抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶研究進展

1、抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶研究進展              作者：代煥琴 王浩鑫 沈月毛  【摘要】  糖苷類抗生素是臨床上廣泛應(yīng)用的抗菌和抗腫瘤化合物。該類化合物在體內(nèi)由糖基轉(zhuǎn)移酶催化，糖基化反應(yīng)通常在抗生素生物合成的最后發(fā)生，糖基的位置、類型和數(shù)量對糖苷類抗生素的活性有很大的影響。本文綜述了糖基轉(zhuǎn)移酶的種類、功能、特性及其在組合生物合成中的應(yīng)用與研究前景。 【關(guān)鍵詞】  抗生素的糖基轉(zhuǎn)移酶 抗生素糖苷 糖基化  

2、0; Recent advances in antibiotic glycosyltransferases       ABSTRACT  Glycoside antibiotics, a category of compounds widely used clinically for anti?bacterial and anti?cancer, are catalyzed by antibiotic glycosyltransferases (Gtfs) in vivo. The sugar moieties are t

3、ransferred to the corresponding aglycon by Gtfs, often work at very late stages of biosynthesis of antibiotics. The position, type and number of sugar moieties incorporated to the antibiotics have great impact on its bioactivity. This article provides an overview of the categories, functions, charac

4、teristics of Gtfs, their applications in combinatorial biosynthesis, and the prospects for research.    KEY WORDS  Antibiotic glycosyltransferase;  Glycoside antibiotics;  Glycosylation      抗生素糖苷在臨床上主要用于抗菌和抗腫瘤，在抗生素生物合成基因簇中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因1，但人們

5、對抗生素糖基轉(zhuǎn)移酶(antibiotic glycosyltransferases，Gtfs)的特異性和催化機制了解不多。糖基與不同配基的結(jié)合能大大增加天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性，在功能上，這些糖組分通常參與目的細胞的分子識別，影響化合物的生物活性2。論文論文參考網(wǎng)目前，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥菌也在逐年增加，迫切需要尋找新的抗生素來與之抗衡。通過糖基化增加抗生素種類和改變抗生素活性是一條很有前景的途徑，探討糖苷類抗生素的產(chǎn)生機制和糖基轉(zhuǎn)移酶的催化特征，有望為發(fā)現(xiàn)和改造新活性的抗生素奠定基礎(chǔ)。    1  糖苷類抗生素    很

6、多糖苷類抗生素在生物合成中經(jīng)過了立體和區(qū)域選擇性的糖基化，在這一生物反應(yīng)中，糖基轉(zhuǎn)移酶催化其結(jié)構(gòu)中的糖基以單糖、雙糖和寡糖鏈的形式結(jié)合到配基上從而形成特定的C?病?N?埠?O?曹?(Fig.1)。糖苷類抗生素的生物合成途徑中，糖基化通常是后修飾的最后一步，如萬古霉素(vancomycin)、替考拉寧(teicoplanin)的糖鏈都是在生物合成的最后引入的3。Fig.1    The C?, N? and O?glycoside antibiotics    糖苷類抗生素的作用機制主要有兩類，一類是通過抑制革蘭陽性菌肽聚糖的合成，如雷

7、莫拉寧(ramop?lanin)4；另一類是抑制DNA促旋酶的活性，如新生霉素(novobiocin)5。    2  糖苷類抗生素中糖基的主要作用    糖基化的作用和意義主要體現(xiàn)在以下三個方面：第一，增加化合物的水溶性。己糖衍生物結(jié)合到抗生素糖苷配基上，增加了抗生素的親水性利于藥效的發(fā)揮，典型的有替考拉寧環(huán)七肽上的N?慘陰咸煙前?(N?acetyl?glucosamine，GlcNAc)和雷莫拉寧骨架上的甘露糖鏈；第二，利于分泌。A40926生物合成途徑中的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(mannosyltransferase)特異識別

8、mannosyl?PP?C55作為糖供體，使糖基化的抗生素利于分泌6。第三，糖基化是產(chǎn)生菌的一種自我保護機制。在竹桃霉素(oleandomycin)的產(chǎn)生過程中，糖基轉(zhuǎn)移酶OleD使中間態(tài)抗生素糖基化，造成其在胞內(nèi)短暫失活，抗生素分泌后，再由糖苷酶水解去除糖基，使其恢復(fù)活性7。該機制在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中比較常見，類似功能的酶還有MgtA8。    3  糖基轉(zhuǎn)移酶    糖基轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的產(chǎn)物具有很多生物學(xué)功能。在不同的Gtfs家族中存在一類與抗生

9、素生物合成相關(guān)的Gtfs，它的功能是在抗生素生物合成的后期使其糖基化，通過糖的位置、類型和數(shù)量的改變對抗生素的活性進行調(diào)節(jié)。    隨著對抗生素生物合成基因簇的深入研究，從放線菌中已經(jīng)分離了100多個抗生素生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，序列分析表明這些基因編碼的蛋白都屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族。大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶基因都具有靠近C端的富含甘氨酸(glycine?rich)的保守區(qū)，該保守區(qū)也存在于UDP?蔡腔?和UDP?財咸僑嶧?轉(zhuǎn)移酶中。選擇GenBank中注冊的有代表性119條糖基轉(zhuǎn)移酶序列，用PAUP 4.0軟件進行系統(tǒng)分析，以近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Fig.2)。進化樹

10、的分析結(jié)果表明，糖基轉(zhuǎn)移酶基因之間親緣關(guān)系的遠近，并不能很準確的推斷其生物學(xué)功能9，例如，EryC和MegC ，在氨基酸水平上具有83.4%的一致性，能識別同樣的配基，UrdGT1b和UrdGT1c表現(xiàn)出了很高的同源性(具有91%一致的氨基酸和僅在31個氨基酸區(qū)域內(nèi)有幾個不同的氨基酸)，但是它們卻轉(zhuǎn)運不同的己糖，UrdGT1c轉(zhuǎn)移L?布兄裉姨?(L?rhodinose)，UrdGT1b轉(zhuǎn)移D?查祥?糖(D?olivose)10。催化C?C、C?N與C?O糖苷鍵形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在基因的序列和氨基酸水平上并沒有明顯的差異，如Asm25(安絲菌素酰胺糖苷生物合成途徑中催化C?N糖苷形成的Gtfs)

11、9，11、UrdGT2(烏達霉素生物合成途徑中催化C?C糖苷形成的Gtfs)12、GtfB(萬古霉素生物合成后修飾中催化C?O糖苷形成的Gtfs)13。    在萬古霉素的后修飾過程中，糖基轉(zhuǎn)移酶GtfB的Fig.2    A dendrogram of different antibiotic glycosyltransferases功能是將UDP?財咸煙侵械鈉咸煙腔?轉(zhuǎn)移到萬古霉素的骨架上，對其晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，該酶具有兩個結(jié)構(gòu)域，存在于中間區(qū)域的溝可能包含UDP?財咸煙塹慕岷锨?域13。糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)測定將有助于我們深入研究

12、其催化特異性。    Gtfs的兩個顯著特征是：第一，在抗生素生物合成過程最后起作用，這一點使其在組合生物合成中能得到靈活的應(yīng)用，其底物結(jié)構(gòu)特異性的闡明可以為新結(jié)構(gòu)和新功能化合物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。Gtfs催化的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，己糖的C1通過三磷酸核苷的去磷酸來激活，從而在親電子的C1位置上捕獲糖基底物，然后經(jīng)親核攻擊，與糖苷配基的羥基結(jié)合。第二，大部分的糖基轉(zhuǎn)移酶可以催化活化的己糖結(jié)合到糖苷配基底物的羥基上，形成C?O糖苷，僅少數(shù)例外，如在rebeccamycin14和urdamycin13的衍生物中存在糖基通過C?N和C?C鍵與糖苷配基結(jié)合的化合物。安絲菌素的YM

13、G平板培養(yǎng)發(fā)酵物分離得到了安絲菌素酰胺N糖苷類化合物，其結(jié)構(gòu)中的糖基通過酰胺鍵上的N與糖苷配基骨架相連11。在urdamycin的生物合成中，可能是由于親核的C原子和酚類的羥基處于鄰位導(dǎo)致C?C糖苷鍵的形成12，但是催化C?N和C?C形成的糖基轉(zhuǎn)移酶其特異性還沒有得到深入的研究。    3.1  Gtfs的應(yīng)用研究    另外一種方法是在不同的宿主中異位表達Gtfs，這方面的例子包括在宿主S.erythraea中表達oleGII基因產(chǎn)生3?O?rhamnosyl?6?DEB、表達tylM2基因產(chǎn)生5?O?desosaminy

14、l(tylactone)18。    研究表明Gtfs對不同的糖分子具有底物適應(yīng)性，Salas的研究組創(chuàng)造出了共表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)把來源于elloramycin生物合成基因簇中的糖基合成基因盒(Cassette)和糖基轉(zhuǎn)移酶基因elMGT在一起成功地表達19。盡管很多糖基轉(zhuǎn)移酶的底物廣譜性已得到了證明，但仍有很多文獻還是報道了特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的存在，例如，C.cyanogenus中的UrdGT220和來自S.spheroid NCIMB11891的NovM21。勿庸置疑，隨著更多Gtfs編碼基因被發(fā)現(xiàn)以及作用機制的深入研究，在生物體內(nèi)進行抗生素糖基化修飾的策略

15、和模式也會增加。因此，建立多樣化的微生物工廠來生產(chǎn)不同糖基修飾的天然產(chǎn)物，如表達糖基化修飾的聚酮(PK)，非核糖體肽(NRP)和雜合的PK/NRP類抗生素，可以為篩選新活性化合物提供可能。    4  糖基轉(zhuǎn)移酶在組合生物合成的應(yīng)用    應(yīng)用遺傳學(xué)方法生產(chǎn)新型聚酮和多肽類化合物日益得到人們的重視，表面上看重組生物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一樣復(fù)雜，但是和聚酮、多肽合成酶的復(fù)雜性相比，由于催化去氧糖產(chǎn)生的酶及其反應(yīng)機制比較保守，因此重組合成糖基化的化合物更有實踐意義25。    西班牙的Sa

16、las研究組已經(jīng)建立了成功的基因克隆和表達系統(tǒng)用來生產(chǎn)活化的去氧糖，目的基因處于操縱子的下游，通過啟動子的控制可以在鏈霉菌中表達。在鏈霉菌Streptomyces albus中整合糖基轉(zhuǎn)移酶基因oleGII，導(dǎo)入合成L?布兄裉姨?(L?oleandrose)的質(zhì)粒后，合成紅霉素內(nèi)酯B(erythronolide B)，而整合糖基轉(zhuǎn)移酶基因elmGT后再導(dǎo)入生物合成L?查祥?糖(L?olivose)的質(zhì)粒pOLV可以成功生產(chǎn)特曲霉素(tetracenomycin C)26，27。    Staurosporine(十字孢堿)類化合物的結(jié)構(gòu)是由一個糖分子和一個雜環(huán)的吲

17、哚卡唑單元組成，通過化學(xué)手段較難得到，通過在一個生物體內(nèi)共表達rebeccamycin和其它staurosporine類化合物生物合成基因，分離鑒定了大約產(chǎn)生了30種staurosporine類衍生物28。通過遺傳學(xué)方法改變Gtfs的特異性有一定難度，Salas研究組通過共表達糖基生物合成基因盒、Gtfs基因(staN和staG)和staurosporine的生物合成基因成功地替代了天然附加在吲哚卡唑基團上的糖基，為糖基轉(zhuǎn)移酶在重組生物合成中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，證明重組生物合成在生產(chǎn)新的糖基化產(chǎn)物中較藥用化學(xué)更有利16。    4.1  使用產(chǎn)生菌作為細胞

18、工廠    用產(chǎn)生糖苷化合物的微生物作為細胞工廠，在基因的編碼區(qū)通過插入抗生素抗性標記或刪除部分基因進行敲除產(chǎn)生突變體，引入外源糖基轉(zhuǎn)移酶基因，使其利用細胞內(nèi)活化的糖分子和微生物次生代謝的中間體合成新的抗生素。這種方法已經(jīng)在很多生產(chǎn)菌株如紅霉素(erythromycin)29、普卡霉素(plicamycin)、urdamycin、酒霉素(methymycin)29和苦霉素(pikro?mycin)上得到應(yīng)用30。    Gtfs轉(zhuǎn)運不同的糖到配基骨架的特定C原子上，而用基因工程的方法改變糖在骨架上的位置更有意義，這一設(shè)想成功產(chǎn)生了雜合

19、的urdamycin和普卡霉素抗腫瘤藥物30。    4.2  使用非產(chǎn)生菌作為細胞工廠    在重組菌株的轉(zhuǎn)化實驗中，由于宿主不產(chǎn)生配基骨架，需要整合一個具有配基骨架生物合成基因的質(zhì)粒到宿主上或者把配基添加到培養(yǎng)基中，通過生物轉(zhuǎn)化進行修飾。糖分子則是通過轉(zhuǎn)移一個或多個含有必須基因的質(zhì)粒來提供，現(xiàn)在一些可以合成不同去氧己糖的質(zhì)粒已經(jīng)作為一種重要的工具被開發(fā)出來31。論文參考網(wǎng)     5  糖基轉(zhuǎn)移酶的研究前景    最近，在糖肽的生物合成系統(tǒng)中得到了Gt

20、fs的晶體，結(jié)構(gòu)測定表明這類Gtfs家族有兩個共同的結(jié)構(gòu)域。NDP?蔡墻岷系?C?捕耍?糖苷配基結(jié)合到N?捕?(AGV/GtfB，DVV/GtfA)13。這個兩裂的結(jié)構(gòu)僅僅由兩個肽連接到一起，提示混合和匹配各自的結(jié)構(gòu)域是可以實現(xiàn)的32，33。因此，DNA shuffling或相關(guān)酶定向進化可以構(gòu)建看似荒誕的Gtfs，改變其對己糖單元和配基的底物特異性，大大提高糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，為篩選到新活性糖苷類抗生素奠定基礎(chǔ)。    總之，在生物合成中研究糖基化模式的多樣性需要滿足三個要求。    (1)建立糖基轉(zhuǎn)移酶庫  通過重

21、組生物合成生產(chǎn)新的抗生素糖苷，必須建立糖基轉(zhuǎn)移酶的基因庫，才能使之在工業(yè)上得到深入應(yīng)用。隨著更多基因簇的序列測定，Gtfs的數(shù)目也會逐年增加，發(fā)現(xiàn)具有混合和匹配的N?不?C?捕說?Gtfs區(qū)域用于構(gòu)建雜合催化體系，改變配基和去氧糖的識別，可以為特定的去氧糖單元尋找新結(jié)合位點34。    (2)建立配基的化合物庫  這些化合物包括簡單的氨基香豆素類骨架(aminocoumarin scaffolds)、非核糖體肽(NRP)以及芳香化的聚酮配基25。但是，由相似酶催化進行C?N，C?C糖基化還有待于進一步的研究。    (3)建

22、立糖供體的化合物庫  糖供體要包括很多UDP或TDP活化的糖和去氧糖。天然去氧糖附加到配基上以后，賦予了配基新的活性。去氧糖的氨甲?；诤芏囝愋偷幕衔锶缇弁?新生霉素)、非核糖體肽(如替考拉寧)等抗生素中都存在，因此所有TDP?D?埠?TDP?L?踩跫禾茄萇?物在庫中都值得準備32，33。    6  總結(jié)    迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多與抗生素生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶，但現(xiàn)有的研究還不深入，對糖基化生物學(xué)意義、糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系、催化機制、糖苷的活化形式以及組合生物合成的應(yīng)用等有待進一步探討。沈月毛研究組發(fā)

23、現(xiàn)糖苷化與微生物的生長條件有關(guān)，同一個菌株在平板培養(yǎng)時產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物在液體培養(yǎng)時卻檢測不到。催化三種不同類型糖苷形成的糖基轉(zhuǎn)移酶之間在其作用機制及底物選擇性方面到底存在那些異同，都有賴于不同類型糖基轉(zhuǎn)移酶高級結(jié)構(gòu)的闡明，離實用化、產(chǎn)業(yè)化還有很長的一段路要走。 【參考文獻】  1 Thoroson J S, Hoster T J, Jiang J, et al. Natures carbohydrate chemists: the enzymatic glycosylation of bioactive bacterial metabolites J. Curr Org C

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