蛋白質(zhì)濃度的測定方法總結(jié)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一、蛋白濃度的直接測定（UV法）這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。（1）簡易經(jīng)驗公式    蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = 1.45*OD280-0.74*OD

2、260 * Dilution factor（2）精確計算通過計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計算最終結(jié)果：   蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D   其中d為測定OD值比色杯的厚度   D為溶液的稀釋倍數(shù)二紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量【實驗目的】 1. 學習紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度計的操作方法。 【實驗原理】 大多數(shù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質(zhì)在280nm

3、的紫外光區(qū)產(chǎn)生最大吸收，并且這一波長范圍內(nèi)的吸收值與蛋白質(zhì)濃度的成正比，利用這一特性可定量測定蛋白質(zhì)的含量。 紫外吸收法可測定0.1-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，此操作簡便，測定迅速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，此法在蛋白質(zhì)的制備中廣泛應用。 【實驗材料】 1.實驗器材 試管及試管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度計。 2.實驗試劑 (1)標準蛋白質(zhì)溶液：精確配制2mgml的酪蛋白溶液。 (2)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。 【實驗操作】 1. 繪

4、制標準曲線 取7支試管按下列各表加入各試劑：  管號 試劑 0 1 2 3 4 5 6 標準蛋白質(zhì)溶液(ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 蒸餾水(ml) 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 試劑加完后搖勻，在紫外分光光度計上，于280nm處以0號管為對照，分別測定各管溶液的光密度值。以光密度為縱座標，標準蛋白溶液濃度為橫座標，繪制出標準曲線。 2. 測定未知樣品 取樣品溶液4毫升,加蒸餾

5、水4ml混勻，在280nm下測定其光密度值。 【實驗結(jié)果】 根據(jù)樣品溶液的光密度值，在繪制好的標準曲線圖中查出樣品溶液的蛋白質(zhì)含量。二、比色法蛋白濃度測定蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質(zhì)濃度。三雙縮脲法（Biuret法）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩 個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵

6、，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。9 L' B   P   n! 試劑與器材# S; d( z/ I+ M( h3 C6      試劑：' T! $ d3 V, J% A（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用BSA

7、濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。1 ) + : 1 L2    N" ?6 C（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存

8、瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。- P( C4 v( K6 / 器材：) m, W4 G% C9 , w) O1. 可見光分光光度計) q   A4 S8 X9 t, n2. 比色杯! l# T# q; g* G   e3. 大試管15支+ |/ Y- a3 P+ d& H4 - v4. 旋渦混合器等。: P' h/ f: h( e4 u/ d% o% - B操作方法2 G0 ?3 _+ - h) F   V1. 標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質(zhì)

9、溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025）下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。+ l% A( Y' 7 j; o" U2. 樣品的測定：取23個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。7 S2    ?% p8 4 H/ 此法的優(yōu)點是較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要

10、十分精確的蛋白質(zhì)測定。四BCA方法測定蛋白質(zhì)含量【實驗目的】 掌握用BCA方法測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作方法 【實驗原理】 BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5g/ml），應用更加靈活。 蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)

11、的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。 【實驗材料】  1.實驗器材 721分光光度計；恒溫水浴槽；移液管；微量進樣器；試管架和試管。  2.實驗試劑 (1) BCA試劑的配制  試劑A，1L：分別稱取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。  試劑B，50ml：取2g CuSO4&

12、#183;5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。  BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。 (2)標準蛋白質(zhì)溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400g/ml的溶液。 (3)樣品溶液：配制約50g/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。 【實驗操作】 1.繪制標準曲線 取6支干燥潔凈的大試管，編號，按下表加入試劑。 管號 1 2 3 4 5 6 標準蛋白溶液（l） 蒸餾水（l） BCA試劑（ml） 蛋白質(zhì)含量（g） 0

13、250 5 0 50 200 5 20 100 150 5 40 150 100 5 60 200 50 5 80 250 0 5 100 上述試劑加完后，混勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以第1管為對照，在562nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。 2.樣品測定 準確吸取250l樣品溶液于一干燥潔凈的試管中，加入BCA試劑5ml，搖勻，于37保溫30min，冷卻至室溫后，以標準曲線1號管為對照，在595nm處比色，記錄吸光值。 【實驗結(jié)果】 根據(jù)樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。五

14、Lowry法目的 掌握Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度的原理。 原理     蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關系作標準曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 操作    取試管7支、編號、按下表操作： 立即混勻，在2025水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測定光密度值。 操作注意事項： 1  按順序添加試劑 2  試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下

15、（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。     計算        (一)繪制標準曲線。以濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制標準曲線。         (二)以測定管光密度值，查找標準曲線，求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(gL)。     (三)再從標準管中選擇管與測定管光密度相接近者，求出待測血清中蛋白質(zhì)濃度(g

16、L)。     器材     (一)721型分光光度計     (-)恒溫水浴箱     (三)中試管7支     (四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。     試劑     (一)試劑甲     (1)4碳酸鈉(Na2CO3)溶液

17、60;   (2)0.2N氫氧化鈉溶液     (3)1硫酸銅溶液(CuSO4·5H2O)     (4)2酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉)     在使用前(1)與(2)、(3)與(4)等體積混合，再將兩混合液按50：1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。 (一)試劑乙：      (1)市售酚試劑在使用前用NaOH滴定，以酚肽為指標劑，根據(jù)試劑酸度將其稀釋，使最后酸度為

18、1N。     (2)或取Na2WoO42H2O  l00g和Na2MOO3  25g。溶于蒸餾水700ml中，再加85 H3PO4 50ml和HCl(濃)100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫和地回流十小時，再加硫酸鋰(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水數(shù)滴。繼續(xù)沸騰15分鐘后以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml然后過濾，溶液應呈黃色或金黃色(如帶綠色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用時用標準NaOH滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最后酸度為1N。

19、60;   (三)標準蛋白質(zhì)溶液     用結(jié)晶牛血清白蛋白，根據(jù)其純度用蒸餾水配制成0.25mgml的蛋白質(zhì)溶液。(純度可經(jīng)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量而確定)。     (四)待測樣品：準確取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9NaCl溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。六考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質(zhì)濃度目的要求學習考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。 實驗

20、原理  考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃 度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2min即可反應完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質(zhì)染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)染料復合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定

21、蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10100µg蛋白質(zhì)，微量測定法測定范圍是110µg蛋白質(zhì)。此反應重復性好，精確度高，線性關系好。標準曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。 此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當?shù)木彌_液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2巰基乙醇，蔗糖，甘

22、油，EDTA及微量的去污劑如Triton X100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當?shù)木彌_液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。試劑與器材一、試劑考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍G250，4.7%(W/V)乙醇。 二、標準和待測蛋白質(zhì)溶液1標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白質(zhì)溶液。

23、 三、器材試管及試管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度計。操作方法一、標準法制定標準曲線取14支試管，分兩組按下表a平行操作。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。 表a試管編號01234561mg/ml標準蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm 二、微量法制定標準曲線取12支試管，分兩組按下表b平行操作。

24、繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。表b試管編號0123451mg/ml標準蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm 三、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。注意事項 （1） （1

25、） 如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的520min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2） （2） 測定中，蛋白染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。七凱氏定氮法【實驗目的】 學習凱氏定氮法的原理和操作技術。 【實驗原理】  凱氏定氮法用于測定有機物的含氮量,若蛋白質(zhì)的含氮量已知時，則可用此法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量。  當?shù)鞍踪|(zhì)與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消化”。但是，這個反

26、應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。 消化完成后，在凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽蒸餾法，將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結(jié)合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后用標準無機鹽酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止。根據(jù)所用標準鹽酸的量可計算出待測物中的總氮量。 蛋白質(zhì)的含氮量為16%，即1克蛋白質(zhì)中的氮相當于6.25克蛋白質(zhì)，用凱氏定氮法測出的含氮量乘以6.25,即得樣品中蛋白質(zhì)的含量。 【實驗材料

27、】 1.實驗器材 微量凱氏定氮儀 1套；50ml凱氏燒瓶 4個；移液管；錐形瓶；試管；小玻璃珠 2.試驗試劑 (1) 濃硫酸；30氫氧化鈉溶液；2硼酸溶液；標準鹽酸溶液(0.01molL)。 (2) 粉末硫酸鉀硫酸銅混合物 ：K2SO4與CuSO4·5H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示劑(田氏指示劑)：由50ml 0.1甲烯藍乙醇溶液與200ml 0.1甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中備用。 (4) 樣品溶液：配制3mg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。 【實驗操作】 1

28、.安裝凱氏定氮儀。 2.消化：取4個50ml凱氏燒瓶并標號,各加1顆玻璃珠，在1號及2號瓶中各加樣品1ml，催化劑(K2SO4- CuSO4·5H2O)200 mg，濃硫酸5 ml。注意加樣品時應直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。在3號及4號瓶中各加1 ml蒸餾水和與1、2號瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對照。在通風櫥內(nèi)進行消化。  在消化開始時應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。撤掉火力，冷卻至室溫。 3.蒸餾： (1)蒸餾器的洗滌：用水洗滌干凈微量凱氏定氮

29、儀，在蒸汽發(fā)生器中加入用幾滴硫酸酸化的蒸餾水和幾滴甲基紅指示劑，用這樣的水蒸氣洗滌凱氏定氮儀。約15分鐘后，在冷凝器下端傾斜放好裝有硼酸-指示劑的錐形瓶，繼續(xù)蒸汽洗滌2分鐘，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色，如不變色則證明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。移走錐形瓶，停止加熱，打開夾子。 (2)蒸餾：取下棒狀玻塞，用吸管吸取消化液，細心地插到反應室小玻璃杯的下方，塞緊棒狀玻塞。將一個含有硼酸和指示劑的錐形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸沒在液體內(nèi)。取30的氫氧化鈉溶液10ml放入小玻璃杯中，輕提棒狀玻璃塞使之流入反應室(為了防止冷凝管倒吸，液體流入反應室必須緩慢)。尚未完全流入時，將玻璃塞蓋緊，向玻

30、璃杯中加入蒸餾水約5ml。再輕提玻璃塞，使一半蒸餾水慢慢流入反應室，一半留在玻璃杯中作水封。加熱水蒸汽發(fā)生器，沸騰后夾緊夾子，開始蒸餾。氨氣進入錐形瓶，瓶中的酸溶液由紫色變成綠色。變色時起記時，再蒸餾5分鐘。移動錐形瓶，使硼酸液面離開冷凝管約1 厘米，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外面，繼續(xù)蒸餾1分鐘，移開錐形瓶，用表面皿覆蓋錐形瓶。蒸餾完畢后，須將反應室洗滌干凈，再繼續(xù)下一個蒸餾操作。待樣品和對照均蒸餾完畢后，同時進行滴定。 4.滴定：用0.01molL的標準鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠色變淡紫色為滴定終點。 【實驗結(jié)果】 運算下列

31、公式計算出每次無機氮標準樣品和未知樣品的總含氮量。式中 WN每毫升樣品的含氮毫克數(shù)； A滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）； B滴定空白消耗的鹽酸量（mL）； C測定樣品所取用量（mL）； 0.0100標準鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）； 14.008每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）。 三次樣品測定的含氮量相對誤差應小于±2%。樣品粗蛋白含量總氮量× 6.256.25為含氮量換算為蛋白質(zhì)含量的系數(shù)。.這個系數(shù)來自蛋白質(zhì)平均含氮量為16，實際上各種蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同，含氮量不完全相同。 Lowry法蛋白濃度測定試劑盒     組成

32、                                          包裝（1000微孔)        

33、           保存   Folin酚甲試劑A                             100ml×2     

34、60;                   2-8   Folin酚甲試劑B                           

35、        5ml                             2-8   Folin酚乙試劑(1N)           

36、                 20ml                             2-8      &

37、#160; PBS稀釋液                                         30ml       &

38、#160;                     2-8   BSA蛋白標準 (5mg/ml BSA)             1ml           &

39、#160;                 -20  本試劑盒自訂購之日起一年內(nèi)有效。     Folin-酚試劑法包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡合物；第二步是此絡合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。定量范圍為5100g/ml蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化

40、合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。操作說明：一 .酶標儀法         1.  根據(jù)需要量，將Folin酚甲試劑A和Folin酚甲試劑B按50：1混合，其有效期為24小時，過期失效。         2. 稀釋標準品：取10微升BSA標準品用PBS稀釋至100微升（標準品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/ml。將標準品按0, 2, 4，6，8, 12, 16

41、, 20微升加到96孔板的蛋白標準品孔中，加PBS補足到20微升。         3. 將樣品作適當稀釋（最好多做幾個梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時的誤差，標準線前面的點可能不很準確，所以盡可能的讓樣品點落在標準線1/2后。         4. 將配好的Folin酚甲試劑每孔加入200微升，輕輕震動，混勻，室溫放置10分鐘。   

42、;      5. 各孔加入20微升Folin酚乙試劑，迅速混勻，37放置30分鐘。用酶標儀測定A650，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。         6. 使用溫箱孵育時，應注意防止因水粉蒸發(fā)影響檢測結(jié)果。     注：如沒有酶標儀，可用分光光度計，將所加試劑都等比放大，在離心管中混勻后加入比色皿中比色。二 .分光光度計法    如沒有酶標儀，可用分光光度計在離心管中混勻后加

43、入比色皿中比色。步驟如下：        1根據(jù)需要量，將Folin酚甲試劑A和Folin酚甲試劑B按50：1混合，其有效期為24小時，過期失效。        2 稀釋標準品：取10微升BSA標準品用PBS稀釋至100微升（標準品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/ml。        3 取八支（或者更多）5ml離心管，標讓號，按下表加入試劑。 

44、       4混勻，37放置30分鐘。用酶標儀測定A650。BCA蛋白濃度測定試劑盒   組成                              包裝（500微孔)    

45、0;            保存   BCA試劑                             100ml      &

46、#160;                  2-8   Cu試劑                            

47、0;      3ml                            2-8   PBS稀釋液             &

48、#160;               30ml                          2-8        BSA蛋白標準 (5mg/m

49、l BSA) 1ml                           -20  本試劑盒自訂購之日起一年內(nèi)有效。     堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。常

50、用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結(jié)果，但受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類的影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測定試劑盒。操作說明：一 . 微孔酶標儀法      1. 配制工作液: 根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時可能會有渾濁，但混勻后就會消失)。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。      2.&

51、#160;稀釋標準品：取10微升BSA標準品用PBS稀釋至100微升（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/ml。將標準品按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白標準品孔中，加PBS補足到20微升。      3. 將樣品作適當稀釋（最好多做幾個梯度，如作2倍、4倍、8倍稀釋），加20微升到96孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量時的誤差，標準線前面的點可能不很準確，所以盡可能的讓樣品點落在標準線1/2后。       4. 各

52、孔加入200微升BCA工作液，37放置15-30分鐘。用酶標儀測定A562nm，根據(jù)標準曲線計算      出蛋白濃度。使用溫箱孵育時，應注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測結(jié)果。二 . 分光光度計法    如沒有酶標儀，可用分光光度計在離心管中混勻后加入比色皿中比色。    步驟如下：       1.配制工作液: 根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑加1體積Cu試劑（50:1）配制成BCA工作液，充分混勻(混合時可能會有渾濁，

53、但混勻后就會消失)。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。  2.稀釋標準品：取100微升BSA標準品用PBS稀釋至1ml（樣品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/ml。           3.取八支（或者更多）5ml離心管，標讓號，按下表加入試劑。   4.37放置15-30分鐘。用分光光度計測562nm處吸光值，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。Bradford蛋白濃度測定試劑盒   組成    

54、0;                        包裝（2500微孔)                 保存   5×G250染色液    

55、;                    100ml                         2-8   PBS稀釋液