分子生物學(xué)技術(shù)考試答題要點(diǎn)

1、深圳大學(xué)研究生試題 答案學(xué) 院 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè) 細(xì)胞生物學(xué) 課程名稱 分子、生物學(xué)研究方法 擬題人 田生禮 唐玉林 審題人 1. 何謂載體？載體的必備條件有哪些？（9分）攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具。體外重組DNA實(shí)驗(yàn)中，將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具稱為載體(vector)，這也是一個(gè)DNA分子。1）克隆載體上要有復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體還需有啟動(dòng)子；2）載體上要有選擇標(biāo)記基因或報(bào)道基因；3）除了置換型的載體外，載體上具有多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，對(duì)一種限制酶來(lái)說(shuō)只能有一個(gè)。2. 采用末端標(biāo)記DNA探針是常用的分子生物學(xué)技術(shù)，請(qǐng)你先解釋分子生物學(xué)中核酸探針的概

2、念，請(qǐng)你采用至少兩種方法來(lái)標(biāo)記DNA探針。（10分）答題要點(diǎn)：核酸探針：是指利用雜交技術(shù)檢測(cè)特異核酸序列必須使用探針。一個(gè)探針可以是能檢測(cè)互補(bǔ)核酸序列的簡(jiǎn)單的DNA或RNA分子。末端標(biāo)記DNA探針可以有如下方法1）. 利用T7DNA聚合酶在沒(méi)有底物時(shí)，發(fā)揮它的35外切酶活性，隨后加入-32p-dGTP，發(fā)揮它的聚合酶活性標(biāo)記3端；2）. 利用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）處理，再用磷酸激酶在底物g-32p-dATP存在的情況下標(biāo)記DNA5端；3）. 利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶在底物-32p-dGTP存在的情況下標(biāo)記DNA的3端。3. 一個(gè)未知序列的真核cDNA片段，3和5端均為平末端，欲把其克隆到一個(gè)原

3、核表達(dá)載體中，并且可以獲得表達(dá)。采用哪些克隆策略可以成功克隆該基因（至少兩種方法）？如何證明克隆和表達(dá)成功？（提示：先克隆測(cè)序、再克隆、鑒定、表達(dá)、證明表達(dá)成功）（12分）答題要點(diǎn)：由于是一個(gè)未知序列的基因可以采用先克隆到測(cè)序載體的方法：1在載體上涌Smal I切割載體直接插入；2采用同聚物加尾克隆；3加人工接頭；4加銜接物?？寺『鬁y(cè)序。再根據(jù)成熟肽的序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增目的基因，通過(guò)酶切后克隆到表達(dá)載體；通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序確定克隆成功，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE電泳及western blot或質(zhì)譜鑒定和證明表達(dá)成功。4. 核酸分子雜交技術(shù)主要包括Southern Blot 和

4、Northern Blot，簡(jiǎn)述這兩個(gè)技術(shù)的原理和主要過(guò)程（步驟）。為什么Northern Blot檢測(cè)時(shí)還要雜交一個(gè)看家基因？（15分）答題要點(diǎn)：這兩個(gè)技術(shù)的基本原理是根據(jù)核酸同源序列互補(bǔ)的原理，在變性后核酸分子雙鏈打開(kāi)，復(fù)興后依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理重新形成雙鏈。這樣把其中的一條已知序列的核酸鏈標(biāo)記上同位素或地高辛就成為探針，可以檢測(cè)樣品中的未知序列。Southern Blot 是用于檢測(cè)基因組中是否有同源序列的存在，現(xiàn)將DNA通過(guò)限制性內(nèi)切酶沒(méi)切，電泳分離，變性轉(zhuǎn)膜，封閉，雜交和檢測(cè)等步驟；Northern Blot是用于檢測(cè)基因是有表達(dá)，因此要提取總RNA，進(jìn)行瓊脂糖變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封

5、閉，雜交和檢測(cè)。Northern Blot通常必須檢測(cè)看家基因的表達(dá)，以它為基準(zhǔn)確定目的基因的表達(dá)情況，否則將不能說(shuō)明表達(dá)水平的真正變化。5在蛋白定位、蛋白純化、蛋白相互作用分析等研究中常用的Epitope tags有多種。請(qǐng)嘗試?yán)闷渲兄?、二?lái)設(shè)計(jì)一方案，利用蛋白沉降(pull down)技術(shù)來(lái)研究?jī)傻鞍譇、B間的相互作用，并敘述該實(shí)驗(yàn)的原理。（12分）答題要點(diǎn)：獲得A、B基因的cDNA；選用Epitope tags如His6 tag，c-MYC tag，GST tag等；將A、B基因分別克隆到含His6 tag，c-MYC tag的大腸桿菌表達(dá)上；提取蛋白，用對(duì)應(yīng)的可純化這兩蛋白的純化柱

6、（鎳柱，sepharose-protein G-c-MYC抗體柱）純化蛋白；相互作用分析：將蛋白A、B在緩沖液中混合、作用；再與鎳柱或sepharose-protein G-c-MYC抗體柱結(jié)合，分析蛋白被沉降的可能性。注意設(shè)計(jì)對(duì)照（柱A，柱B，柱(A+B）；通過(guò)結(jié)合平衡清洗洗脫的環(huán)節(jié)，分別收集各環(huán)節(jié)的流出液，進(jìn)行蛋白電泳和western分析。6為了研究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶p107的作用方式和機(jī)制，以蓖麻子種子為材料，通過(guò)利用CO-IP技術(shù)，獲得了多個(gè)與p107蛋白相互作用的putative蛋白，其中之一是BTPC蛋白。為進(jìn)一步分析p107與BTPC間的相互作用，研究人員再次對(duì)這兩蛋白進(jìn)行了C

7、O-IP分析驗(yàn)證，結(jié)果如下圖。請(qǐng)分析圖中結(jié)果能說(shuō)明的問(wèn)題，這兩個(gè)蛋白間真的存在很強(qiáng)的相互作用嗎？你覺(jué)得，為了更清楚的得到正確結(jié)論，是否有必要同時(shí)對(duì)提取的總蛋白和洗脫之前的平衡清洗流出液進(jìn)行分析？（12分）Figure. Co-IP of p107 with interactor BTPC in developing castor oil seed. Clarified extracts from 8 g of endosperm tissue of developing castor oil seed were precleared through the pre-immune serum c

8、olumn prior to their elution through the anti-p107-IgG immuno-affinity column. Bound proteins were sequentially eluted with 25% gentle elution buffer (GEB, 溫和的洗脫液，pH 7.4), followed by 100 mM Gly-HCl (Glycine, 強(qiáng)洗脫液，pH 2.8). Concentrated eluates were analyzed by 10% SDS-PAGE (A; 5 mg protein per lane)

9、, and immunoblotting using anti-p107-IgG (B; 50 ng protein per lane) or anti-BTPC -IgG (C; 500 ng protein per lane).答題要點(diǎn)：A、SDS-PAGE之后考馬司亮藍(lán)染色，顯示溫和的洗脫和強(qiáng)洗脫流出液中蛋白存在的情況；B、C是蛋白電泳后wester-blot的結(jié)果，B：溫和的洗脫和強(qiáng)洗脫流出液中蛋白用抗p107的抗體檢測(cè)的結(jié)果，顯示p107存在于強(qiáng)洗脫流出液中，即表明p107被anti-p107-IgG immuno-affinity column有效結(jié)合；B：溫和的洗脫和強(qiáng)洗脫流出液

10、中蛋白用抗BTPC的抗體檢測(cè)的結(jié)果，顯示BTPC在溫和洗脫的情況下即被洗脫。說(shuō)明BTPC與 p107的結(jié)合不牢固。為了更清楚的得到正確結(jié)論，有必要同時(shí)對(duì)提取的總蛋白和洗脫之前的平衡清洗流出液進(jìn)行分析。7下圖是研究轉(zhuǎn)錄因子GTL1與PHYA啟動(dòng)子相互作用的結(jié)果。分析圖B、C，指出各結(jié)果說(shuō)明的問(wèn)題。（12分）Figure. Transcription factor GTL1 binds to PHYApromoters.(A) Schematic diagram of the GTL1 protein, showing the four helical, N- and C-terminal DNA

11、 binding domains (represented as gray cylinders). Two protein fragments (Nt1 and GTL1N) were fused with MBP.(B) Nt1 and GTL1N polypeptides and a biotin-labeled rice PHYA promoter fragment (400 ng) were used for EMSA. In (B), free probe and GTL1N-probe complexes are indicated by an asterisk and arrow

12、s, respectively.(C) Unlabeled PHYA promoter (2 mg) was used as a competitor to determine the specificity of DNA binding activity for GTL1N.答題要點(diǎn)：A . GTL1結(jié)構(gòu)示意圖B. GTL1N可與生物素標(biāo)記的PHYA啟動(dòng)子結(jié)合形成GTL1N-PHYA啟動(dòng)子探針 復(fù)合物，使探針在非變性電泳過(guò)程中泳動(dòng)速度變慢，而Nt1不能使探針在非變性電泳過(guò)程中泳動(dòng)速度變慢，即不能與PHYA啟動(dòng)子結(jié)合；C. GTL1N可與生物素標(biāo)記的PHYA啟動(dòng)子結(jié)合形成GTL1N-PHYA啟

13、動(dòng)子探針 復(fù)合物，使探針在非變性電泳過(guò)程中泳動(dòng)速度變慢，而在加入非標(biāo)記的GTL1N-PHYA啟動(dòng)子時(shí)，可競(jìng)爭(zhēng)與GTL1N結(jié)合，說(shuō)明GTL1N-PHYA啟動(dòng)子間的結(jié)合具有專一性。結(jié)果表明GTL1N結(jié)合在PHYA啟動(dòng)子上主要是通過(guò)N-端的第3、4個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。8以下三幅圖分別是研究蛋白激酶A的活性與actin結(jié)合蛋白cofilin之間關(guān)系的結(jié)果圖。根據(jù)這三個(gè)結(jié)果寫(xiě)一個(gè)摘要。（提示：FSK（forskolin）毛喉素：它是一種腺苷酸環(huán)化酶特異性激活劑，F(xiàn)SK上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，活化PKA信號(hào)途徑；cofilin：是一種actin結(jié)合蛋白，控制actin的聚合和解聚；Pcofilin是磷酸化

14、的cofilin；PKI：蛋白酶抑制劑；WT：wild type； MEFs：Mouse embryonic fibroblast）（18分）Figure. Activation of PKA cause enhanced pcofilin levels and morphological changes. (A) immunoblot analysis of pcofilin and cofilin levels in Wt(+/+) and knockout(-/-) MEFs treated with forskolin(20 M) or PKI(5 M) for 24h. (B) morphological and growth changes induced in high-density WT MEFs treated with forskolin for 24h. (C) Time-course analysis of pcofilin levels in hele cells treated with 20 M or 40 M答案要點(diǎn)：目的：為研究FSK通過(guò)Pcofilin的變化對(duì)MEBs細(xì)胞形態(tài)變化的影響，研究了Pcofilin的變化和MEBs細(xì)胞形態(tài)變化。方法：利用MEFs細(xì)胞、Hela細(xì)胞、免疫雜交技術(shù)（westernblot）和顯微