SOP-CSDS-PAGE凝膠電泳標準操作規(guī)程

1、文件名稱SDS-PAGE!膠電泳標準操作規(guī)程文件編號生效日期有效期至審批及頒發(fā):部門簽名日期起草質(zhì)量部審核質(zhì)量部批準質(zhì)量受權(quán)人頒發(fā)質(zhì)量部會審:部門簽名日期部門簽名日期分發(fā):Copy-1Copy-2Copy-3Copy-4Copy-5Copy-6Copy-7Copy-8Copy-9Copy-10Copy-11Copy-12Copy-13Copy-14Copy-15文件名稱SDS-PAGIE!膠電泳標準操作規(guī)程文件編號生效日期有效期至、目的建立重組人生長激素電泳檢查標準操作規(guī)程，使中間產(chǎn)品檢驗有據(jù)可依二、范圍適用于本公司中間產(chǎn)品“重組人生長激素”的電泳檢查。三、職責1質(zhì)量部負責制定本規(guī)程。2 QC

2、人員負責按照本操作規(guī)程的規(guī)定操作，并做好記錄。3 QC室主任負責監(jiān)督QC人員按照本規(guī)程的規(guī)定操作實施。四、術(shù)語無五、內(nèi)容1儀器、設(shè)備恒壓電源、垂直板泳槽和制膠模具2試齊1J2.1 檢查所需試劑是否在有效期內(nèi)，未準備好的及時配制，缺少的試劑及時申購。2.2 所需試劑有：2.2.1 水：電阻率應不低于18.2MQ.cm。2.2.2 A 液：（1.5mol/L三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）稱取18.15g三羥基氨基甲烷，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至8.8,加水稀釋至100ml。2.2.3 B 液：30%5烯酰胺-0.8%N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺溶液（避光保存）。2.2.4 C 液：1%二

3、烷基磺酸鈉溶液。2.2.5 D 液：10%3甲基乙二胺溶液。2.2.6 E 液：10%±硫酸俊，臨用前配置。2.2.7 F 液：（0.5mol/L三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）稱取6.05g三羥基氨基甲烷加適量水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至6.8,加水稀釋至100ml。文件名稱SDS-PAG斑膠電泳標準操作規(guī)程文件編號生效日期有效期至2.2.8電極緩沖液：稱取3g三羥基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸鈉，加適量水溶解，用鹽酸調(diào)PH值至8.3,加水稀釋至1000ml。2.2.9 供試品緩沖液：稱取0.303g三羥基氨基甲烷，0.189ml鹽酸，4ml甘油，2mg澳酚藍, 0.8g十

4、二烷基磺酸鈉，加水溶解并稀釋至 10ml,此溶液用于非還原 SDS-PAGE如用于還原 SDS-PAGE則再加2ml B-琉基乙醇。2.2.10 固定液：取量250ml乙醇,60ml冰醋酸，加水稀釋至500ml。2.2.11 考馬斯亮藍染色液：稱取1g考馬斯亮藍陶0,加乙醇200ml,冰醋酸50ml,加水至 500ml,混勻。2.2.12 考馬斯亮藍脫色液：取乙醇 400ml、冰醋酸100ml,加水至1000 ml,充分混合。2.2.13 考馬斯亮藍保存液：取冰醋酸 75ml,加水至1000ml,搖勻。 3方法3.1 原理大多數(shù)蛋白質(zhì)與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS按重量比結(jié)合成復合物

5、，使蛋白質(zhì) 分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應， 使蛋白質(zhì)按分子大小分離。3.2 凝膠的制備凝膠不恢分離膠濃縮膠凝膠濃度5. 0%7. 5%10. 0%12. 5%15. 0%17. 5%4. 5%試液/mlA液4. 04. 04. 04. 04. 04. 0B液2. 74. 05. 46. 78. 09. 41. 35C液1. 61. 61. 61. 61. 61. 60. 9D液0. 10. 10. 10. 10. 10. 10. 07E液0. 10. 10. 10. 10. 10. 10. 07F液2. 25H2O7. 36. 04. 883.

6、 32. 880. 884. 33文件名稱SDS-PAGE!膠電泳標準操作規(guī)程文件編號生效日期有效期至1.1.1 制備分離膠溶液按上表15%或12.5%制成分離膠溶液，灌入模具內(nèi)至一定高度，加水封頂，室溫下聚合（室溫不同，聚合時間不同）。1.1.2 制備濃縮膠溶液：待分離膠溶液聚合后，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠（配方見上表），插入樣品梳，注意避免氣泡出現(xiàn)。1.1.3 凝膠保存凝膠應在室溫條件下聚合，可在室溫或 2-8 C冰箱保存一周，如遇膠體失水嚴重，應重新配 制。3.3 樣品處理3.3.1 發(fā)酵液：取發(fā)酵液1.5ml于1.5ml離心管中，10000rpm/min離心10min,棄去上

7、清，留沉淀，再加入 1ml 10mmol T.E ,充分混勻，將其稀釋3倍（1倍樣品加2倍水），取樣20ul與還原樣品緩 沖液20ul置于0.5ml離心管中，混勻，置沸水浴中煮10min到15min后與對照品于同一塊膠 上樣。3.3.2 中間產(chǎn)品：3.3.2.1 DEAE I :將上樣液和下樣液放在同一塊膠上，根據(jù)紫外測定濃度結(jié)果，各上樣量均為40ug,加入非還原緩沖液20ul ,混勻，置沸水浴中煮5 min到8 min后上樣。3.3.2.2 phenyl : 將上樣液、穿液和下樣液放在同一塊膠上，根據(jù)紫外測定濃度結(jié)果，各 上樣量均為40ug,加入非還原緩沖液20ul ,混勻，置沸水浴中煮5

8、min到8 min后上樣。3.3.2.3 S-100 :將上樣液和下樣液放在同一塊膠上，根據(jù)紫外測定濃度結(jié)果，各上樣量均為80ug,加入非還原緩沖液20ul ,混勻，置沸水浴中煮5 min到8 min后上樣。3.3.2.4 DEAE H:將下樣液放在同一塊膠上，根據(jù)紫外測定濃度結(jié)果，各上樣量均為80ug, 加入非還原緩沖液20ul ,混勻，置沸水浴中煮5 min到8 min后上樣。3.3.3 篩種實驗取發(fā)酵菌液1.5ml于1.5ml離心管中，10000rpm/min,離心10min,棄去上清，再加入1ml 10mmolT.E ,充分混勻，取樣20ul與還原緩沖液20ul置于0.5ml離心管中，

9、混勻，置沸水浴中煮 10min到15min后與對照品于同一塊膠上樣。文件名稱SDS-PAGE!膠電泳標準操作規(guī)程文件編號生效日期有效期至3.4 上樣取出已配好的凝膠板，夾于電泳裝置相應的位置上，取出樣品梳，把畫有樣品槽性狀的透明 塑料片較切合地貼于凝膠板上，將電極緩沖液注滿電泳槽前后槽，在供試品孔中加入樣品， 標注好各樣品位置。3.5 電泳把電泳裝置和電泳儀正確連接，冷凝水管與飲用水口連接，直至電泳結(jié)束。3.5.1 中間產(chǎn)品電泳：調(diào)電壓150V,開始電泳，待藍色條帶泳動到底部時停止電泳。3.5.2 菌體電泳：調(diào)電壓150V,開始電泳，待藍色條帶約泳動到濃縮膠與分離膠交接處時， 調(diào)電壓200V繼

10、續(xù)電泳，等藍色條帶到底部時停止電泳。3.6 凝膠處理3.6.1 固定：電泳完畢，取出膠片，置固定液中30分鐘。3.6.2 染色：從固定液中取出膠片，置染色液中約 1.5小時。3.6.3 脫色：用脫色液脫色至凝膠背景透明。3.6.4 保存：脫色完畢后，凝膠保存在保存液中。3.6.5 結(jié)果處理：待凝膠在保存液中完全透明后可使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行拍照，轉(zhuǎn)換成電子數(shù)據(jù)后再進行進一步處理。3.6.6 永久保存：亦可制成干膠永久保存。六、附錄無七、相關(guān)文件重組人生長激素中間產(chǎn)品質(zhì)量標準重組人生長激素中間產(chǎn)品檢驗標準操作規(guī)程«電泳試驗記錄八、參考文件中國藥典2010年版二部文件名稱SDS-PAGE!膠電泳標準操作規(guī)程