RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展

1、醫(yī)藥生物技術(shù)RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展徐俊 毛穎 苗荻 郝佳國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心【摘 要】RNA干擾是一種由雙鏈RNA引發(fā)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默,它是沉默目的基因表達(dá)的一種有效手段。本文就RNA干擾相關(guān)的分子機(jī)制和特點(diǎn),其制備方法,以及目前RNA干擾在生物技術(shù)中的應(yīng)用情況作一綜述。Abstract: RNA interference is a sequence-specific post-transcriptional gene silencing induced by introduction of double stranded RNA. It is a power

2、ful tool to silent target gene expressions. The following page is a review of the recent studies on the molecular mechanisms and characteristics of RNAi,the production methods,as well as the effects and applications in biological technologies.RNA干擾(RNA interference,RNAi是生命科學(xué)研究中的一項(xiàng)不可替代的強(qiáng)有力的研究手段,在哺乳動(dòng)物

3、細(xì)胞中沉默目標(biāo)基因用以研究基因和蛋白質(zhì)的功能,而且在人類疾病病理學(xué)的研究中具有重要的地位。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,生命科學(xué)的研究進(jìn)入到后基因組學(xué)的階段。在這個(gè)階段,研究者們急切的需要一些能夠適用于高通量和基因組規(guī)模的RNA干擾文庫的構(gòu)建手段來研究基因和蛋白質(zhì)的功能及相互作用,本文對(duì)RNAi載體構(gòu)建的最新研究進(jìn)展作一綜述。1 RNAi的作用機(jī)制與特點(diǎn)RNAi發(fā)生的主要過程大致分為3個(gè)階段:(1起始階段,dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)被RNase III(如Dicer均勻切割成21-25nt大小的siRNA;(2效應(yīng)階段,siRNA和內(nèi)切核酸酶以及其它蛋白一起形成RISC (RNA-induced sil

4、encing complex。RISC的核酸部分起到靶向性的作用,蛋白部分則起到降解mRNA的作用;(3擴(kuò)增階段,siRNA與mRNA靶向性結(jié)合,并作為引物,在RdRP作用下再次形成dsRNA,新形成的dsRNA又被Dicer切割成siRNA,新形成的siRNA又可以進(jìn)入下一輪循環(huán)而達(dá)到擴(kuò)增效應(yīng)的目的。因此,可以通過構(gòu)建表達(dá)dsRNA或者siRNA來實(shí)現(xiàn)RNAi的功能。2 常用的制備siRNA的方法現(xiàn)在,RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于探討許多基因功能的研究中。在植物、原生動(dòng)物、昆蟲、線蟲中應(yīng)用RNAi技術(shù)相對(duì)是比較簡(jiǎn)單的,因?yàn)橥ㄟ^體外轉(zhuǎn)錄的方法制備較長(zhǎng)的雙鏈RNA并不困難。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中就麻

5、煩多了,因?yàn)槌^30nt的dsRNAs會(huì)引起非特異基因沉默。實(shí)驗(yàn)表明,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)特異的基因沉默最有效的siRNAs是有19-29個(gè)互補(bǔ)堿基,3端各有2個(gè)堿基突出(通常是UU的dsRNAs。目前,制備siRNA的方法主要有如下幾種(表1:(1 化學(xué)合成:是指將直接化學(xué)合成siRNA通過專用的RNA轉(zhuǎn)染試劑,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以將這些siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).該方法合成的siRNA組成均一性高,能合成很高的量,能進(jìn)行更多的化學(xué)修飾。缺點(diǎn)是合成費(fèi)用相當(dāng)高,合成用的時(shí)間長(zhǎng)。由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不同的siRNA的效率不一,一般一個(gè)靶基因需要至少設(shè)計(jì)3-4對(duì)不同的siRNA進(jìn)行試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)以確定最有效的

6、一個(gè),這無疑提高了RNAi 的成本。另外,由于RNA極易降解,基因沉默效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短。比較項(xiàng)目化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄RNaseIII降解dsRNA表達(dá)載體材料要求一對(duì)21nt RNA oligos一對(duì)29nt DNA oligos 兩側(cè)帶T7啟動(dòng)子的200-1000bp轉(zhuǎn)錄模板約50-60nt DNA oligos合成所需時(shí)間4天-2周1天+DNA oligos合成時(shí)間一天轉(zhuǎn)錄模板準(zhǔn)備時(shí)間5天-6天個(gè)人操作時(shí)間幾乎不需要中等中等較多需要驗(yàn)證和尋找最有效的siRNA需要需要不需要需要能否標(biāo)記siRNA能能能不能轉(zhuǎn)染得難易程度好好好較差可篩選性不可以不可以不可以可以長(zhǎng)效抑制不可以不可以不可以可以能否大規(guī)

7、模制備可以有限有限可以檢測(cè)總體轉(zhuǎn)染效率不可以不可以不可以可以每基因費(fèi)用(不含人力高中等低中等表1 各種不同制備siRNA方法的比較生物技術(shù)世界 2012年第3期 15醫(yī)藥生物技術(shù)(2 體外轉(zhuǎn)錄:是指體外條件下,以短的雙鏈寡核苷酸盒式結(jié)構(gòu)為模板,該結(jié)構(gòu)在緊連siRNA模板鏈的上游啟動(dòng)子序列,利用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄得到siRNA。該方法中,siRNA的兩條鏈分別合成,雜交后進(jìn)行純化。進(jìn)行體外擴(kuò)增的時(shí)候,通常要求序列的為首2個(gè)堿基為GG或者GA以提高合成效率,但是這兩個(gè)額外的堿基會(huì)大大降低siRNAs的活性,而且通常體外轉(zhuǎn)錄很難高效合成這么小的RNA(通常至少要25nt以上。不同的siRNA有不

8、同的干擾效率,這就要求選取多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行篩選。對(duì)此,一種有效的方法就是先在體外轉(zhuǎn)錄出dsRNA,再用Dicer/RNaseIII消化片段雙鏈RNA制備siRNA。該方法在構(gòu)建RNAi文庫中有一定作用,費(fèi)用低,但是篩選驗(yàn)證有效siRNA的過程較煩瑣。(3 載體表達(dá)法:上述方法共同的缺點(diǎn)在于不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抑制,通常只能維持3-5天,解決這一問題的辦法就是利用質(zhì)粒或病毒載體來穩(wěn)定表達(dá)干擾單元。常用的siRNA的載體上包含有RNA聚和酶II/ III啟動(dòng)子和4-5個(gè)T的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。只要將編碼一小段對(duì)應(yīng)目的基因特異序列的、其RNA能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(即回文結(jié)構(gòu)的DNA序列插入載體中啟動(dòng)子的下游,轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)

9、胞,載體就能表達(dá)出發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA,這種RNA很快在細(xì)胞中加工成為大約21個(gè)堿基大小的類似siRNAs的分子,隨后起始RNAi過程,引發(fā)基因沉默。采用這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于,通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記,siRNA載體能夠更長(zhǎng)時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增,相比起化學(xué)合成來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。這個(gè)發(fā)現(xiàn)和最近在線蟲、果蠅、植物以及錐蟲中先后進(jìn)行的將能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子導(dǎo)入能夠引發(fā)RNAi現(xiàn)象的結(jié)果是一致的。3 構(gòu)建RNAi表達(dá)載體的方法由于RNAi表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抑制,可以重復(fù)擴(kuò)增,顯著降低實(shí)驗(yàn)成本,因此構(gòu)建RNAi表達(dá)載體是高效、高通量表達(dá)siR

10、NA的常規(guī)方法:(1 寡核苷酸退火法:該方法是指,先由化學(xué)合成的雙鏈DNA寡核苷酸退火成雙鏈DNA,兩端各有幾個(gè)堿基的粘性突出,剛好能與骨架載體匹配,經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后,篩選重組子。寡核苷酸為一反向重復(fù)序列,從這樣一個(gè)載體轉(zhuǎn)錄而來的單鏈RNA能夠回折互補(bǔ)配對(duì),形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)處理后形成siRNA。目前,這是實(shí)驗(yàn)室的通用方法之一。它具有表達(dá)效率高,操作方便的特點(diǎn)。其缺點(diǎn)是要合成較長(zhǎng)的寡核苷酸鏈(通常大于50bp,而且克隆過程中插入片段小,故重組子鑒定困難,假陽性率高。(2 雙元啟動(dòng)子法:siRNA能通過反向雙元Pol III啟動(dòng)子(頭對(duì)頭設(shè)置的方式來產(chǎn)生。在這一系統(tǒng)中,線性化的dsRNA是以s

11、iRNA 為模板,由兩個(gè)相反的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來。這樣就消除了表達(dá)shRNA 過程中需要運(yùn)用發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及與之相關(guān)的一系列不足之處。運(yùn)用反向啟動(dòng)子系統(tǒng)從cDNA來構(gòu)建siRNA文庫的主要技術(shù)問題在于可隆位點(diǎn)的相容性?？偟恼f來,在這一系統(tǒng)中,每個(gè)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有一連串A5,以便為另一個(gè)反向啟動(dòng)子提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。與此同時(shí),在A5區(qū)必需有用于克隆的限制性酶切位點(diǎn)。在以前的報(bào)導(dǎo)中,在反向載體中運(yùn)用的限制性內(nèi)切酶常常產(chǎn)生4nt粘性末端以便克隆。siRNA的序列,T5終止信號(hào)以及限制性酶切位點(diǎn)都是由化學(xué)合成的寡核苷酸提供。兩個(gè)不同的非磷酸化的寡核苷酸接頭依次被連接到平末端的cDNA片段,然后用PCR方式

12、來擴(kuò)增目的片段,經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后克隆至相應(yīng)載體。然而,其缺點(diǎn)是將寡核苷酸片段與cDNA平末端連接的效率低,而且需要多輪的PAGE純化步驟,使得該方法非常煩瑣。(3 PCR擴(kuò)增法:設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增啟動(dòng)子的引物,正向引物與啟動(dòng)子特異性匹配,反向引物中加上額外針對(duì)靶基因的干擾序列,這樣一輪PCR之后再將PCR產(chǎn)物克隆到相應(yīng)的載體上。該方法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,但是需要長(zhǎng)引物,通常大于70bp,不僅花費(fèi)高,而且堿基合成錯(cuò)誤率高。4 存在的問題與前景低等生物對(duì)dsRNA或siRNA導(dǎo)入的條件要求較低,成功率較高,但對(duì)較高級(jí)的哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率卻不理想。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞對(duì)dsRNA的導(dǎo)入具有抗拒性

13、,并且值得注意的是大于30bp的dsRNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞可誘導(dǎo)干擾素的合成結(jié)果是非特異性的和全面的抑制基因表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;同時(shí)dsRNA具有濃度依賴性,dsRNA誘發(fā)的RNAi效應(yīng)的強(qiáng)度隨著其濃度的增高而增強(qiáng),但是濃度過高RNAi效應(yīng)也會(huì)降低等。RNAi在哺乳動(dòng)物中的實(shí)驗(yàn)遇到的另一問題是RNAi衰減現(xiàn)象,siRNA被導(dǎo)入細(xì)胞后RNAi 效應(yīng)僅持續(xù)數(shù)天便逐漸消失。此外RNAi技術(shù)和反義RNA技術(shù)一樣,有一些如寡聚核酸合成困難、易被降解、導(dǎo)入困難等相似的缺點(diǎn)?？梢灶A(yù)見,RNAi技術(shù)的應(yīng)用,不僅能大大推進(jìn)人類后基因組計(jì)劃的發(fā)展,還有可能設(shè)計(jì)出RNAi芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測(cè)人

14、類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、神經(jīng)系統(tǒng)研究、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。用RNAi技術(shù)來抑制基因的異常表達(dá),為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。因此,RNAi的研究與應(yīng)用具有極其重要的理論和實(shí)際意義,將對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。參考文獻(xiàn)1 McIntyre GJ, Fanning GC: Design and cloning strategies for constructing shRNA expression vectors. BMC Biotechnol 2006, 6: 1.2 Kim J, Kim H, Lee Y, Yang K,

15、Byun S, Han K: A simple and economical short-oligonucleotide-based approach to shRNA generation. J16生物技術(shù)世界 2012年第3期醫(yī)藥生物技術(shù)Biochem Mol Biol 2006, 39: 329334.3 Hernandez-Hoyos G, Alberola-Ila J: Analysis of T-cell development by using short interfering RNA to knock down protein expression. Methods Enzy

16、mol 2005, 392: 199217.4 Zhou H, Xia XG, Xu Z: An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient RNAi. Nucleic Acids Res 2005, 33: e62.5 Li J, Li C, Xiao W, Yuan D, Wan G, Ma L: Site-directed mutagenesis by combination of homologo

17、us recombination and DpnI digestion of the plasmid template in Escherichia coli. Anal Biochem 2008, 373: 389391.6 Invitrogen: BLOCK-IT Pol II miR RNAi Expression Vector Kits Gateway-adapted expression vector for the expression of microRNA (miRNA in mammalian cells under control of Pol II promoters.

18、2005, July version A: 29.7 Winston, William M. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. March 2002, 295: 2456.8 Jae-Yean, Kim. Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Current Opinion in Plant Biology. February 2005, 8: 45.11 Iyer LM,A

19、nantharaman V,Aravind L.Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins. BMC Genomics,2003,4(1:5.12 Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science,2002, 296(5567:550-553.13 I

20、rie N,Sakai N,Ueyama T,et al.Subtype-and species-specific knockdown of PKC using short intering RNA.Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,298:738-743.14 Sabine B.Antisense-RNA regulation and RNA interference. Biochemica et Biophysica Acta,2002,1575(23:15-25.15 Van RP,Brand AH.Spre

21、ding silence with sid.Genome Biol, 2004,5(2:208.16 Lippman Z,May B,Yordan C,et al.Distinct Mechanisms Determine Transposon Inheritance and Methylation via Small Interfering RNA and Histone Modification.PLoS Biol, 2003,1(3:E67.17 Hall IM,Shankaranarayana GD,Noma K,et al. Establishment and maintenance

22、 of a heterochromatin domain.Science,2002,297(5590: 2232-2237.18Durand-Dubief M,Bastin P.TbAGO1, an Argonaute protein required for RNA interference, is involved in mitosis and chromosome segregation in Trypanosoma brucei.BMC Biol,2003,1(1:2.19 Heinonen JE,Smith CI,Nore BF.Silencing of Bruton's t

23、yrosine kinase (Btk using short interfering RNA duplexes (siRNA.FEBS Lett, 2002,527(1-3:274-278.20 Sui G,Soohoo C,Affarei,et al.A DNA vector-based RNA technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acal Sci USA,2002,99(8:5515-5520.21 Clemens JC,Worby CA,Simonson-Leff N,et al.Use

24、 of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12:6499-6503.22 Makimura H,Mizuno TM,Mastaitis JW,et al.Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influ

25、encing food intake. BMC Neurosci,2002,3(1: 18.23 Yang YS,Chen GM,Dong WP,et al.Construction and analysis of activity of an HIV-1/bovine immunodeficiency virus chimeric clone Cdna .Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi,2003,17(2: 143-145.24 Hamasaki K,Nakao K,Matsumoto K,et al.Short interfering RNA-directed inhibition of hepatitis B virus replication.FEBS Lett,2003, 543(1-3:51-54.25 Song E,Lee SK,Wang J,et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis.Nat Med,2003, 9(3:347-351.26 Cioca DP,Aoki Y,Kiyosawa K.RNA interference