復(fù)習(xí)專題基因工程基本操作程序

1、復(fù)習(xí)專題基因工程基本操作程序 1獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫(kù)獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫(kù) 中獲取目的基因和利用中獲取目的基因和利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基技術(shù)擴(kuò)增目的基 因。因。 2基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的 第二步，也是基因工程的核心。第二步，也是基因工程的核心。 3一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因一個(gè)基因表達(dá)載體的組成，除了目的基因 外，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等外，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等 。4將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花 粉

2、管通道法。粉管通道法。5培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞一般是受精卵，目的基因的導(dǎo)入方培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞一般是受精卵，目的基因的導(dǎo)入方 法常用顯微注射技術(shù)。法常用顯微注射技術(shù)。6檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入和轉(zhuǎn)錄，常用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)是否翻檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入和轉(zhuǎn)錄，常用分子雜交技術(shù)；檢測(cè)是否翻 譯，常用抗原譯，常用抗原抗體雜交技術(shù)。抗體雜交技術(shù)。自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 1目的基因目的基因 (1)主要是指主要是指 的基因。的基因。 (2)也可以是一些具有也可以是一些具有 的因子。的因子。 2獲取方法獲取方法 (1)從基因文庫(kù)中獲取：從基因文庫(kù)中獲?。?基因文庫(kù)的含義：將含有某種生物不同基因的

3、許基因文庫(kù)的含義：將含有某種生物不同基因的許多多 ，導(dǎo)入，導(dǎo)入 的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因。有這種生物的不同的基因。編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì)調(diào)控作用調(diào)控作用DNA片段片段受體菌受體菌(2)利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：技術(shù)擴(kuò)增目的基因：原理：原理： 。前提條件：有一段已知目的基因的前提條件：有一段已知目的基因的 ，以便根據(jù)，以便根據(jù)這一序列合成這一序列合成 。條件：條件：DNA模板、模板、 、 和和4種脫氧核種脫氧核苷酸。苷酸。DNA復(fù)制復(fù)制核苷酸序列核苷酸序列引物引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶引物引物擴(kuò)增過(guò)程：擴(kuò)增過(guò)程：受熱受熱引物引

4、物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶（3） 1探討基因文庫(kù)、基因組文庫(kù)、探討基因文庫(kù)、基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)之間的關(guān)系。文庫(kù)之間的關(guān)系。 提示：基因組文庫(kù)含有一種生物的全部基因，而提示：基因組文庫(kù)含有一種生物的全部基因，而cDNA文文庫(kù)只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫(kù)。庫(kù)只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫(kù)。 2從酶的角度分析從酶的角度分析PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增DNA與與DNA體內(nèi)復(fù)制的體內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)。不同點(diǎn)。 提示：提示：PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增DNA不需要解旋酶；不需要解旋酶；PCR技術(shù)需技術(shù)需要的要的DNA聚合酶應(yīng)具有熱穩(wěn)定性。聚合酶應(yīng)具有熱穩(wěn)定性。跟隨名師跟隨名師解疑難解

5、疑難1提取目的基因方法的比較提取目的基因方法的比較方方法法基因文庫(kù)的構(gòu)建基因文庫(kù)的構(gòu)建PCR技術(shù)技術(shù)擴(kuò)增擴(kuò)增人工合成人工合成基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)(如如cDNA文庫(kù)文庫(kù))過(guò)過(guò)程程供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的DNA 限制酶限制酶許多許多DNA片段片段 連接連接表達(dá)載體表達(dá)載體 導(dǎo)入導(dǎo)入受體細(xì)胞受體細(xì)胞 外源外源DNA擴(kuò)增，產(chǎn)生擴(kuò)增，產(chǎn)生特定性狀特定性狀 分離分離目的基因目的基因目的基因的目的基因的mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄單鏈單鏈DNA 合成合成雙鏈雙鏈DNA 插入插入載體載體 導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌群受體菌群(cDNA文庫(kù)文庫(kù)) 分離分離目的基因目的基因目的基因目的基因DNA 高溫高溫

6、解鏈解鏈單鏈單鏈DNA 與引與引 物結(jié)合物結(jié)合 、DNADNA 聚合聚合 酶酶大量目大量目的基因的基因蛋白質(zhì)的氨蛋白質(zhì)的氨基酸序列基酸序列 推測(cè)推測(cè)mRNA的核的核苷酸序列苷酸序列 推測(cè)推測(cè)基因的核基因的核苷酸序列苷酸序列 化學(xué)化學(xué) 合成合成目的基因目的基因方方法法基因文庫(kù)的構(gòu)建基因文庫(kù)的構(gòu)建PCR技術(shù)技術(shù)擴(kuò)增擴(kuò)增人工合成人工合成基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文部分基因文庫(kù)庫(kù)(如如cDNA文庫(kù)文庫(kù))優(yōu)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單專一性強(qiáng)專一性強(qiáng)可在短時(shí)可在短時(shí)間內(nèi)大量間內(nèi)大量擴(kuò)增目的擴(kuò)增目的基因基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)，專一性強(qiáng)，可產(chǎn)生自然可產(chǎn)生自然界中不存在界中不存在的新基因的新基因缺缺點(diǎn)點(diǎn)工作量大、工作量大、

7、盲目性大、盲目性大、專一性差專一性差操作過(guò)程較麻操作過(guò)程較麻煩，技術(shù)要求煩，技術(shù)要求過(guò)高過(guò)高需要嚴(yán)格需要嚴(yán)格控制溫度，控制溫度，技術(shù)要求技術(shù)要求高高適用范圍小適用范圍小2PCR技術(shù)與生物體內(nèi)技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)區(qū)區(qū)別別解旋解旋方式方式解旋酶催化解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋在高溫作用下變性解旋場(chǎng)所場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi)主要在細(xì)胞核內(nèi))細(xì)胞外細(xì)胞外(主要在主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增儀內(nèi))酶酶DNA解旋酶、普通的解旋酶、普通的DNA聚合聚合酶等酶等耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)溫度溫度條件條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件細(xì)胞內(nèi)溫

8、和條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行合成合成的對(duì)的對(duì)象象DNA分子分子DNA片段或基因片段或基因聯(lián)系聯(lián)系模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成原料：均為四種脫氧核苷酸原料：均為四種脫氧核苷酸酶：均需要酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化聚合酶進(jìn)行催化引物：均需要引物，使引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3端開(kāi)始連接脫氧端開(kāi)始連接脫氧核苷酸核苷酸 特別提醒特別提醒 (1)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才比較有利于基因的表達(dá)。動(dòng)子才比較有利于基因的

9、表達(dá)。 (2)通過(guò)通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞中無(wú)法轉(zhuǎn)錄。編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞中無(wú)法轉(zhuǎn)錄。 (3)熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶聚合酶(Taq聚合酶聚合酶)能在高溫下保持其能在高溫下保持其活性，是活性，是PCR技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 1基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中目的：使目的基因在受體細(xì)胞中 ，并且可以，并且可以遺傳和遺傳和 。 (2)組成：組成：穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在表達(dá)表達(dá) 2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 (1)導(dǎo)入植物細(xì)胞的

10、方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：TDNA雙子葉植物雙子葉植物裸子裸子 ：常用于單子葉植物。：常用于單子葉植物?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ耗康幕蚪柚ǚ酃芡ǖ肋M(jìn)入受體細(xì)胞?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ耗康幕蚪柚ǚ酃芡ǖ肋M(jìn)入受體細(xì)胞。(2)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：方法：方法： 技術(shù)。技術(shù)。常用受體細(xì)胞：常用受體細(xì)胞： 。植物植物基因槍法基因槍法顯微注射顯微注射受精卵受精卵 (3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞：導(dǎo)入微生物細(xì)胞： 原核生物特點(diǎn)：原核生物特點(diǎn)： 、多為、多為 、遺傳物質(zhì)、遺傳物質(zhì)相對(duì)相對(duì) 等。等。 方法：感受態(tài)細(xì)胞法，即用方法：感受態(tài)細(xì)胞法，即用 處理細(xì)胞，使細(xì)處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)

11、境中DNA分子的生理狀態(tài)分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)這種細(xì)胞稱為胞稱為 )。繁殖快繁殖快單細(xì)胞單細(xì)胞Ca2較少較少感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 1思考基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要哪些工具酶。思考基因表達(dá)載體的構(gòu)建需要哪些工具酶。 提示：限制酶、提示：限制酶、DNA連接酶。連接酶。 2結(jié)合教材結(jié)合教材P13資料卡分析，用花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)資料卡分析，用花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)胞的目的基因是否需要和載體結(jié)合？試分析原因。胞的目的基因是否需要和載體結(jié)合？試分析原因。 提示：需要。因?yàn)槟康幕蛑挥泻洼d體結(jié)合成基因表達(dá)載提示：需要。因?yàn)槟康幕蛑挥泻洼d體結(jié)合成基因表達(dá)載體才容易在受體細(xì)胞中穩(wěn)定維持和表達(dá)。體才容易在受體細(xì)

12、胞中穩(wěn)定維持和表達(dá)。 3為什么動(dòng)物的體細(xì)胞不能作為受體細(xì)胞？為什么動(dòng)物的體細(xì)胞不能作為受體細(xì)胞？ 提示：動(dòng)物體細(xì)胞全能性受到限制，不能發(fā)育為一個(gè)新個(gè)提示：動(dòng)物體細(xì)胞全能性受到限制，不能發(fā)育為一個(gè)新個(gè)體。體。跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成一個(gè)重組連接酶，形成一個(gè)重組DNA分子分子(重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過(guò)程如。構(gòu)建過(guò)程如圖所示：圖所示：2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法比較將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法比較受體受體細(xì)胞細(xì)胞植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)

13、物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用常用方法方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞法受體受體細(xì)胞細(xì)胞體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵受精卵原核細(xì)胞原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過(guò)程過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入將目的基因插入Ti質(zhì)粒質(zhì)粒的的TDNA上上轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的整合到受體細(xì)胞的DNA上上提純含目的基提純含目的基因的表達(dá)載體因的表達(dá)載體顯微注射顯微注射受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育具有新性具有新性狀的個(gè)體狀的個(gè)體Ca2處理細(xì)胞處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞基因表達(dá)載體與

14、基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞吸收吸收DNA分子分子 特別提醒特別提醒 (1)完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和完成基因表達(dá)載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因目的基因，目的基因目的基因，目的基因運(yùn)運(yùn)載體和運(yùn)載體載體和運(yùn)載體運(yùn)載體三種。運(yùn)載體三種。 (2)將基因表達(dá)載體將基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2處理法。處理法。Ca2(或或CaCl2溶液溶液)對(duì)微生物細(xì)胞的作用是增加對(duì)微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。細(xì)胞壁的通透性。自讀教材自讀教材夯

15、基礎(chǔ)夯基礎(chǔ)1分子水平的檢測(cè)分子水平的檢測(cè)(連線連線)2個(gè)體水平的鑒定個(gè)體水平的鑒定(1) 的接種實(shí)驗(yàn)。的接種實(shí)驗(yàn)。(2)對(duì)基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行對(duì)基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行 ?？瓜x(chóng)或抗病抗蟲(chóng)或抗病活性比較活性比較 1檢測(cè)棉花中導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因是否表達(dá)的最簡(jiǎn)便的方法檢測(cè)棉花中導(dǎo)入的抗蟲(chóng)基因是否表達(dá)的最簡(jiǎn)便的方法是什么？是什么？ 提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，觀察棉鈴蟲(chóng)是否死亡。提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲(chóng)，觀察棉鈴蟲(chóng)是否死亡。 2DNA分子雜交的原理是什么？有哪些應(yīng)用？分子雜交的原理是什么？有哪些應(yīng)用？ 提示：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則?？捎糜谟H子鑒定、刑事偵查、提示：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則?？捎糜谟H子鑒定、

16、刑事偵查、生物親緣關(guān)系確定等。生物親緣關(guān)系確定等。跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 目的基因的檢測(cè)與鑒定歸納目的基因的檢測(cè)與鑒定歸納 例例1為從根本上解決水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶為從根本上解決水稻中的高植酸問(wèn)題，可將植酸酶基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸基因?qū)胨?，培育低植酸轉(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。酶基因的流程。 據(jù)圖回答：據(jù)圖回答： (1)圖中基因組文庫(kù)圖中基因組文庫(kù)_(填填“小于小于”“等于等于”或或“大于大于”)cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。 (2)B過(guò)程需要的酶是過(guò)程需要的酶是_；A、C過(guò)程中過(guò)程中_(填填“可以可以”或或“不可以不可以”)使用同一種

17、探針篩選含目的基因的菌株。使用同一種探針篩選含目的基因的菌株。 (3)目的基因目的基因和和除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中別利用圖中_和和_為模板直接進(jìn)行為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是_。 思路點(diǎn)撥思路點(diǎn)撥 精講精析精講精析分析獲取植酸酶基因的流程圖可知，圖中分析獲取植酸酶基因的流程圖可知，圖中基因組文庫(kù)大于基因組文庫(kù)大于cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。B過(guò)程需要的酶應(yīng)該是逆轉(zhuǎn)錄酶；過(guò)程需要的酶應(yīng)該是逆轉(zhuǎn)錄酶；A、C過(guò)程雖然都能獲得含目的基因的菌株，但過(guò)程雖然都能獲得含目的基因的菌株，但C中無(wú)內(nèi)含子中無(wú)內(nèi)含

18、子對(duì)應(yīng)的序列，所以不可以使用同一種探針進(jìn)行篩選。目的基對(duì)應(yīng)的序列，所以不可以使用同一種探針進(jìn)行篩選。目的基因因和和除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中除可從構(gòu)建的文庫(kù)中分離外，還可以分別利用圖中DNA和和cDNA為模板直接進(jìn)行為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的擴(kuò)增，該過(guò)程中所用酶的顯著特點(diǎn)是耐高溫。顯著特點(diǎn)是耐高溫。 答案答案(1)大于大于 (2)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶不可以不可以 (3)DNAcDNA耐高溫耐高溫 (2)表達(dá)：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成表達(dá)：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成RNA，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的mRNA只有外顯子對(duì)應(yīng)

19、部分。因只有外顯子對(duì)應(yīng)部分。因此，以此，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒(méi)有內(nèi)含子、為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒(méi)有內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子。啟動(dòng)子和終止子。下列關(guān)于下列關(guān)于cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說(shuō)法中，不正確的是文庫(kù)和基因組文庫(kù)的說(shuō)法中，不正確的是()AcDNA文庫(kù)中的文庫(kù)中的DNA來(lái)源于來(lái)源于mRNA的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程B如果某種生物的如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組 文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同，則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的性狀相同，則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu) 也完全相同也完全相同CcDNA文庫(kù)中的基因都沒(méi)有啟動(dòng)

20、子文庫(kù)中的基因都沒(méi)有啟動(dòng)子D一種生物的一種生物的cDNA文庫(kù)可以有許多種，但基因組文庫(kù)只有一文庫(kù)可以有許多種，但基因組文庫(kù)只有一 種種解析：由于基因轉(zhuǎn)錄時(shí)只有編碼區(qū)段才能轉(zhuǎn)錄，所以以解析：由于基因轉(zhuǎn)錄時(shí)只有編碼區(qū)段才能轉(zhuǎn)錄，所以以mRNA反反轉(zhuǎn)錄成的轉(zhuǎn)錄成的DNA就只有外顯子區(qū)段，而缺少內(nèi)含子和啟動(dòng)子等非編就只有外顯子區(qū)段，而缺少內(nèi)含子和啟動(dòng)子等非編碼區(qū)段，和原來(lái)的基因結(jié)構(gòu)不相同。碼區(qū)段，和原來(lái)的基因結(jié)構(gòu)不相同。答案：答案：B. . 例例2右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoR、BamH的酶切位點(diǎn)，的酶切

21、位點(diǎn)，ampr為青霉素抗性基為青霉素抗性基因，因，tetr為四環(huán)素抗性基因，為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)子，為啟動(dòng)子，T為為終止子，終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoR、BamH在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。 據(jù)圖回答：據(jù)圖回答： (1)將含有目的基因的將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用與質(zhì)粒分別用EcoR酶切，酶酶切，酶切產(chǎn)物用切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連片段之間連接形成的產(chǎn)物有接形成的產(chǎn)物有_、_、_三種。三種。 (2)用上述用上述3種連接產(chǎn)物與無(wú)任何

22、抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)種連接產(chǎn)物與無(wú)任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物有能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物有_；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物有的連接產(chǎn)物有_。 (3)目的基因表達(dá)時(shí)，目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是_，其合成的產(chǎn)物是，其合成的產(chǎn)物是_。 (4)在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止

23、目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是_。思路點(diǎn)撥思路點(diǎn)撥 精講精析精講精析(1)將含有目的基因的將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用與質(zhì)粒分別用EcoR酶切，所產(chǎn)生的黏性末端相同，用酶切，所產(chǎn)生的黏性末端相同，用DNA連接酶處理后，連接酶處理后，不同的片段隨機(jī)結(jié)合，可形成不同的片段隨機(jī)結(jié)合，可形成3種不同的連接物：目的基因種不同的連接物：目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因運(yùn)載體、運(yùn)載體運(yùn)載體、運(yùn)載體運(yùn)載體。運(yùn)載體。 (2)在上述三種產(chǎn)物中，插入目的基因的都不能在四環(huán)素在上述三種產(chǎn)物中，插入目的基因的都不能在四環(huán)素培養(yǎng)基上

24、生長(zhǎng)，只有運(yùn)載體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只有運(yùn)載體運(yùn)載體連接產(chǎn)物才能在含四環(huán)運(yùn)載體連接產(chǎn)物才能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。 (3)啟動(dòng)子是啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，合成過(guò)程，合成mRNA。 (4)由圖示和題目中提供的信息可知，同時(shí)運(yùn)用由圖示和題目中提供的信息可知，同時(shí)運(yùn)用EcoR和和BamH進(jìn)行酶切可有效防止酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意進(jìn)行酶切可有效防止酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連連接。接。 答案答案(1)目的基因目的基因載體連接物載體連接物載體載體載體連接物載體連接物目的基因目的基因目的基因連接物目的基因連接物 (2)載體載體載體

25、連接物載體連接物目的基因目的基因載體連接物、載載體連接物、載體體載體連接物載體連接物 (3)啟動(dòng)子啟動(dòng)子mRNA (4)EcoR和和BamH (1)切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)并非只能用一種酶，但無(wú)論用切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)并非只能用一種酶，但無(wú)論用幾種酶，一般都用相同種類(lèi)的酶切割目的基因和運(yùn)載體。幾種酶，一般都用相同種類(lèi)的酶切割目的基因和運(yùn)載體。 (2)啟動(dòng)子啟動(dòng)子起始密碼，終止子起始密碼，終止子終止密碼。終止密碼。啟動(dòng)子和終止子位于基因結(jié)構(gòu)的非編碼區(qū)，起始密碼和終止密啟動(dòng)子和終止子位于基因結(jié)構(gòu)的非編碼區(qū)，起始密碼和終止密碼位于碼位于mRNA上。上。 例例3農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運(yùn)用。下件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運(yùn)用。下面是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問(wèn)題：面是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問(wèn)題： (1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是_，利用農(nóng)，利用農(nóng)桿菌自然條件下感染植物的特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)桿菌自然條件下感染植物的特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)_。具體原理是在農(nóng)桿。具體原理是在農(nóng)桿菌的