TRIZOL法提取總RNA（課堂PPT）

1、.1實驗總體安排實驗總體安排1大鼠大鼠GAPDH基因的釣取、克隆和鑒定：基因的釣取、克隆和鑒定：大鼠肝細(xì)胞總RNA的提取，凝膠電泳檢測GAPDH基因的RT-PCR擴增（普通聚合酶）RT-PCR產(chǎn)物的膠回收連接入T載體、轉(zhuǎn)化（GAPDH基因的TA克隆）挑單克隆，搖菌過夜、提質(zhì)粒酶切鑒定，電泳檢測.2專題 2.human IL8 ELISA檢測 3.報道系統(tǒng)的單光子檢測.3TRIZOL法提取總RNA.4簡介 研究基因的表達和調(diào)控時常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。 RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實驗的成敗。.5 Trizol是直接從細(xì)胞

2、或組織中提取總RNA 的試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍，酚等物質(zhì)，異硫氰酸胍能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。核酸由于核蛋白二級結(jié)構(gòu)的破壞而解離下來。異硫氰酸胍同時抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，用異丙醇沉淀火的RNA.6RNase 它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時，必須戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，包括槍頭和EP管等.7RNase處理 所有玻璃器皿均應(yīng)于使用前180干烤3h或更長時間，塑料器皿可用0.1DEPC浸泡或用氯仿洗滌。 全部實驗過程最好戴一次

3、性手套，接觸可能污染了RNA酶的物品后，應(yīng)更換手套。 配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1DEPC在37處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22um濾膜過濾除菌。 .8從組織中提取RNA 本實驗?zāi)康模禾崛〈笫罂俁NA 組織來源：大鼠肝臟。 每組做兩個樣品.9步驟 解剖大鼠肝臟，每個樣品取50-100mg組織，立即加入1mlTRIZOL試劑。勻漿。 移入1.5ml Ep管中，室溫靜置5min。 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，搖振15s，置室溫23min。 4離心，12,000g15min。 仔細(xì)吸取上層水相，移至另一

4、Ep管中。 加0.5ml異丙醇，混勻，置室溫10min。 4離心，12,000g10min。 棄上清，加75乙醇1m1，輕輕搖振，充分洗滌沉淀，4離心，7500g5min。 棄上清，空氣干燥5-10min，加入50l無RNase水重懸沉淀。 核酸定量或電泳檢測。多余樣品-70保存?zhèn)溆谩?10注意事項 抽提及操作RNA中要謹(jǐn)防RNase的污染，因此操作RNA的試劑及器皿都要進行相應(yīng)的處理。 全部實驗過程最好戴一次性手套，接觸可能污染了RNA酶的物品后，應(yīng)更換手套 樣品量和Trizol 的加入量一定要按步驟（1 ）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol 量，否則會使內(nèi)源性RNase 的抑制不

5、完全，導(dǎo)致RNA 降解。 .11電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳是檢測和分離核酸的常用方法 瓊脂糖瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖濃度。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。.12 瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗

6、略估計樣品DNA濃度。.13注意事項 EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。 實驗過程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能混樣。.14實驗步驟（1） 0.25g 瓊脂糖加入25ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（2）冷卻到60，加入1l的0.5mg/ml EB，并搖勻。（3）將將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固。（4）將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。（5）用移液器吸取總RNA樣品5l于封口膜上，再加入1l 的6Xloading buffer，混勻后，小心加入點

7、樣孔。(6) 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約30min。 .15.16上樣上樣.17.18電泳檢測結(jié)果：電泳檢測結(jié)果： RNA提取：提?。?關(guān)鍵關(guān)鍵 防止防止RNARNA降解降解RNA提取的成功與否提取的成功與否是是RT-PCR檢測中最檢測中最重要的步驟。重要的步驟。.19核酸定量 組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收波長為250270nm之間。例如腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鳥嘌呤：276 nm，胸腺嘧啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收

8、峰不會改變。但核苷酸最大吸收波長是260nm，吸收低谷在230nm，這個物理特性為紫外分光光度法測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。 .20 在波長260nm紫外線下，1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50ug/ ml；單鏈DNA或RNA為40ug/ml；單鏈寡核苷酸為20ug/ml。 DNA樣品的濃度為：OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000（ug/ul） RNA樣品的濃度為：OD260核酸稀釋倍數(shù) 40/1000（ug/ul） .21 故根據(jù)OD 260 /OD 280的比值可以估計核酸的純度： DNA樣品的比值為1.8， RNA樣品的比值為2.0。若DNA樣品的比值高于1.8，說明樣品中含有

9、RNA污染， 若RNA樣品比值高于2.0，則提示RNA 有降解。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。.22實驗步驟 取適當(dāng)體積（2ul）核酸樣品，加水或（TE）至100ul，混勻。 將核酸定量儀調(diào)制RNA測定一項，輸入稀釋倍數(shù)，然后把樣品放入核酸定量儀中讀數(shù)。核酸定量儀將直接給出樣品濃度。 .23RT-PCR.24RT-PCR RNA的多聚酶反應(yīng)（的多聚酶反應(yīng)（RT-PCR）是以）是以mRNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reversetranscription，RT）與）與PCR，可用于檢測，可用于檢測單個細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于單個細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個拷貝的個

10、拷貝的RNA模板。模板。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物產(chǎn)物.25反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCR特異性引物, Taq酶Oligo dT, 逆轉(zhuǎn)錄酶用途用途: 獲得所需cDNA片段；檢測基因表達注意問題：1、PCR效率差異，重復(fù)性2、內(nèi)參選定3、mRNA豐度.26RNA、緩沖液、緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機引物引物（隨機引物:Oligo dT)5AAAAAAAA3TTTTTTTTmRNAcDNA1.逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄：.27實驗步驟 取1g總RNA于一PCR管，70反應(yīng)10min，輕輕離心后置于冰上。 2）建立20l RT反應(yīng)體系： MgCl2 4l 10RT

11、緩沖液 2l dNTP Mixture（10mM） 2l（1.25mmol/L） RNase inhibitor 0.5l 逆轉(zhuǎn)錄酶 1l（200U） Oligo(dT)15引物 1l 總RNA 1g 加無核酶水至總體積 20l 渦旋混勻，42反應(yīng)15分鐘，95加熱5分鐘，0-55分鐘。.28AAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5 cDNArTaq2.2.PCRPCR: :GAPDHGAPDHGAPDH (sense)GAPDH (antisense)cDNA、緩沖液、緩沖液、dNTP、rTaq、引物、引物（特異引物（特異引物)、Mg2+.29實驗步驟 建立PCR反應(yīng)體系： RT獲得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA 5l 5.0M的GAPDH混合引物 2l 10PCR buffer 5l 10mM dNTPs 1l Taq DNA聚合酶 0.5l MgCl2 4l d