淺議雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細胞衰老的作用

1、淺議雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細胞衰老的作用        【摘要】目的 探討雙歧桿菌脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)在延緩H2O2誘導細胞衰老中的作用。方法 H2O2誘導WI38細胞衰老,半乳糖苷酶細胞化學染色計算衰老細胞百分率變化,RTPCR和Western印跡檢測衰老細胞p21、細胞周期蛋白E(cyclin E)和周期蛋白依賴性蛋白激酶2(CDK2)表達水平的變化。結(jié)果 雙歧桿菌LTA處理后,半乳糖苷酶細胞化學染色陽性細胞百分率較衰老模型組降低(P<0.01)。與年輕對照組相比,衰老模型組細胞中p

2、21的表達增高,cyclin E和CDK2表達降低,而雙歧桿菌LTA能夠逆轉(zhuǎn)上述變化(P<0.01)。結(jié)論 雙歧桿菌能延緩H2O2誘導的細胞衰老,機制可能與改變p21,cyclin E和CDK2表達水平有關(guān)。     Effect mechanism of lipoteichoic acid of Bifidobacterium on delaying cell aing     PENG YanHua, WANG Yue, LIU JianLong, et al.     Key Laborato

3、ry of Laboratory Medical Diagnostics of Ministry of Education, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China     【Abstract】  Objective  To explore the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Bifidobacterium on delaying cell aging induc

4、ed by H2O2. Methods  WI38 cell aging was induced by H2O2. galactosidase (gal) cytochemistry staining was used to evaluate the percent of aging cell the mRNA protein levels of p21, cyclin E CDK2 were detected by RTPCR Western blot. Results  Treatment with LTA(5, 10 g/ml)led to a significant

5、 increase in the proportion of galpositive cells (P<0.01) markedly decreased the mRNA protein levels of p21 increased the mRNA protein levels of cyclin E CDK2 in WI38 cells in aging model group (all P<0.01). Conclusions  LTA of Bifidobacterium can delay cell aging induced by H202, whose m

6、echanism may have relation with change the expressions of p21, cyclin E CDK2.     【Key words】  Bifidobacterium; Lipoteichoic acid; Cellaging; H2O2     在體外,人胚肺二倍體成纖維細胞已成為經(jīng)典的復制性細胞衰老模型,而多種刺激物能誘導年輕細胞出現(xiàn)與復制性衰老相似的特征,被稱為應(yīng)激誘導早熟性老化(stressinduced premature senescence,SIPS),其中

7、H2O2是最常用的氧化應(yīng)激引發(fā)細胞SIPS誘導劑1,2。雙歧桿菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)已被證實具有抗氧化的作用,能夠有效延緩衰老3,但其機制并不是很清楚。本研究用H2O2誘導人胚肺成纖維細胞WI38出現(xiàn)SIPS,觀察雙歧桿菌LTA是否具有抗細胞衰老的作用,以及WI38細胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表達水平的變化,探討雙歧桿菌LTA抗細胞衰老的細胞周期調(diào)控機制。     1  材料和方法     1.1 材料     雙歧桿菌LT

8、A由本實驗室參考Sutcliffe法4從兩歧雙歧桿菌中提取,人胚肺成纖維細胞WI38細胞(20代)購于中國科學院細胞庫,胎牛血清和MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,H2O2購自Sigma公司;p21、CDK2、cyclin E和GAPDH引物序列由Invitrogen公司合成,RTPCR試劑盒購自Promega公司,p21、cyclin E單克隆抗體和CDK2多克隆抗體購自北京中山公司,衰老特異性半乳糖苷酶原位染色試劑盒,購自上海杰美公司,Western印跡化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國KPL公司。     1.2 方法     1.2

9、.1 細胞培養(yǎng)     WI38細胞接種于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(另外加入2 mmol/L谷氨酰胺,1.0 mmol/L丙酮酸鈉,0.1 mmol/L非必需氨基酸),置37,5% CO2條件下培養(yǎng)至2235代用于實驗。     1.2.2 細胞處理5和分組  模型組將細胞接種于24孔培養(yǎng)板,每孔2×105個細胞,待細胞長滿培養(yǎng)板的70%左右(避免細胞匯合),加160 mol/L H2O2作用2 h,用無血清培養(yǎng)基清洗3次,再加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h;雙歧桿菌LTA處理組在加160 mol/L

10、H2O2同時分別加入5、10、20 g/ml LTA, 同時做年輕對照組。     1.2.3  半乳糖苷酶細胞化學染色     按照說明書操作,染成藍色的細胞為半乳糖苷酶染色陽性細胞,每組同時做4個復孔,每孔計數(shù)400個細胞,計算半乳糖苷酶染陽性百分率。     1.2.4  p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達水平     逆轉(zhuǎn)錄參閱Promega RT說明書:2 g RNA+0.5 g olig(dT)+無RNAase水,終體積15 l,

11、70 變性5 min,立即放進冰中冷卻,隨后在上述體系中加入MMLV 1 l,dNTP 1.25 l,RNAase 0.6 l,MMLV 5×緩沖液 5 l,加水至25 l,42 60 min,95 5 min,冰浴5 min。PCR的反應(yīng)體系:PCR緩沖液5 l,MgCl2 1.8 l,滅菌水19.4 l, Promega Taq酶0.2 l,上游引物1 l,下游引物1 l, dNTP 0.6 l,cDNA 2 l,共30 l。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件:為94 3 min預(yù)變性;94 35 s,59 35 s(p21,cyclin E和CDK2), 61 30 s(GAPDH

12、),72 45 s,32個循環(huán);72 5 min;取PCR擴增產(chǎn)物5 l上樣于10 g/L瓊脂糖電泳,在BioRad凝膠成像儀上觀察并保存結(jié)果,光密度分析。表1  引物序列及擴增產(chǎn)物大小(略)     1.2.5  p21、cyclin E和CDK2蛋白表達水平     處理后的細胞用預(yù)冷的細胞裂解液提取蛋白,用蛋白提取液樣品作SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,封閉, 轉(zhuǎn)至PVDG膜,室溫下封閉2 h后,一抗(1200稀釋)4下孵育過夜,0.01 mol/L PBST洗滌5次,每次5 min,與二抗(11 000稀釋)室溫

13、下孵育2 h,洗滌后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測,待條帶顯示清楚后終止反應(yīng)。結(jié)果用quantity one軟件分析。     1.3 統(tǒng)計學處理     實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS 12.0軟件分析,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。     2 結(jié) 果     2.1 雙歧桿菌LTA對H2O2誘導細胞衰老的影響     衰老模型組的半乳糖苷酶陽性細胞率(71%)明顯高于青年對照組(10%)和5 g/ml LTA處理組(21%)及10

14、 g/ml LTA處理組(35%)(P<0.01),表明雙歧桿菌LTA能夠延緩由H2O2誘導的細胞衰老,但20 g/ml LTA處理組(69%)無明顯作用。見圖1。     2.2  雙歧桿菌LTA對WI38細胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達的影響     與年輕對照組比較,模型組WI38細胞的p21 mRNA表達顯著增加(P<0.01),cyclin E和CDK2 mRNA表達明顯下降(P<0.01);經(jīng)5 g/ml和10 g/ml雙歧桿菌LTA處理后,其細胞內(nèi)p21 mRNA表達較模型組明顯下降(P<0.01),cyclin E和CDK2 mRNA表達較模型組明顯增高(P<0.01),其中尤以5 g/ml LTA組變化最明顯。見表2、圖2。表2  雙歧桿菌LTA對WI38細胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達的影響(略)     2.3  雙歧桿菌LTA對H2O2誘導WI38細胞衰老過程中蛋白表達的影響     與年輕對照組比較,模型組WI38細胞的p21 蛋白