1、目錄中文摘要1英文摘要2第一章緒論31.1雷公藤紅素的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)31.2雷公藤紅素的藥理作用41.3 雷公藤紅素研究進(jìn)展41.4論文研究的意義及目的5第二章雷公藤紅素定性定量分析方法62.1薄層色譜定性分析方法6儀器與材料6對(duì)照品溶液的制備6 供試品溶液的制備62.2高效液相色譜定量方法7儀器與材料72.2.2 HPLC色譜條件72.2.4 雷公藤紅素對(duì)照品的紫外掃描圖譜82.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制82.3樣品中含量的計(jì)算方法9第三章南蛇藤中雷公藤紅素的柱分離工藝考察103.1雷公藤紅素超聲波提取103.2 甲醇超聲波提取物浸膏預(yù)處理10水-氯仿萃取實(shí)驗(yàn)10水-乙酸乙酯萃取實(shí)驗(yàn)103.3柱
2、分離梯度洗脫系統(tǒng)探索11硅膠吸附層析石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)考察11硅膠吸附層析氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)考察13全文結(jié)論14參考文獻(xiàn)15致謝17中文摘要本文確立了南蛇藤中雷公藤紅素的薄層定性分析方法。層析條件為：硅膠GF254，氯仿-甲醇(71)為展開劑。展槽中上行展開后在紫外檢測(cè)器365nm和254nm下觀測(cè)。采用高效液相色譜進(jìn)行定量分析。色譜柱為Kromasil C18柱（200mm4.6mm i.d.，5m），流動(dòng)相為甲醇1醋酸（8713，v/v），等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為425nm，流速1.0mL/min，柱溫25，r=0.9999，在150g/mL范圍內(nèi)線性良好，方法學(xué)檢測(cè)符合要求。探索了南蛇
3、藤藥材中雷公藤紅素的硅膠吸附柱層析工藝條件。對(duì)比甲醇-氯仿系統(tǒng)和石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)的洗脫結(jié)果，確定了以石油醚-乙酸乙酯為洗脫系統(tǒng)，洗脫順序?yàn)?0(2V0)，51(2V0)，11(10V0)。用薄層層析條件進(jìn)行檢測(cè)，判定含有雷公藤紅素的流分。高效液相檢測(cè)可以得到純度90.6的雷公藤紅素。關(guān)鍵詞：南蛇藤；雷公藤紅素；薄層層析;高效掖相色譜；吸附柱層析ABSTRACTThin-layer chromatography (TLC)of tripterinewas studied. TLC condition was: silica gel GF254 as adsorbent, chloroform
4、methanol (71) as developer. Tripterine was developed upwards in the separation chamber and detected under 365nm and 254nm. The quantitative analysis of tripterine by HPLC was studied.An external standard method by HPLC with Zorbax C18 column as fixed phase andmethano l-1% HAc (8713) as mobile phase
5、was adopted. The detecion wavelength was 425 nm and theflow rate was 1.0 mL /min.The establishment of concentration and the peak area of the standard equation and samples of the formula, were the methods to establish Celastrus in tripterine.Silica gel adsorption chromatographyof tripterine was studi
6、ed.Eluant of silica gel adsorption column was petroleum ether-ethyl acetate. Elution gradient was 10(2V0), 51(2V0)，11(10 V0). The purity of tripterine obtained was 90.6%.Keywords: Celastrus;tripterine; ThinLayer Chromatography; HighPerformanceLiquid Chromatography ; adsorption column chromatography第
7、一章 緒論從中藥特別是有毒中藥中尋找抗腫瘤有效成分具有廣闊的前景。南蛇藤系衛(wèi)矛科南蛇騰屬植物，分布廣泛，藥性辛溫、其全草均可入藥，有清熱、祛風(fēng)、除濕、活血、解毒、消腫等功效，常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、閉經(jīng)、痢疾跌打損傷、腸風(fēng)痔漏、毒蛇咬傷等癥?，F(xiàn)代藥理證實(shí)南蛇藤具有強(qiáng)大的抗炎鎮(zhèn)痛和抗菌、抗病毒作用1，更重要的是一些初步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中的三萜類成分雷公藤紅素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且抗腫瘤機(jī)理不同于現(xiàn)有抗腫瘤化療藥物，是通過(guò)抑制泛素-蛋白酶通道來(lái)阻止腫瘤的生長(zhǎng)，是繼紫杉醇之后又一高效低毒的抗腫瘤植物藥2。但在現(xiàn)階段，獲得雷公藤紅素的主要方法是從衛(wèi)矛屬植物藥材中提取純化。其提取物的
8、成分復(fù)雜，除了目標(biāo)成分外，還含有大量的其他成分。而用于藥劑研究及醫(yī)藥生產(chǎn)的原料藥需要高純度的化合物。為了獲得純度高的組分，就需要對(duì)提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。1.1雷公藤紅素的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)雷公藤紅素又名南蛇藤素、南蛇藤醇(Celastrol)，屬于三萜類化合物，性質(zhì)穩(wěn)定，是南蛇藤及雷公藤藥材中的主要有效成分之一。雷公藤紅素主要存在于根皮中，去皮的飲片中雷公藤紅素含量很低。結(jié)構(gòu)式如下圖1-1：圖1-1 雷公藤紅素結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Structural formula of tripterine其在甲醇中溶解(室溫)和易溶解(加熱)。溶解度大小順序?yàn)椋杭状?5%乙醇無(wú)水乙醇水丙酮乙酸乙酯石油
9、醚，石油醚：乙醚(1:2)，氯仿3。最大吸收波長(zhǎng)：max= 425nm1.2 雷公藤紅素的藥理作用目前雷公藤紅素的藥理研究比較多，其主要藥理作用有抗炎、抗氧化作用，抗菌、抗病毒作用，抗生育活性，調(diào)節(jié)自身免疫及抗腫瘤活性。張麗娟4等報(bào)道了南蛇藤素對(duì)腫瘤血管抑制作用。通過(guò)建立動(dòng)物腫瘤模型，對(duì)南蛇藤素予以實(shí)驗(yàn)治療，結(jié)合免疫組化，檢測(cè)其抑制腫瘤率和腫瘤內(nèi)血管密度，以及瘤體VEGF和bFGF的表達(dá)的改變。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤素具有明顯抑制S180肉瘤作用，降低VEGF、bFGF的表達(dá)可能是其抑制腫瘤血管形成的機(jī)制之一。中國(guó)科學(xué)院武漢植物園的袁曉副研究員與美國(guó)韋恩大學(xué)研究人員合作，利用無(wú)毛裸鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研
10、究證實(shí)雷公藤中含量較高的一種單體成分雷公藤紅素具有抗腫瘤作用，且抗腫瘤機(jī)理不同于現(xiàn)有抗腫瘤化療藥物。據(jù)美國(guó)三位諾貝爾醫(yī)學(xué)/ 生理學(xué)獎(jiǎng)獲得者共同提出的新理論，泛素-蛋白酶是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要通道，它在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性作用。據(jù)細(xì)胞分子學(xué)理論，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)錄和凋亡等均由蛋白酶負(fù)責(zé)降解。故抑制泛素-蛋白酶通道即可阻止腫瘤的生長(zhǎng)。根據(jù)上述新理論，美國(guó)一些制藥公司率先開發(fā)出“蛋白酶抑制劑”類全新抗癌藥物，而且在臨床使用后療效良好5,6,7。1.3 雷公藤紅素研究進(jìn)展1936年趙承暇等首次發(fā)現(xiàn)雷公騰紅素，1998年WeiHe8等報(bào)道了雷公藤紅素類似物的合成工藝，而成熟的雷公藤
11、紅素合成工藝仍沒有報(bào)道。目前獲得雷公藤紅素的主要方法是從衛(wèi)矛屬植物藥材中提取純化。袁曉9等報(bào)道了從毛枝南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的工藝。將南蛇藤根皮用丙酮冷浸，回收溶劑，所得的浸膏用氯仿回流提取，將所得的氯仿提取液再進(jìn)行下一步的純化。苗抗立10對(duì)雷公藤根皮中三萜類化合物的研究中采用丙酮浸提、多次層析得到了雷公藤紅素單體。夏焱11等研究了從雷公藤中提取雷公藤紅素的工藝。雷公藤藥材粉末，用10倍量的甲醇索氏提取。提取液濃縮后加入3倍量的硅藻土拌樣，烘干后，用氯仿超聲提取3次，濾液合并。硅膠干法裝柱，少許氯仿溶解樣品，上樣。用氯仿洗脫除雜后，用氯仿:甲醇(955)洗脫，流分合并濃縮，得雷公藤紅素。S
12、hihua W12等考察了逆流色譜(Counter-current Chromatography,CCC)分離純化工藝。將雷公藤的提取物上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯洗脫，流分再經(jīng)逆流色譜進(jìn)一步純化得雷公藤紅素純品。1.4 論文研究的意義及目的據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤紅素的抑瘤作用為6593，超過(guò)美國(guó)科學(xué)家在20 世紀(jì)70 年代初發(fā)現(xiàn)了來(lái)自太平洋紫杉樹皮中的紫杉醇。在雷公藤紅素單獨(dú)服用及與其它化療藥配伍使用中，尚未見不良反應(yīng)的報(bào)道。據(jù)業(yè)內(nèi)人士預(yù)測(cè)：雷公藤紅素一旦獲準(zhǔn)上市，它將成為繼紫杉醇之后又一個(gè)高效低毒的抗腫瘤植物藥13,14,15。隨著雷公藤紅素抗癌機(jī)理被證明，雷公藤紅素作為蛋白酶體抑制劑成為抗癌新
13、藥的熱點(diǎn)，該化合物也將備受關(guān)注，具有廣闊的市場(chǎng)前景。而雷公藤紅素的相關(guān)報(bào)道中提取純化工藝報(bào)道甚少，因此探究雷公藤紅素提取純化優(yōu)化工藝既成了一種必要，更有助于推動(dòng)雷公藤紅素研究的進(jìn)展，為其進(jìn)入臨床應(yīng)用提供可能。目前對(duì)雷公藤紅素的報(bào)道主要集中在中藥雷公藤的研究上，本文選擇了衛(wèi)矛屬的另一種藥材南蛇藤作為研究對(duì)象。對(duì)其甲醇超聲波提取物浸膏中雷公藤紅素的薄層色譜條件及硅膠柱吸附層析進(jìn)行了探索，以期能提出、其分離純化的可行性工藝，為雷公藤紅素的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。第二章 雷公藤紅素定性定量分析方法2.1 薄層色譜(Thin Layer Chromatography,TLC)定性分析方法 儀器與材
14、料儀器：ZF-2型三用紫外儀上海安亭電子儀器廠藥品試劑：薄層層析用硅膠GF254青島海洋化工有限公司 氯仿，甲醇（分析純） 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司對(duì)照品：雷公藤紅素 (98%) 中國(guó)生物制品檢定所樣品：南蛇藤提取物及硅膠柱上洗脫下的流分 2.1.2 對(duì)照品溶液的制備取雷公藤紅素對(duì)照品適量，乙酸乙酯溶解，備用。 供試品溶液的制備取南蛇藤提取物浸膏適量，乙酸乙酯溶解，備用。硅膠柱層析洗脫的流分備用。2.1.4TLC條件薄層板：薄層層析用硅膠GF254展開系統(tǒng)：氯仿甲醇71展開方式：展開槽中加入適量的展開劑，平衡10min后上行展開檢 測(cè)：當(dāng)雷公藤紅素點(diǎn)樣量大時(shí)，薄層板在日光下觀測(cè)有黃色條帶；在紫外檢
15、測(cè)器365nm和254nm下觀測(cè)為暗色斑點(diǎn)，同時(shí)也可以觀察到其它雜質(zhì)成分的熒光點(diǎn)和暗點(diǎn)。2.2 高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)定量方法儀器與材料儀器:L-2130型高效液相色譜儀日本日立公司L-2400型紫外檢測(cè)器日本日立公司N-3000色譜工作站浙江大學(xué)智能信息研究所TU-1810型紫外可見分光光度北京普析通用儀器公司ALC-210.4型電子天平(0.1mg)AcculabAR2130型電子天平(1mg)OhausKQ3200E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司 試劑：甲醇（色譜純）山東禹王實(shí)業(yè)有限公司對(duì)照品：雷公藤紅素 (
16、98%)中國(guó)生物制品檢定所HPLC色譜條件16色譜柱：KromasilC18柱 (200mm4.6mm i.d , 5m)流動(dòng)相：甲醇1%醋酸（v/v）8713檢測(cè)波長(zhǎng)：425nm流速：1.0mL/min柱溫：252.2.3 雷公藤紅素對(duì)照品的紫外掃描圖譜稱取雷公藤紅素對(duì)照品適量，甲醇溶解，在200600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，見下圖2-1。雷公藤紅素在425nm附近有最大吸收峰，故選擇425nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。圖2-1 雷公藤紅素紫外可見光掃描Fig.2 UV spectrum oftripterine2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取雷公藤紅素對(duì)照品5.0mg，甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中
17、并定容，搖勻，備用，作為初始溶液。表2-1 雷公藤紅素標(biāo)準(zhǔn)品濃度峰面積數(shù)據(jù)Tab.2-1 Data of standard curve of Tripterine濃度(g/mL)12510202550峰面積平均26953260792636626466444564496745163448621347281393991355651365643169483136763138123148126491016489846455136478668256928219358223128233131650310164521016327601642760分別精密量取配制的對(duì)照品初始溶液0.5、1mL至25mL容量瓶
18、中并定容，分別精密量取1、2、4、5mL至10mL容量瓶中并定容，搖勻。將配制的這些不同濃度梯度的溶液及初始溶液過(guò)0.45m微孔濾膜。分別20L進(jìn)樣，HPLC分析得相應(yīng)的峰面積，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得雷公藤紅素的線性回歸方程：A=33274C17614，r=0.9999，雷公藤紅素對(duì)照品溶液濃度在150g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。濃度和峰面積數(shù)據(jù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2-2。圖2-2 雷公藤紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-2Standard curve of tripterine2.3 樣品中含量的計(jì)算方法第三章 南蛇藤中雷公藤紅素的柱分離工藝考察通過(guò)各種提取技術(shù)所得到的中藥提取
19、物中的成分比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步的處理才可以得到純度較高的化合物。本章考察了南社藤超聲波提取物浸膏的預(yù)處理工藝，并探索了雷公藤紅素柱層析分離條件，以期能得到雷公藤紅素簡(jiǎn)便可行的的分離純化工藝。3.1 雷公藤紅素超聲波提取用1：10倍量的甲醇溶劑，在超聲功率400W，單次輻射時(shí)間8s(間歇時(shí)間5s)，超聲總時(shí)間40min的條件下得甲醇超聲波提取物浸膏。3.2甲醇超聲波提取物浸膏預(yù)處理由于南蛇藤藥材甲醇超聲波提取物浸膏中會(huì)含有大量極性大物質(zhì)，而雷公藤紅素為中等極性物質(zhì)，因此可以以水為萃取劑，通過(guò)兩相萃取除去極性大的組分如糖類、蛋白及鞣質(zhì)等，將樣品進(jìn)行初步純化、富集。3.2.1 水-氯仿萃取實(shí)驗(yàn)取甲醇
20、超聲波提取物浸膏適量，加入10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)至合適的pH），再加入等量氯仿，氯仿層乳化現(xiàn)象嚴(yán)重。3.2.2 水-乙酸乙酯萃取實(shí)驗(yàn)取甲醇超聲波提取物所得浸膏適量，加入10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)至合適的pH），再加入等量的乙酸乙酯，震蕩，搖勻，靜置2h，取出乙酸乙酯層。再向水相補(bǔ)入等量乙酸乙酯，重復(fù)上面的操作5次，將5次所得的乙酸乙酯層合并定容。精密量取適量進(jìn)行分析，表4-1為預(yù)處理工藝前后浸膏中雷公藤紅素總量和雷公藤紅素含量變化數(shù)據(jù)。表3-1 預(yù)處理前后浸膏中雷公藤紅素總量和含量數(shù)據(jù)Tab.3-1 Data of total amount and contents of tripterine i
21、nextractum and pretreatment extractum樣品說(shuō)明雷公藤紅素總量（mg）雷公藤紅素含量（%）提取物濃縮所得浸膏13.64870.568經(jīng)預(yù)處理后浸膏13.16922.14小結(jié)：從上表3-1可以看出，甲醇超聲波提取物浸膏經(jīng)過(guò)水-乙酸乙酯兩相少量多次處理，目標(biāo)成分得到富集，浸膏中雷公藤紅素的含量提高了近3倍，雷公藤紅素的回收率為96%左右，而且浸膏粘度降低，有利于柱層析工藝的進(jìn)行。從而選擇水-乙酸乙酯兩相萃取進(jìn)行樣品的預(yù)處理。3.3柱分離梯度洗脫系統(tǒng)探索雷公藤紅素在結(jié)構(gòu)上有羧基基團(tuán)，故選用硅膠作為吸附劑，薄層檢測(cè)條件為依據(jù)，以此檢測(cè)定性鑒定不同洗脫系統(tǒng)沖柱子時(shí)所得到
22、的流分中雷公藤紅素和其它成分。參照薄層色譜條件，乙酸乙酯對(duì)雷公藤紅素的洗脫力較大，故而柱層析除了探索薄層優(yōu)化色譜條件氯仿-甲醇系統(tǒng)，也探索了石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)。3.3.1 硅膠吸附層析石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)考察1)裝柱稱取15g硅膠（200-300目），加入干硅膠體積一倍的石油醚，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枵{(diào)成糊漿狀，沿層析柱內(nèi)壁，徐徐灌入柱中，同時(shí)打開下端活塞，讓洗脫液石油醚緩緩滴出，并注意在灌漿過(guò)程中不能干柱，柱面上保持一定的液面高度，用吸耳球均勻施力敲打柱子讓硅膠自由沉降而均勻填實(shí)。過(guò)夜平衡，待柱子高度穩(wěn)定后，測(cè)定柱子的保留體積V0=27ml17。2)上樣雷公藤紅素在石油醚中的溶解度較小，故采
23、用干法上樣。稱取0.3g硅膠（200-300目），將預(yù)處理后的樣品溶于乙酸乙酯，與硅膠拌樣，在紅外燈下?lián)]發(fā)掉溶劑，調(diào)節(jié)柱的液面至硅膠上層大約1cm左右，將拌樣輕輕地添加到硅膠柱的上部。在柱子頂部放入少許棉花，防止洗脫劑在加入柱子內(nèi)部時(shí)將硅膠頂部沖起171。3）柱層析洗脫預(yù)實(shí)驗(yàn) 采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)系統(tǒng)，分別各以10；101；81；61；31；11；12；14兩個(gè)柱體積進(jìn)行洗脫，從而逐步調(diào)節(jié)石油醚和乙酸乙酯的比例來(lái)調(diào)節(jié)洗脫劑的洗脫能力。樣品經(jīng)硅膠吸附柱層析分離時(shí)，其色帶明顯，柱分離色帶示意圖如下圖3-1，圖4-1石油醚-乙酸乙酯洗脫示意圖Fig.3-1Schematic diagram of
24、 elutionprocess by petroleum ether-ethyl acetate gradient參照薄層色譜定性分析條件進(jìn)行檢測(cè)，在洗脫劑比例為14時(shí)檢測(cè)到雷公藤紅素，說(shuō)明當(dāng)洗脫劑極性小于洗脫劑比例14的極性時(shí)，雷公藤紅素即在柱子內(nèi)隨流動(dòng)相移動(dòng)，通過(guò)掖相檢測(cè)，基本確定雷公藤紅素所在色帶。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以雷公藤紅素色帶的移動(dòng)作為觀測(cè)，調(diào)整洗脫劑的配比和各梯度時(shí)洗脫量。經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)探索，在洗脫劑比例為51時(shí)，雷公藤紅素所在的色帶開始隨著柱子方向移動(dòng)，但移動(dòng)緩慢，當(dāng)調(diào)節(jié)洗脫劑比例在51和11之間時(shí)，洗脫劑對(duì)雷公藤紅素的洗脫能力變化不大，雷公藤紅素色帶移動(dòng)速度緩慢。洗脫劑比例大于12時(shí)，
25、溶劑的洗脫能力太大，使得雷公藤紅素色帶與后邊的色帶重合，分離效果不好，而帶入雜質(zhì)。4）柱層析洗脫預(yù)實(shí)驗(yàn)小結(jié)經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，確定了南蛇藤藥材中雷公藤紅素柱分離洗脫梯度如下表3-2。以此洗脫梯度重復(fù)硅膠吸附柱層析實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。表3-2 石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)柱分離結(jié)果Tab.3-2 Result of column chromatography eluted by petroleum ether-ethyl acetate gradient流份洗脫系統(tǒng)說(shuō)明1#2#3#6#7#40#41#76#77#90#91#103#石油醚石油醚乙酸乙酯=51石油醚乙酸乙酯=11石油醚乙酸乙
26、酯=12洗脫2V0，全部合并洗脫2V0，溶劑的最前沿有黃色色帶淡黃色色帶深紅色色帶淡黃色色帶黃綠色色帶深褐色色帶5）實(shí)驗(yàn) 根據(jù)表4-2安排實(shí)驗(yàn)，用試管收集流分（10ml/管），將流分間隔點(diǎn)樣，以氯仿甲醇=71在層析槽中上行展開，薄層板在365nm和274nm紫外燈下觀測(cè)，合并含有雷公藤紅素的流分。雷公藤紅素集中的流分為6#50#，其中10#在紅素前端有熒光物質(zhì)。將6#14#,15#30#和31#-50#分別合并，減壓蒸餾,回收溶劑，濃縮成浸膏，通過(guò)HPLC測(cè)浸膏中雷公藤紅素含量分為6.0%，90.7%與46.6%。3.3.2硅膠吸附層析氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)考察(1)裝柱方法同石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)
27、濕法裝柱1）裝柱方法同石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)濕法裝柱。2）上樣由于雷公藤紅素在氯仿中有較大的溶解度，故采用濕法上樣13。將預(yù)處理后的浸膏樣品用少許氯仿溶解。先將柱子內(nèi)的洗脫劑沖至與硅膠柱頂部相切的位置，用膠頭滴管將氯仿溶解的樣品直接加到柱子頂端，待樣品溶液液面與柱子頂部再次相切的時(shí)候，加入少許的氯仿沖洗柱子內(nèi)壁，待所有的樣品全部轉(zhuǎn)移吸附到硅膠柱子上時(shí)，開始洗脫。在硅膠柱的頂端放入少許的棉花，防止硅膠柱頂被溶液沖起。3）洗脫表3-2 氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)柱分離結(jié)果Tab.3-2 Resultof column chromatography eluted by chloroform-methanol
28、gradient流份洗脫系統(tǒng)說(shuō)明1#4#5#15#氯仿氯仿甲醇=1001溶劑前沿為黃色色帶褐色色帶硅膠柱氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，色帶現(xiàn)象如示意圖4-5，原圖如附錄4.圖3-2氯仿-甲醇洗脫示意圖Fig.3-2 Schematic diagram of elutionprocessbychloroform-methanol gradient4）小結(jié)如圖3-2，2為雷公藤紅素色帶。與圖3-1比較，本圖的色帶2為混合色帶，說(shuō)明雷公藤紅素未能分開。說(shuō)明氯仿-甲醇系統(tǒng)分離度較差，故確定石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為南蛇藤藥材提取物浸膏的洗脫系統(tǒng)。全文結(jié)論1.確定了雷公藤紅素薄層檢測(cè)定性分析方法，即以薄層層析用硅膠G
29、F254作為吸附劑，氯仿-甲醇(7:1)系統(tǒng)為展開劑，在展開槽中上行展開，在紫外燈254nm和365nm下檢測(cè)雷公藤紅素斑點(diǎn)。2.確定了南蛇藤藥材中雷公藤紅素的HPLC含量測(cè)定方法：色譜柱為Kromasil C18柱（200mm4.6mm i.d.，5m），流動(dòng)相為甲醇1醋酸（8713，v/v），等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為425nm，流速1.0mL/min，柱溫25。在此條件下，得到雷公藤紅素的峰面積(A)和相應(yīng)濃度(C)的線性方程A=33274C17614,r=0.9999，在150g/mL范圍內(nèi)線性良好，方法學(xué)檢測(cè)符合要求。3.建立了雷公藤紅素的乙酸乙酯-水萃取除雜工藝。以10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)
30、pH）溶解雷公藤紅素提取物浸膏，以乙酸乙酯為萃取劑，采用少量多次的原則，以與水等量的乙酸乙酯萃取5次，除去了浸膏中極性大的物質(zhì)，使浸膏粘度明顯降低。4.優(yōu)化了雷公藤紅素的柱層析純化工藝條件。以石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)為洗脫劑，洗脫順序?yàn)?0(2V0)，51(2V0)，11(10V0)。合并目標(biāo)流分6#14#，經(jīng)減壓濃縮，真空干燥至恒重， HPLC測(cè)定，浸膏中雷公藤紅素的含量為90.7%。參考文獻(xiàn)1南蛇藤提取物抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究 張艦 學(xué)士論文2 開發(fā)雷公藤單體成分新藥市場(chǎng)前景廣闊徐錚奎(無(wú)錫市醫(yī)藥科技情報(bào)部)3 張立平,靳風(fēng)柱.雷公藤紅素提取工藝的研究J.中華醫(yī)學(xué)全科雜志,2004.3(2)
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