包涵體純化復(fù)性指南

1、關(guān)于包涵體的處理一般包括這么幾步:菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純彳t.菌體的裂解1、怎樣裂解細菌？2、表達重組蛋白時，細菌裂解方法都有哪些?3、酵母的破碎4、超聲破碎的條件選擇5、如何鑒定細菌超聲破碎的程度6、細菌裂解的DNasel7、超聲裂解細菌是否完全？二、包涵體的洗滌1、包涵體的洗滌問題2、如何得到比較純的包涵體三、關(guān)于包涵體的溶解：1、請教GST包涵體溶解2、包涵體的溶解3、有關(guān)包涵體的溶解問題4、8M尿素溶解的包涵體溶液應(yīng)如何保存？5、8M尿素溶解的包涵體溶液在室溫下可以放多久而不出現(xiàn)問題？6、GST融合蛋白形成包含體不溶，咋辦？四、包涵體的復(fù)性1、包涵體如何復(fù)性2、包涵

2、體的復(fù)性23、包涵體復(fù)性34、SOS!各位包涵體復(fù)性高手5、大家來談?wù)劙w復(fù)性問題6、包涵體復(fù)性形成聚集物7、復(fù)性中蛋白析出！8、包涵體復(fù)性液配方9、什么叫復(fù)性成功10、怎樣鑒定融合蛋白復(fù)性是否成功五、包涵體的純化復(fù)性以后的蛋白質(zhì)的純化策略與可溶性蛋白質(zhì)相似，這里不再贅述。（注：當然也可以先純化然后再復(fù)性一般多采用凝膠柱，或者純化與復(fù)性同步進行比如柱上復(fù)性。）六、綜述以及其他1、蛋白復(fù)性和純化在線資料2、綜述細胞的破碎方法1 .高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2

3、.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3 .超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時間以及超聲間歇時間、超聲時間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。4 .反復(fù)凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，

4、反復(fù)幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。5 .化學(xué)處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且應(yīng)該在破碎的同時多加幾次；另外，還可通過選擇pH、溫度

5、或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。超聲破碎的條件選擇超聲破碎的條件不能一概而論，要看你的實驗要求，有的是細菌破碎，有的是對組織細胞進行破碎，要掌握好功率和每次超聲時間，功率大時，每次超聲時間可縮短，不能讓溫度升高，必要時在冰浴條件下進行超聲破碎。至于每次超聲時是否起泡沫到不是關(guān)鍵的問題，這與你超聲的量明顯有關(guān)。包涵體的洗滌問題通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，我以前是這么做的，先把包涵體用6M鹽酸月瓜溶解充分，過濾除去未溶解的物質(zhì)，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，你可以找到一個合適去除雜質(zhì)的辦法，其實這就是梯度沉淀

6、的方法，我覺得比通常的直接洗脫效果好下列方法已在本實驗室驗證，復(fù)性任何包涵體，必定能得到目的蛋白：菌體為超聲法裂解，裂解溶液中含50mMTris-HCl,pH8.0，100mMNaCl，5mMEDTA，0.1%NaN3，0.5%Triton-X100，在使用前加入0.1mMPMSF每250毫升裂解液中加入約50克菌體，工作15s，間隔15秒，超聲破碎45分鐘，超聲后加入10mMMgSO4和0.1mg/ml的溶菌酶和Dnase0.01mg/ml，室溫放置20分鐘，6000RPM離心15分鐘，保留沉淀。再次加入裂解液，超聲破細胞后，加溶菌酶和Dnase,上述過程重復(fù)三次。用下述的溶液將包涵體懸浮，

7、離心收集包涵體。50mMTris-HCl,pH8.0100mMNaCl5mMEDTA0.1%NaN3用下述溶液懸浮包涵體，離心收集包涵體。50mMTris-HCl,pH8.0100mMNaCl5mMEDTA0.1%NaN31M尿素如暫時不用，放入20保存。包涵體的溶解將包涵體懸浮在下述溶液中，4振蕩過夜。100mMTris50mMGlycine8.5M尿素溶液用HCl調(diào)節(jié)到pH8.0后加入25mMDTT6000RPM離心，取上清，去除不溶解物。包涵體蛋白的復(fù)性將溶解的包涵體裝入透析袋，在4下將透析袋浸入下列溶液依次透析：0.1MTris0.4ML-Arginine1mMEDTA0.2mMPMSF4M尿素溶液pH調(diào)節(jié)到8.0透析24小時0.1MTris0.4ML-Arginine1 mMEDTA0.2mMPMSF2M尿素溶液pH調(diào)節(jié)到8.0透析24小時0.1MTris0.4ML-Arginine1 mMEDTA0.2mMPMSF1M尿素溶液pH調(diào)節(jié)到8.0透析24小時0.1MTris0.4ML-Arginine1mMEDTA0.2mMPMSF0M尿素溶液pH調(diào)節(jié)到8.0透析24小時0.025MTris0.1ML-Arginine0.25mMEDTA0.2mMPMSF0M尿素溶液pH調(diào)