微生物學(xué)03病毒與亞病毒

1、第三章第三章 病毒與亞病毒病毒與亞病毒第一節(jié)第一節(jié) 病毒的性質(zhì)病毒的性質(zhì)第二節(jié)第二節(jié) 病毒的研究方法病毒的研究方法第三節(jié)第三節(jié) 病毒復(fù)制病毒復(fù)制第四節(jié)第四節(jié) 病毒的非增殖性感染病毒的非增殖性感染第五節(jié)第五節(jié) 亞病毒亞病毒第六節(jié)第六節(jié) 第一節(jié)第一節(jié) 病毒的性質(zhì)病毒的性質(zhì)一、一、形態(tài)結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu)二、二、病毒的化學(xué)組成病毒的化學(xué)組成三、病毒的理化抗性三、病毒的理化抗性100nm100nm以下。以下。核核( (衣衣) )殼殼+ +核酸或包膜（來源于核膜或細(xì)胞膜）。核酸或包膜（來源于核膜或細(xì)胞膜）。衣殼對稱類型衣殼對稱類型螺旋對稱螺旋對稱二十面體對稱二十面體對稱復(fù)合對稱復(fù)合對稱化學(xué)組成化學(xué)組成（一）病毒

2、的核酸（一）病毒的核酸（DNADNA或或RNARNA）1.1.正極性和負(fù)極性正極性和負(fù)極性F正極性正極性(+RNA)(+RNA)：可作為：可作為mRNAmRNA。F負(fù)極性負(fù)極性(-RNA)(-RNA)：與其：與其mRNAmRNA序列互補(bǔ)。序列互補(bǔ)。F雙意雙意RNARNA：正極性：正極性+ +負(fù)極性。負(fù)極性。FDNADNA：和和mRNAmRNA互補(bǔ)互補(bǔ)-DNA-DNA；和；和mRNAmRNA序列相似序列相似+DNA+DNA。2.2.感染性核酸（感染性核酸（infectious nucleic acidinfectious nucleic acid） 抽提分離的病毒核酸抽提分離的病毒核酸導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)

3、入細(xì)胞產(chǎn)生子代毒粒。產(chǎn)生子代毒粒。（二）病毒的蛋白質(zhì)（二）病毒的蛋白質(zhì) 含量多（含量多（40-90%40-90%）；種類少（一種或幾種）；多為結(jié)）；種類少（一種或幾種）；多為結(jié)構(gòu)蛋白，少為功能蛋白構(gòu)蛋白，少為功能蛋白( (酶酶 ) )。1.1.結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白（1 1）殼體蛋白：保護(hù)，）殼體蛋白：保護(hù)，參與吸附侵入?yún)⑴c吸附侵入。（2 2）包膜蛋白）包膜蛋白包膜糖蛋白：包膜糖蛋白：吸附，啟動感染和侵入。吸附，啟動感染和侵入?；|(zhì)基質(zhì)蛋白蛋白：支撐包膜，支撐包膜，介導(dǎo)核殼與包膜糖介導(dǎo)核殼與包膜糖蛋白蛋白的識別。的識別。三、理化抗性三、理化抗性 1.1.溫度溫度耐冷不耐熱耐冷不耐熱，離體，離體，56

4、566060，3030minmin滅活。滅活。保存：低溫真空干燥法保存：低溫真空干燥法( (-20-20-196)-196)；適量鹽溶液（適量鹽溶液（MgClMgCl2 2，MgSOMgSO4 4）可提高熱穩(wěn)定性。）可提高熱穩(wěn)定性。2.2.射線射線擊毀病毒核酸擊毀病毒核酸?；钚匀玖希ㄈ缂妆桨诽m、中性紅、丫啶橙）滲入并活性染料（如甲苯胺蘭、中性紅、丫啶橙）滲入并與與核酸結(jié)合核酸結(jié)合可見光滅活?？梢姽鉁缁?。3.pH3.pH：5.05.09.09.0穩(wěn)定穩(wěn)定。4.4.脂溶劑脂溶劑 破壞包膜破壞包膜，如乙醚、氯彷，如乙醚、氯彷分類的依據(jù)。分類的依據(jù)。5.5.化學(xué)消毒劑化學(xué)消毒劑 對氧化劑（如對氧化劑（

5、如高錳酸鉀高錳酸鉀、次氯酸鹽）次氯酸鹽）敏感；敏感；酒精、酸堿、環(huán)氧乙烷可殺滅。酒精、酸堿、環(huán)氧乙烷可殺滅。 6.6.抗生素抗生素 不敏感，不敏感，但患病須注射。但患病須注射。第二節(jié)第二節(jié) 病毒的研究方法病毒的研究方法一、分離與純化一、分離與純化二、效價測定二、效價測定一一 、分離純化、分離純化分離分離1.1.標(biāo)本采集與處理標(biāo)本采集與處理（1 1）采集：）采集：有足夠活病毒。有足夠活病毒。 如倒罐液，感染者血液、分泌物等。如倒罐液，感染者血液、分泌物等。（2 2）處理）處理除菌：采用抗生素、離心、過濾等；除菌：采用抗生素、離心、過濾等；接種接種接種與感染表現(xiàn)接種與感染表現(xiàn)（1 1）接種）接種考

6、慮宿主范圍、組織嗜性；考慮宿主范圍、組織嗜性；操作簡單、易培養(yǎng)、易判斷。操作簡單、易培養(yǎng)、易判斷。注：注：盲傳：第一次接種未出現(xiàn)癥狀，重復(fù)接種。盲傳：第一次接種未出現(xiàn)癥狀，重復(fù)接種。目的：提高效價。目的：提高效價。盲傳二代后，仍未癥狀盲傳二代后，仍未癥狀無病毒。無病毒。（2 2）感染表現(xiàn)）感染表現(xiàn) 噬菌斑、壞死斑（枯斑）、蝕斑（空斑）。噬菌斑、壞死斑（枯斑）、蝕斑（空斑）。 噬菌斑（噬菌斑（plaqueplaque） 噬菌體噬菌體平板培養(yǎng)物平板培養(yǎng)物圓形的透明區(qū)域。圓形的透明區(qū)域。噬菌斑噬菌斑壞死斑（枯斑）壞死斑（枯斑）植物病毒植物病毒敏感植物葉片敏感植物葉片壞損區(qū)域。壞損區(qū)域。蝕斑（空斑）蝕

7、斑（空斑）v動物病毒動物病毒細(xì)胞單層上細(xì)胞單層上病損區(qū)。病損區(qū)。v細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生“致細(xì)胞病變效應(yīng)致細(xì)胞病變效應(yīng)”（細(xì)胞聚集（細(xì)胞聚集成團(tuán)、腫大、融合成團(tuán)、腫大、融合，有包涵體有包涵體或裂或裂解）。解）。v包涵體包涵體(inclusion body)(inclusion body)光鏡下可見光鏡下可見、圓形、卵圓形或不定形的、圓形、卵圓形或不定形的蛋白質(zhì)結(jié)晶蛋白質(zhì)結(jié)晶。組成組成 多為病毒顆?；虿《緛喕欢酁椴《绢w?；虿《緛喕?； 少為細(xì)胞對感染的少為細(xì)胞對感染的反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)產(chǎn)物，無病毒粒子無病毒粒子。（二）、病毒的純化（二）、病毒的純化1.1.標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)（1 1）保持感染性；保持感染性；（

8、2 2）大小、形態(tài)、密度、組成及抗原性）大小、形態(tài)、密度、組成及抗原性均一均一。2.2.方法方法鹽析、等電點(diǎn)沉淀、凝膠層析、離子交換等；鹽析、等電點(diǎn)沉淀、凝膠層析、離子交換等；超速離心超速離心二、效價測定二、效價測定效價：效價：指指1mL1mL培養(yǎng)液或試樣培養(yǎng)液或試樣中病毒感染單位數(shù)中病毒感染單位數(shù)目（噬菌斑形成單位數(shù)或感染中心數(shù)）。目（噬菌斑形成單位數(shù)或感染中心數(shù)）。1.1.物理顆粒計(jì)數(shù)：電鏡。物理顆粒計(jì)數(shù)：電鏡。 2.2.感染性測定：測噬菌斑、枯斑感染性測定：測噬菌斑、枯斑( (須用石英砂須用石英砂摩擦葉片摩擦葉片) )和和數(shù)。數(shù)。底層培養(yǎng)基底層培養(yǎng)基2-4ml2-4ml上層培養(yǎng)基上層培養(yǎng)

9、基0.2ml0.2ml敏感菌懸液敏感菌懸液0.1ml0.1ml噬菌體試樣噬菌體試樣上上層層培培養(yǎng)養(yǎng)液液噬菌斑噬菌斑3737，12h12h雙層平板法雙層平板法一、病毒的增殖過程（一、病毒的增殖過程（E.coliE.coli T T4 4噬菌體）噬菌體） 吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放。吸附、侵入、生物合成、裝配和釋放。（一）吸附（一）吸附 1.1.特異性特異性 吸附蛋白（吸附蛋白（VAPVAP） 細(xì)胞受體（細(xì)胞受體（細(xì)胞生長必須細(xì)胞生長必須）。）。 2.2.原理：原理：空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，氫鍵、疏水性相互作用、，氫鍵、疏水性相互作用、范德華力。范德華力。（二）侵入（二）侵入1.1

10、.噬菌體：注射。噬菌體：注射。2.2.動物病毒動物病毒直穿細(xì)胞膜；直穿細(xì)胞膜；細(xì)胞內(nèi)吞：累積在細(xì)胞質(zhì)的小泡內(nèi)細(xì)胞內(nèi)吞：累積在細(xì)胞質(zhì)的小泡內(nèi)釋放；釋放；膜融合：包膜和細(xì)胞膜融合。膜融合：包膜和細(xì)胞膜融合。3.3.植物病毒：傷口或口器侵入。植物病毒：傷口或口器侵入。（三）生物合成（三）生物合成 1.1.特點(diǎn)：時序性。特點(diǎn)：時序性。 早期轉(zhuǎn)錄早期轉(zhuǎn)錄次早期轉(zhuǎn)錄次早期轉(zhuǎn)錄晚期基因表達(dá)。晚期基因表達(dá)。 以以E.coliE.coli的的T T偶數(shù)雙鏈?zhǔn)删w為例。偶數(shù)雙鏈?zhǔn)删w為例。 早期早期mRNAmRNA早期蛋白早期蛋白 ( (次早期次早期RNARNA聚合酶聚合酶) )次早期次早期mRNAmRNA次早期

11、次早期蛋白蛋白(DNA(DNA分解酶、分解酶、DNADNA、mRNAmRNA聚合酶聚合酶等等) )晚期晚期mRNAmRNA晚期蛋白晚期蛋白( (衣殼蛋白、裝配酶等衣殼蛋白、裝配酶等) )核酸核酸(DNA)(DNA)復(fù)制復(fù)制宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞RNARNA聚合酶聚合酶dsDNAdsDNA次早期次早期DNADNA晚期基因晚期基因核酸復(fù)制核酸復(fù)制dsDNAdsDNA、dsRNAdsRNA通過半保留復(fù)制。通過半保留復(fù)制。ssDNAssDNA或或ssRNAssRNA先合成雙鏈中間體先合成雙鏈中間體, ,再復(fù)制再復(fù)制。（2 2）病毒）病毒DNADNA復(fù)制有復(fù)制有6 6種方式種方式 雙鏈雙鏈DNADNA復(fù)制：半

12、保留方式。復(fù)制：半保留方式。單鏈單鏈DNADNA復(fù)制復(fù)制 所有所有ssDNAssDNA病毒的核酸均為病毒的核酸均為+DNA+DNA。先由先由+DNA+DNA DNA DNA -DNA -DNA mRNAmRNA和和+DNA+DNA。雙鏈雙鏈RNARNA復(fù)制復(fù)制 -RNA-RNAmRNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)dsRNAdsRNA模板模板子代子代dsRNAdsRNA。二、一步生長曲線（二、一步生長曲線（描述烈性噬菌體的復(fù)制描述烈性噬菌體的復(fù)制）1.1.具體操作具體操作敏感菌敏感菌+ +噬菌體噬菌體（10/1)10/1)。噬菌體抗血清噬菌體抗血清去除游離噬菌體去除游離噬菌體。將培養(yǎng)液高倍稀釋將培養(yǎng)液高

13、倍稀釋終止抗血清終止抗血清作用。作用。時間時間噬噬菌菌斑斑數(shù)數(shù)潛伏期潛伏期裂裂解解期期平穩(wěn)期平穩(wěn)期一步生長曲線一步生長曲線第四節(jié)第四節(jié) 非增殖性感染與缺損病毒非增殖性感染與缺損病毒1.1.流產(chǎn)感染流產(chǎn)感染（1 1）依賴于細(xì)胞依賴于細(xì)胞非允許細(xì)胞非允許細(xì)胞不能復(fù)制不能復(fù)制( (缺乏復(fù)制酶、缺乏復(fù)制酶、tRNAtRNA或或細(xì)胞因子細(xì)胞因子) )如：人腎細(xì)胞允許如：人腎細(xì)胞允許人腺病毒；猴腎細(xì)胞非允許。人腺病毒；猴腎細(xì)胞非允許。（2 2）依賴于病毒）依賴于病毒病毒基因組不完整。病毒基因組不完整。病毒病毒2.2.限制性感染限制性感染 細(xì)胞瞬時允許細(xì)胞瞬時允許，病毒不能復(fù)制或僅有少數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生病，病毒不能

14、復(fù)制或僅有少數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生病毒。如：人乳頭瘤病毒，毒。如：人乳頭瘤病毒，感染感染各分化期的上皮細(xì)胞各分化期的上皮細(xì)胞，不能晚期轉(zhuǎn)錄。，不能晚期轉(zhuǎn)錄。感染感染分化成熟的鱗狀上皮細(xì)胞分化成熟的鱗狀上皮細(xì)胞晚期轉(zhuǎn)錄。晚期轉(zhuǎn)錄。3.3.潛伏感染潛伏感染在細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)病毒，不破壞細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)病毒，不破壞細(xì)胞?？捎刹《净虮磉_(dá)，改變宿主可由病毒基因表達(dá)，改變宿主惡性細(xì)胞。惡性細(xì)胞。二、缺損病毒二、缺損病毒 主要為主要為基因組有缺陷基因組有缺陷，須依賴其他病毒才能復(fù)制。，須依賴其他病毒才能復(fù)制。1.1.干擾缺損病毒干擾缺損病毒 ( (干擾缺損顆粒干擾缺損顆粒) ) (defective interfer

15、ing particles)DI顆粒顆粒2.2.衛(wèi)星病毒衛(wèi)星病毒3.3.條件缺損病毒條件缺損病毒 4.4.整合的病毒基因組整合的病毒基因組1.DI1.DI顆粒顆粒 復(fù)制時產(chǎn)生的復(fù)制時產(chǎn)生的基因缺失突變體基因缺失突變體。 各病毒均可產(chǎn)生，在高各病毒均可產(chǎn)生，在高感染復(fù)數(shù)感染復(fù)數(shù)(m.o.i(m.o.i) )時產(chǎn)生頻率最時產(chǎn)生頻率最高。高。 m.o.im.o.i ：每一敏感細(xì)胞表面吸附病毒的數(shù)量。：每一敏感細(xì)胞表面吸附病毒的數(shù)量。 m.o.im.o.i=1-300=1-300 須依賴于同源完全病毒才能復(fù)制。須依賴于同源完全病毒才能復(fù)制。衛(wèi)星病毒：衛(wèi)星病毒：E.coliE.coli P P4 4噬菌

16、體噬菌體( (缺殼體蛋白編碼基因缺殼體蛋白編碼基因) )輔助病毒：輔助病毒：E.coliE.coli P P2 2噬菌體噬菌體殼體蛋白（合成殼體蛋白（合成P P4 4噬菌體外殼）噬菌體外殼）3.3.條件缺損病毒條件缺損病毒 條件致死突變體條件致死突變體，在允許條件，在允許條件正常增殖；非允許條件正常增殖；非允許條件流流產(chǎn)感染或死亡。產(chǎn)感染或死亡。4.4.整合的病毒基因組整合的病毒基因組 溫和噬菌體溫和噬菌體和和腫瘤病毒腫瘤病毒。游離噬菌體（游離態(tài)）游離噬菌體（游離態(tài)）原噬菌體（原噬菌體（整合態(tài)或質(zhì)粒形式整合態(tài)或質(zhì)粒形式）營養(yǎng)噬菌體（營養(yǎng)態(tài)）營養(yǎng)噬菌體（營養(yǎng)態(tài)）（2 2）溶源菌）溶源菌 特征特征

17、溶源性可遺傳溶源性可遺傳可（自發(fā)或誘發(fā)）裂解可（自發(fā)或誘發(fā)）裂解有免疫性有免疫性復(fù)愈：輻射或氮芥處理，有些菌體會失去原噬菌體。復(fù)愈：輻射或氮芥處理，有些菌體會失去原噬菌體。溶源轉(zhuǎn)變：除免疫性以外獲得新性狀。溶源轉(zhuǎn)變：除免疫性以外獲得新性狀。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感菌菌苔敏感菌菌苔溶源菌菌落溶源菌菌落透明裂解斑透明裂解斑（3 3）腫瘤病毒的整合感染腫瘤病毒的整合感染 腫瘤病毒（如乙肝病毒）或腫瘤病毒（如乙肝病毒）或RNARNA病毒，病毒，一定一定條件下可轉(zhuǎn)入復(fù)制循環(huán)，產(chǎn)生子代病毒。條件下可轉(zhuǎn)入復(fù)制循環(huán)，產(chǎn)生子代病毒。DNADNA病毒：直接整合。病毒：直接整合。RNARNA病毒：如逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒：如

18、逆轉(zhuǎn)錄病毒。一、衛(wèi)星一、衛(wèi)星RNARNA（擬病毒）（擬病毒）單鏈單鏈RNARNA片段片段，在輔助病毒衣殼內(nèi)，在輔助病毒衣殼內(nèi)，無單無單獨(dú)侵染性。獨(dú)侵染性。與輔助病毒與輔助病毒無明顯同源性無明顯同源性。衛(wèi)星衛(wèi)星RNARNA不同，對輔助病毒影響癥狀不同。不同，對輔助病毒影響癥狀不同。二、類病毒：二、類病毒：有單獨(dú)侵染性有單獨(dú)侵染性，單鏈環(huán)狀，單鏈環(huán)狀RNARNA，完全依靠宿，完全依靠宿主的細(xì)胞酶復(fù)制。主的細(xì)胞酶復(fù)制。（其（其RNARNA無無mRNAmRNA活性）活性）三、朊病毒：獨(dú)立復(fù)制、無免疫性的三、朊病毒：獨(dú)立復(fù)制、無免疫性的疏水性角蛋白。疏水性角蛋白。19821982年，美，年，美，prusinerprusiner發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)19961996年諾貝爾獎。年諾貝爾獎。引起的疾?。阂鸬募膊。?瘋牛?。ㄅ：＞d狀腦?。?；瘋牛?。ㄅ：＞d狀腦?。?； 羊癢疫（羊搔癢癥）；羊癢疫（羊搔癢癥）； 人的克人的克- -雅氏癥（老年癡呆癥）等。雅氏癥（老年癡呆癥）等。 防治痢疾桿菌、耐藥性的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌。防治痢疾桿菌、耐藥性的綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌。2.2.練習(xí)題練習(xí)題1.1.名詞：烈性噬菌體、噬菌斑、枯斑、蝕斑、包涵體、致名詞：烈性噬菌體、噬菌斑、枯斑、蝕斑、包涵體、致細(xì)胞病變效應(yīng)，