多途徑綜合作用機(jī)制起到抑制腎小球MC增生、MM增多的作用，并且可能參與MC的凋亡過程，是一個標(biāo)本兼治非常有前途的中醫(yī)藥復(fù)方制劑。 【關(guān)鍵詞】 腎寧水丸；系膜增生性腎小球腎炎；細(xì)胞凋亡；實驗研究【Abstract】 Objective To explore the functional mechanism of cure of mesangial prolifertive glomerulonephritis （MsPGN） with shenning pill.Methods Through establishing t

3、he animal model of MsPGN caused by bulls serum albumin and using the test means of optic microscope, electron microscope, biochemistry etc, the functional mechanism of cure of MsPGN with shenning pill is fully presented in depth. Results (1) The animal model of MsPGN has been reproduced successfully

4、 and the pathologic changes of the animal model similar to that of man kind is seen through optic microscope and electron microscope;(2)Shenning pill can inhibit obviously the hyperplastic of mesangium cell and the increasement of cellular stroma;(3)Shenning pill can induce MC apoptosis. Conclusion

5、Shenning pill can inhibit obviously the hyperplastic of mesangium cell and the increasement of capsule stroma can treat MsPGN by causes and symptoms and will be a prcspective Chinese medicine pharmaceutics.【Key words】 shenning pill；mesangial prolifertive glomerulonephritis；apoptosis；experimental stu

6、dy系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）是我國常見的原發(fā)性腎小球疾病，該型腎炎約占成人原發(fā)性腎小球疾病腎活檢病例的24.7%30.3%，是導(dǎo)致腎小球硬化等終末期腎病的主要因素之一1。MsPGN的發(fā)病機(jī)制仍然以免疫學(xué)說為主導(dǎo)，確切發(fā)病機(jī)制不明確，分子生物學(xué)、遺傳基因?qū)W領(lǐng)域的研究仍處在初級階段，對于該病無特異性的治療藥物。 本實驗旨在闡明腎寧水丸治療MsPGN的作用機(jī)制，為腎寧水丸進(jìn)一步深入研究、審批新藥，提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 普通級雄性Wistar大鼠60只，體重（200±20）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。腎寧水丸由黑龍江省中醫(yī)研究院制劑中心提供；雷公藤多甙

7、片由湖南協(xié)力藥業(yè)生產(chǎn)；牛血清白蛋白（BSA）、完全氟氏佐劑（FCA）為美國Sigma公司產(chǎn)品；大腸桿菌內(nèi)毒素由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物實驗室提供；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（POD法）為美國寶靈曼公司產(chǎn)品。JEM1220透射電子顯微鏡，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。1.2 方法2 結(jié)果2.1 動物存活情況 第21天模型對照組大鼠有1只死亡（死因不明，疑為腹腔注射時感染），第22天尾靜脈注射時模型對照組、高、中劑量組各有1只死亡，低劑量組有2只死亡（5只均死于急性變態(tài)反應(yīng)）。實驗第40天后大鼠出現(xiàn)活動差，皮毛無光澤，足腫脹明顯，飲食無明顯減少。2.2 腎寧水丸對大鼠腎臟病理改變的影響模型對照組：腎小球MC增生（&g

8、t;4個/系膜區(qū)），MM中度增生，毛細(xì)血管壁增厚、局灶性纖維素樣壞死，小動脈壁透明樣變性。高劑量組：MC不增多，MM輕度增生（系膜區(qū)寬度不超過毛細(xì)血管腔），毛細(xì)血管壁無增厚，腎小管上皮部分顆粒樣變性，腎間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤及纖維化。中劑量組：腎小球MC及MM輕度增多，小管上皮可見玻璃樣變性（細(xì)胞核周圍疏松）、顆粒狀變性。低劑量組：腎小球MC增多，MM輕中度增生，毛細(xì)血管壁增厚，腔內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，小管損傷嚴(yán)重，以近曲小管尤為明顯。 陽性藥物組：個別腎小球MC增多，MM無增生，毛細(xì)血管壁局灶性纖維素樣壞死。表1 各組大鼠MC、MM增生情況 注：與空白對照組比較P0.05，與模型對照組比較P0.05、P

9、0.05，與陽性對照組比較P0.05從表1可以看出造模第70天模型對照組較空白對照組MC及MM增生顯著（P0.05），提示造模成功；治療后高劑量組、陽性對照組與模型對照組比較病理改變顯著減輕（P0.05），而中、低劑量組與模型對照組比較病理改變差異無顯著性（P0.05）；高劑量組與陽性對照組在抑制MC、MM增生方面差異無顯著性（P0.05）。高劑量組：系膜區(qū)及GBM結(jié)構(gòu)完好，未見電子致密物沉積，毛細(xì)血管壁未增厚，靜脈腔內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤。中、低劑量組：系膜區(qū)可見大量電子致密物沉積，毛細(xì)血管腔內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤，小管上皮損傷嚴(yán)重且可見大量溶酶體。陽性藥物組：系膜區(qū)輕度增生，可見少量電子致密物沉積，小

10、管上皮可見少量溶酶體核。2.3 細(xì)胞凋亡檢出情況 見表2。表2 腎寧水丸對細(xì)胞凋亡的影響注：與模型對照組比較P0.05，與陽性對照組比較P0.05，與高劑量組比較P0.05原位末端標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：空白對照組與模型對照組大鼠MC凋亡陽性表達(dá)極少，僅腎小管上皮細(xì)胞少量表達(dá)；高劑量組與陽性藥物組細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)較多，與模型對照組比較差異有顯著性（P0.05），表達(dá)主要表現(xiàn)在系膜區(qū)，在腎小管內(nèi)也可見少量陽性表達(dá)；高劑量組與陽性藥物組比較差異無顯著性；中、低劑量組凋亡細(xì)胞陽性檢出率較少，與高劑量組相比差異有顯著性。3 討論3.1 腎寧水丸抑制MC、MM增生的機(jī)制 本實驗表明腎寧水丸能減輕Ms

11、PGN大鼠病變程度，從而延緩腎小球硬化過程，總結(jié)其作用機(jī)制，可能為：（1）調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力，減輕免疫復(fù)合物對腎小球的直接損傷，降低腎小球濾過膜的通透性。有報道黃芪可顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫，減少尿中蛋白的排出，增強(qiáng)代謝功能，黨參可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)免疫功能6。（2）通過抗凝手段，抑制MC增生和MM分泌，緩解腎小球纖維化、硬化的發(fā)生。凝血機(jī)制紊亂在增生性腎小球腎炎中廣泛存在，腎寧水丸中起活血化瘀作用的主要為水蛭、益母草。水蛭其主要有效成分為水蛭素，有報道用水蛭素進(jìn)行抗凝治療MsPGN，不僅能夠防治微循環(huán)血栓并發(fā)癥，而且可能具有間接的抗增殖和抗炎作用，并可作為特異性凝血酶阻斷劑阻滯凝血酶對MC I

12、CAM-1 mRNA的上調(diào)作用7?，F(xiàn)代藥理研究證明益母草具有明顯的抗血栓形式作用及溶栓作用。大鼠口服益母草水煎液（相當(dāng)生藥1520g/只）能產(chǎn)生較強(qiáng)的抗血栓形成作用，使血栓形成時間延長、尺度縮短、重量減輕，同時外周血小板計數(shù)減少，聚集功能減弱。3.2 腎寧水丸誘導(dǎo)MC凋亡機(jī)制的探討 細(xì)胞凋亡理論在增殖性腎炎中的應(yīng)用是近幾年才興起的，對于藥物誘導(dǎo)MC凋亡的研究多集中在激素、免疫抑制劑方面。通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，腎寧水丸能誘導(dǎo)MC凋亡，究其原因可能是雙向調(diào)節(jié)免疫之黨參、黃芪共同作用的結(jié)果。同時通過本實驗推測水蛭素可能具有間接的抗炎和抗增殖作用，但水蛭素作為一種新型抗凝劑是否可直接誘導(dǎo)MC凋亡尚待進(jìn)一步證實。3.3 腎寧水丸的組方及配伍意義 腎寧水丸是導(dǎo)師王鐵良教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗制成的經(jīng)驗方，方由黃芪、黨參、寸冬、茯苓、黃芩、車前子、坤草、水蛭、甘草等組成，主治氣陰兩虛兼夾濕熱瘀血證。腎寧水丸重用黨參、黃芪，其中黨參味甘性平且守而不走，補(bǔ)氣兼能益陰；黃芪味甘性溫且走而不守，性善益氣升提，二藥共奏益氣固腎之功而為君藥。茯苓補(bǔ)脾益氣兼能利水滲濕可助黨參、黃芪益氣之功，使益氣而不斂邪；麥冬滋陰清熱除煩，二者共為臣藥。車前子清熱利濕性趨于下，黃芩善清上焦?jié)駸幔咝闲瓜率節(jié)駸嶂氨M去；水蛭辛、咸、平，入血分，為破血逐瘀之佳品，可入絡(luò)搜血，益母草