土壤中放線菌的分離與純化

1、精選文檔土壤中放線菌的分別與純化試驗?zāi)康?把握放線菌的生長特性，微生物的培育方法。2把握微生物試驗的基本生物技術(shù)，主要包括無菌操作技術(shù)，純種分別技術(shù)，純種培育技術(shù)，以及抗生素檢測等。3把握合成培育基，選擇培育基的制備方法。4學(xué)習(xí)對微生物試驗的中消滅問題的分析，解決方法試驗材料藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、瓊脂、重鉻酸鉀其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培育皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。試驗原理放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中（主要是鏈霉菌

2、），其數(shù)量僅次于細菌。一般在中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了爭辯某種微生物，就必需把它們從這些混雜的微生物群體中分別出來，從而獲得某一菌株的純培育。分別放線菌常用稀釋倒平板法。依據(jù)放線菌的養(yǎng)分、酸堿度等條件要求，常選用合成培育基或有機氮培育基。假如培育基成分轉(zhuǎn)變，或土壤預(yù)先處理（120熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌消滅的數(shù)量大大削減，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培育基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長，故可用金黃色葡萄球菌（G

3、+）和大腸桿菌（G-）作指示菌鑒別放線菌。高氏一號合成培育基是培育放線菌的培育基。這種培育基是接受化學(xué)成分完全了解的純試劑配制而成的培育基，高氏一號培育基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3 、NaCl 、K2HPO43H2O 、MgSO47H2O 作為無機鹽，F(xiàn)eSO47H2O作為微生物的微量元素，供應(yīng)鐵離子等組成1.高氏一號合成培育基的制備K2HPO4 3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸鉀0.25, MgSO47H2O0.125g， FeSO47H2O 0.025g，氯化鈉0.125g，瓊脂5g，水250ml。配制時，先依次加入上述藥品（除瓊脂外）挨次溶解，加入無菌水至250ml，

4、調(diào)整pH7.4，再加入瓊脂不斷攪拌震蕩至溶化后， 121滅菌20分鐘。將6套平皿、12只試管滅菌。2. 土壤中放線菌的分別1編號，分裝：取6套無菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-3、10-4、10-5）。每個稀釋度做兩個培育皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50左右的高氏一號培育基1520ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2稀釋傾注分別稱1g土樣放入10ml無菌水試管中振蕩10min，即10-1的土壤懸液，靜置30s。用無菌吸管無菌操作取10-1濃度的土

5、壤懸液1ml并加入編號10-2的無菌試管中，并吹吸吸管23次，吸時伸入管底，吹時離開水面，使其混合均勻。即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。如圖 3倒平板分別培育于上述盛有不同稀釋度菌液的培育皿中，倒入溶化后冷卻至45左右的高氏培育基約1015ml，置水平位置，快速旋動混勻，待凝固。（若溶化的培育基溫度太高，會產(chǎn)生太多的冷凝水，影響觀看。）用1ml無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液1ml，對號放入編好號的無菌培育皿中，每一濃度對應(yīng)兩個平板。用無菌涂布棒（從濃度小液開頭）將加入平板培育基上的土壤稀釋液在整個平板

6、表面涂勻，涂完一個平板用酒精燈滅菌。稀釋涂布平板法4培育 接種完畢，將平皿和試管放入28恒溫箱培育7天，觀看平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。菌種純化1、倒平板 將加熱溶化的高氏一號合成培育基倒平板，并標(biāo)號。2、平板劃線 劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種： 圖-3 劃線分別示意圖分區(qū)劃線 用接將培育皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培育皿略微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁刮取少許菌苔，在平板培育基的一邊，作第1次平行劃線 67條，轉(zhuǎn)動培育皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次

7、劃線部分作第2次平行劃線(圖-3)，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針遇到培育皿邊緣，也不要將培育基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培育。連續(xù)劃線 將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培育基上作連續(xù)劃線(圖-4，B)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置28培育。 V4劃線分別示意圖拮抗試驗長出菌落后，要推斷是否已分別到了純菌種。1配置鑒別培育基 配置金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培育基。2標(biāo)號 在兩平板上標(biāo)注均勻間隔的7個區(qū)域。2挑菌落 在純培育的平板上切取生長較好的放線菌落依次放入標(biāo)注區(qū)域中（在火焰旁切?。糜?8恒溫箱培育1天后可觀看到有抑

8、菌圈生成。爭辯1 高氏培育基的配置關(guān)鍵是pH值的調(diào)整和重鉻酸鉀的加入。放線菌的最適生長條件是2337，pH7.07.5，而在同樣條件下也利于霉菌生長。在高溫殺菌下，放線菌和霉菌的孢子仍可以存活，所以必需加入重鉻酸鉀抑制霉菌和細菌的生長（對放線菌無抑制作用）。否則霉菌大量生長。如圖培育基配置時各成分的溶解挨次應(yīng)是先加緩沖化合物，后是主要元素、次要元素。調(diào)整pH值時，加入酸堿要緩慢、少量、多加攪拌，防止局部過酸或過堿而破壞養(yǎng)分成分。我們第一次配置的高氏培育基很可能就是由于酸堿調(diào)整時酸堿過量和未加入重鉻酸鉀而導(dǎo)致失敗。2 放線菌可以產(chǎn)生色素，且放線菌代表屬也分好幾種。其菌落一般為圓形，菌落質(zhì)地致密表

9、面呈較緊密的絨狀或堅實、干燥、多皺，地衣狀。表面干燥。可作為鑒別菌種的基本參考依據(jù)。孢子絲生長到肯定階段可形成孢子由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表現(xiàn)出特定的顏色，而且在肯定條件下比較穩(wěn)定，故也是鑒定菌種的依據(jù)之一。但孢子的形態(tài)和大小不能籠統(tǒng)地作為分類鑒定的重要依據(jù)。3 整個過程要保證在無菌條件下進行，培育基及儀器可用高壓蒸汽滅菌。接種時，試驗桌要用95的酒精擦拭，且在接種時要在火焰區(qū)的無菌范圍內(nèi)（空氣中含有大量灰塵、細菌和霉菌孢子等造成污染），且打開培育基時間盡量短。4 稀釋倒平板法時涂布要均勻，否則，細菌密度不均導(dǎo)致菌落生長過于集中，細菌無法充分利用養(yǎng)分成分影響生長，且在鑒別時較難看到明顯的抑菌圈。 稀釋時除了應(yīng)用平板涂布外還用了劃線法。涂布主要是通過稀釋溶液方法削減細菌分布密度，劃線法通過