腫瘤相關(guān)抗原LEA與CEA在大腸癌表達的對比研究

1、    腫瘤相關(guān)抗原LEA與CEA在大腸癌表達的對比研究        摘要目的：探討LEA對大腸癌的診斷價值。方法：用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測117例大腸癌組織和99例大腸非癌病變組織LEA(LargeExternalAntigen)與CEA的表達狀況。結(jié)果：LEA在組織學(xué)上診斷大腸癌的靈敏度為86.3，特異度為53.5，與CEA相比，靈敏度與CEA相似（P>0.05），特異度要強于CEA(P<0.05)。兩種抗原聯(lián)合應(yīng)用并不比LEA單獨應(yīng)用的診斷價值高。

2、LEA與CEA在大腸癌和大腸腺瘤中的表達明顯正相關(guān)（P<0.05），而在非腺瘤息肉和正常粘膜中，兩者不相關(guān)0.05）。結(jié)論：LEA在大腸癌的診斷上有一定的實用價值。 關(guān)鍵詞腫瘤相關(guān)抗原大腸癌診斷 Comparative Study of Tumor-associated Antigen LEA and CEA Expression in Colorectal Cancer Mo Zhicheng Song Jindan Key Laboratory of Cell Biology of Ministry of Public Health of China, Institute of Me

3、dical Molecular Biology,China Medical University,Shenyang Abstract The expression of large external antigen(LEA) and carcinoembryonic antigen(CEA) in 117 colorectal cancer specimens and 99 non-cancerous tissue specimens were studied by immunohisto-chemical method to assess their diagnostic value in

4、colorectal cancer.The results showed that the sensitivi-ty of LEA was 86.3 and specificity 53.5.As compared to CEA,LEA showed a similar sensitivity but higher specificity.The combination of LEA and CEA did not offer any further advantage than LEA alone.A statistically  significant positive corr

5、elation was found between the expression of LEA and CEA in colorectal cancer and adenoma(P<0.05),but not in nonadenomatous polyp and normal mucosa(P<0.05).The results suggest that LEA probably has practical value in diagnosis of colorectal cancer.Key Words Tumor-associ atedantigen Colorectal c

6、ancer Diagnosis 我國大腸癌發(fā)病率和死亡率逐年上升，在各種惡性腫瘤中，大腸癌的發(fā)病率已上升至第四位，嚴(yán)重危害了人民的生命健康。早期診斷早期治療是提高大腸癌生存率，降低死亡率的關(guān)鍵，因此，尋找特異性好，靈敏度高的腫瘤相關(guān)抗原是臨床亟待解決的課題之一。Gold等在1965年首次在胎兒和人大腸癌中發(fā)現(xiàn)CEA1以后大量的研究表明，許多人體其他組織的腫瘤也不同程度的顯示CEA陽性，因其在大腸癌中表達最強最常見，被公認(rèn)為是大腸癌的表面標(biāo)志。由于CEA缺乏特異性，患者血清CEA水平增高并不能完全作為惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志。 以CEA為靶抗原進行的單克隆抗體在腫瘤診斷和治療中應(yīng)用的研究開展的最早

7、也最深入。本研究應(yīng)用本室研制的抗結(jié)腸癌單克隆抗體ND1與抗CEA單抗在大腸癌及大腸非癌組織中的標(biāo)記情況作了比較，探討與ND1單抗特異結(jié)合的腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原LEA對大腸癌的診斷價值。 1材料與方法 1.1一般資料 中國醫(yī)科大學(xué)附屬二院普外科大腸癌患者手術(shù)標(biāo)本及結(jié)直腸鏡活檢標(biāo)本共216例，其中大腸癌117例按“全國大腸癌病理學(xué)研究統(tǒng)一規(guī)范”的組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。依細(xì)胞分化程度分為高分化癌54例，中分化癌57例，低分化癌6例。大腸非癌組織99例，其中大腸腺瘤48例，非腺瘤性息肉26例，正常大腸粘膜25例。病理診斷明確，經(jīng)10中性福爾馬林固定，石蠟包埋。 1.2ND1單抗的制備與純化2 按常規(guī)方法向純系B

8、alb/c鼠腹腔中注射本室研究成功的雜交瘤細(xì)胞（IC2）制備腹水。向收集的腹水中加CaCl2至1mmol/L的終濃度，室溫下靜置2小時后放入4冰箱，過夜，除去纖維蛋白塊，10000g，4離心30分鐘，去上層脂質(zhì)，中層上清用0.01mol/LPBS(pH6.8)透析過夜，次日經(jīng)0.22m濾器濾過后，裝入MAPSHPHT柱（30mm×4.6mm）純化，純化后的抗體放入10冰箱備用。 1.3免疫組織化學(xué)染色 全部標(biāo)本作連續(xù)切片，每個標(biāo)本兩張，分別對標(biāo)本進行LEA與CEA免疫組化染色（CEA單抗為美國ZYMED公司產(chǎn)品，SP試劑盒購于福州邁新公司）。DAB顯色，蘇木素襯染。用已知ND1染色陽

9、性的標(biāo)本作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，其他步驟不變。 1.4結(jié)果判定 有棕黃色顆粒反應(yīng)，出現(xiàn)在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，腺腔及細(xì)胞外粘液中均為陽性反應(yīng)，陽性細(xì)胞數(shù)占視野10以上為有意義。細(xì)胞不著色或細(xì)胞與背景一致著色為陰性。 1.5統(tǒng)計學(xué)分析 分別計算LEA、CEA及兩者聯(lián)合應(yīng)用在診斷大腸癌中的靈敏度、特異度、預(yù)測值、準(zhǔn)確度、似然比，并對兩者相關(guān)性進行2檢驗，其中，在比較兩者的靈敏度與特異度的差異中采用加權(quán)2檢驗法。 2結(jié)果 2.1LEA與CEA在大腸癌中的染色結(jié)果 LEA與CEA在大腸癌組織內(nèi)表達呈明顯異質(zhì)性，陽性部位相似，主要分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、腺腔分泌物及細(xì)胞外粘液中（1）。CEA在高

10、、中、低分化癌中表達的陽性率分別為94.4，85.9，66.7。而LEA對高分化癌表現(xiàn)出更強選擇性，其在高、中、低分化大腸癌的陽性率分別為100，78.9，33.3。但兩者在大腸癌中表達的總陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異（2=1.13P>0.05，見表1）。 1LEA在大腸癌中的強陽性表達SP法×400 表1LEA與CEA在大腸癌的表達 類型例數(shù) LEACEA 陽性陽性比()陽性) 陽性比(高分化癌54541005194.4中分化癌574578.94985.9低分化癌6233.3466.7總計11710186.310488.92.2LEA與CEA在大腸非癌組織中的表達 LEA在大腸腺瘤中的

11、分布多表現(xiàn)為腺腔游離緣細(xì)胞膜棕黃色線條樣染色，部分重度異型增生腺體與癌組織染色方式相同（2）。在非腺瘤性息肉及正常粘膜中，LEA多在細(xì)胞膜表面表達，陽性面積要小得多，呈局灶性反應(yīng)（3）。與CEA相比，LEA在非癌組織中表達的陽性率較低（2=3.91,P<0.05，見表2）。2LEA在大腸腺瘤(重度不典型增生)中的陽性表達 SP法×200 3LEA在正常大腸粘膜中的弱陽性表達SP法×200 表2LEA與CEA在大腸非癌病變中的表達 類型例數(shù) LEACEA 陽性陽性比() 陽性陽性比()大腸腺瘤483777.13879.2炎性息肉26623.1934.6正常粘膜25312

12、.01144.0總計994646.55858.52.3LEA、CEA及兩者聯(lián)合應(yīng)用在診斷大腸癌中的價值 LEA的靈敏度與CEA相似，特異度高于CEA，兩者聯(lián)合應(yīng)用診斷的靈敏度，特異度變化不大（見表3）。 表3LEA、CEA及兩者聯(lián)合應(yīng)用在診斷大腸癌中的價值 分析參數(shù) LEACEALEA與CEA聯(lián)合應(yīng)用平行實驗系列實驗靈敏度()86.388.995.579.5特異度()53.541.538.456.5預(yù)測值()陽性68.764.264.768.4陰性68.775.988.470.0準(zhǔn)確度()71.367.169.468.9似然比()陽性1.8陰性0.260.270.120.36

13、2.4LEA與CEA的相關(guān)性 LEA與CEA在大腸癌中表達有非常顯著的相關(guān)性（2=7.37,P<0.01），在大腸腺瘤中兩者相關(guān)性亦很明顯（2=6.26,P<0.05）；在非腺瘤性息肉與大腸正常粘膜中，LEA與CEA表達相關(guān)性不顯著（2=1.23,P>0.05）。 3討論 LEA是能與ND1單抗特異結(jié)合新發(fā)現(xiàn)的大分子量（>500KD）的表面可溶性腫瘤相關(guān)抗原，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，并可分泌到細(xì)胞外，是一種與CEA不同的糖蛋白3,4，利用免疫電鏡技術(shù)在培養(yǎng)細(xì)胞表面觀察到這一糖蛋白大分子的抗原決定簇在其糖鏈部分上5，近年來研究表明：LEA對大腸癌特別是對高分化大腸癌是較特異的腫瘤相

14、關(guān)抗原6。但LEA在大腸癌的診斷價值及其與CEA的比較，國內(nèi)尚未見報道。本文研究結(jié)果表明，LEA與CEA相似，是高分化大腸癌相關(guān)抗原，而且比CEA似有更好的選擇性，在高分化大腸癌表達的陽性率高達100。但總體看，兩者在大腸癌表達的陽性率大致相同。 LEA與CEA均是來源于內(nèi)胚層的腫瘤相關(guān)抗原，與大腸非癌病變及正常粘膜均存在交叉反應(yīng)，尤其是在大腸腺瘤中，兩種抗原均有較高的表達，提示在腺瘤和癌組織中含有共同的腫瘤相關(guān)抗原，有文獻報道，對于LEA的檢測，可能有助于判斷腺瘤的惡變傾向7。在非腺瘤性息肉與大腸正常粘膜中，LEA的表達陽性率則低于CEA，差異顯著。在組織學(xué)檢測中初步證明，LEA的特異度略強

15、于CEA。 在聯(lián)合應(yīng)用診斷實驗中，除了在平行實驗中的陰性預(yù)測值提高較多外，其它參數(shù)較LEA單獨應(yīng)用并無明顯提高，甚至有所下降。所以兩種抗原的聯(lián)合應(yīng)用并不能提高診斷價值，這主要是由于LEA與CEA在大腸癌與大腸腺瘤中表達的正相關(guān)引起的。 以前的研究發(fā)現(xiàn)：在一些內(nèi)胚層來源的非大腸癌組織中，ND1單抗標(biāo)記的陽性率要明顯低于大腸癌組織6。宋今丹等的研究發(fā)現(xiàn)，131I標(biāo)記的ND1單抗在體外及裸鼠體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞均有較好的特異性8。本文在大腸來源的癌組織與非癌組織中探討了LEA在診斷大腸癌的靈敏度與特異度，初步結(jié)果表明，在組織學(xué)診斷中，LEA的靈敏度與CEA相似，特異度強于CEA。這個結(jié)果提示，LEA可能

16、是一種很有潛力的腫瘤標(biāo)志物。目前，LEA的血清學(xué)檢測方法已經(jīng)建立9，血清學(xué)診斷的研究正在進行之中，我們相信，腫瘤相關(guān)抗原LEA在大腸癌的診斷和治療上將有較好的應(yīng)用價值。本文課題為國家科技部中試開發(fā)項目  作者單位：中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究所衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點實驗室（沈陽市110001） 參考文獻 1Gold P,Freedman SO.Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system.J Exp Med,1965;122(3):467 2方謹(jǐn),宋今丹.高壓液相色譜法純化人大腸癌單克隆抗體.中國醫(yī)科

17、大學(xué)學(xué)報,1997;26(5):453 3Bleday R,Song JD,Walker ES,et al.Characterization of a new monoclonal antibody to a   cell surface antigen on colorectal cancer and fetal gut tissues.Cancer,1986;57(3):433 4Song JD,Bleday R,Chen LB,et al.Monoclonal antibody re-conizing a cell surface antigen on human colorectal cancer.Int Cell Biol,1988;225 5王明武,宋今丹.結(jié)腸相關(guān)抗原LEA分布的免疫電鏡和免疫光鏡研究.電子顯微學(xué)