蛋白質(zhì)的分離純化方法

1、蛋白質(zhì)的分離純化方法2.1 根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì) ,并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同 ,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開 ,并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中 , 再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜 ,而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機(jī)鹽為主的小分子分開。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用,在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去

2、引入的無機(jī)鹽。由于超濾過程中 ,濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞 ,以致超濾速度減慢 ,截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜 ,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開。例如 ,在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中 ,加入纖維素酶和 -淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后 ,再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離 3。使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度 (區(qū)帶 )離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度?？梢愿鶕?jù)所需密度和滲透壓的范

3、圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白 ,得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。蔣辰等 6通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果 ,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法一。凝膠過濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí) ,比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ,而被排阻在凝膠珠之外 ,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動并最先流出柱外 ;反之 ,比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以

4、得到很好的效果,純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量1 / 5約為 32 kDa、成分是多糖蛋白質(zhì) (88 12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白 1 。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)7。2.2 根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多 ,比如溶液的 pH 值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下 ,不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度 ,根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) ,適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件 ,就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度 ,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和 pH 值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法

5、、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。等電點(diǎn)沉淀和 pH 值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn) ,而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低 ;相反 ,有些蛋白質(zhì)在一定 pH 值時(shí)很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的 pH 值來分離純化蛋白質(zhì)。王洪新等 8研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn) ,pH 值為時(shí)茶葉蛋白提取效果最好 ,提取率達(dá)到 36·8%,初步純化得率為 91·0%。李殿寶 9 在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的 pH 值調(diào)到 34,使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來。等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等 10測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為 38。他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白

6、質(zhì),得到了最佳的提取工藝為:以1× 10-5molL-·1的 NaOH溶液 ,按 15 的料液比 ,在 40攪拌 40 min,葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá) 73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白 ,其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取 11。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白,蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá) 90%12。蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象 ,其中 ,增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶 ,反之為鹽析。應(yīng)當(dāng)指出 ,同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽 ,如 MgC2、(NH4)2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果 ,要比一價(jià)離子中性鹽如 NaCl、N

7、H4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法2 / 5來提取蛋白質(zhì) ,其最佳提取工藝是 :以 10%NaCl溶液 ,按 125 的料液比 ,在 30攪拌提取 30min,蛋白質(zhì)提取率為 57·25%10。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法 ,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法 ,其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性 ,為防止其對蛋白質(zhì)的破壞 ,應(yīng)用氨水調(diào) pH 值至中性。為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象 ,蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在 0·2% 2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后 ,通常要使用透析或者凝膠過濾的方

8、法除去中性鹽 13。有機(jī)溶劑提取法的原理是 :與水互溶的有機(jī)溶劑 (如甲醇、乙醇 )能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低 ;而且在一定溫度、 pH 值和離子強(qiáng)度下 ,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同 ,因此 ,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。例如,在冰浴中磁力攪拌下 ,在 4預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇 (-25),可以使冰核蛋白析出 ,從而純化冰核蛋白 14。由于在室溫下 ,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀 ,而且伴隨著變性。因此 ,通常要將有機(jī)溶劑冷卻 ,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過高 ,蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較

9、多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取 ,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性 ,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由 Cohn 于_年提出 ,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前 WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法 ,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種血漿成分 ,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用15。萃取是分離和提純有機(jī)化合物常用的一種方法 ,而雙水相萃取和反膠團(tuán)萃取可以用來分離蛋白質(zhì)。雙水相萃取技術(shù) (Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相 ,由于被分離物在兩相中分配的不同,便可實(shí)

10、現(xiàn)分離 ,被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。此方法可以在室溫環(huán)境下進(jìn)行 ,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 ,收率較高。對于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì) ,需要先對細(xì)胞進(jìn)行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到濃縮 ,細(xì)胞碎片等固體物分布在下相中。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白 ,受聚合物分子量及濃度、溶液 pH 值、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響 16。3 / 5反膠團(tuán)萃取法是利用反膠團(tuán)將蛋白質(zhì)包裹其中而達(dá)到提取蛋白質(zhì)的目的。反膠團(tuán)是當(dāng)表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑溶解時(shí)自發(fā)聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是萃取過程中蛋白質(zhì)因位于反膠團(tuán)的內(nèi)部而受到反膠團(tuán)的保護(hù)。程

11、世賢等 17就利用反膠團(tuán)萃取法提取了大豆中的蛋白質(zhì)。2.3 根據(jù)電荷不同進(jìn)行分離純化根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷即酸堿性質(zhì)不同分離蛋白質(zhì)的方法有電泳和離子交換層析兩類。在外電場的作用下 ,帶電顆粒 (如不處于等電點(diǎn)狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子 )將向著與其電性相反的電極移動 ,這種現(xiàn)象稱為電泳。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質(zhì)的區(qū)帶電泳 , 常用于分離蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù) ,也可以用于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定。利用等電聚焦技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有 pH 梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦在等于其等電點(diǎn)的 pH 值梯度處形成一

12、個(gè)窄條帶。孫臣忠等 18研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,聚丙烯酰胺電泳的條帶分辨率低 ,加樣量不高 ;等電聚焦電泳分辨率最高 ,可以分離同種蛋白的亞成分 ,加樣量最小 ;等速提純電泳區(qū)帶分辨率較高 ,可將樣品分成單一成分 ,加樣量最大。離子交換層析 (Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相 ,依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。離子交換層析中 ,基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂 ;反之為陽離子交換樹脂。

13、離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的 pH 值條件下 ,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì) ,被留在層析柱上 ,通過提高洗脫液中的鹽濃度 ,將吸附在層析柱上的蛋白質(zhì)洗脫下來 ,其中結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì),結(jié)合的蛋白可4 / 5以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH 值洗脫下來。李全宏等19將離子交換層析應(yīng)用于濃縮蘋果汁中蛋白質(zhì)的提純。另外 ,離子交換層析還用于抗凝血蛋白的提取 7。2.4 利用對配體的特異親和力進(jìn)行分離純化親和層析是利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力 (即生物學(xué)親和力

14、 ) 建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來 ,并且純度相當(dāng)高。應(yīng)用親和層析須了解純化物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性 ,以便設(shè)計(jì)出最好的分離條件。近年來 ,親和層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)蛋白尤其是疫苗的分離純化 ,特別是在融合蛋白的分離純化上 ,親和層析更是起到了舉足輕重的作用 ,因?yàn)槿诤系鞍拙哂刑禺愋越Y(jié)合能力 20。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛 21。范繼業(yè)等 22利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達(dá)到 71 428 BAEEmg·-1,純化回收率達(dá)到 62·5%。該方法成本較低 ,吸附劑價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度高、抗污染能力較強(qiáng)、非特異性吸附較小、可反復(fù)使用、適用性廣,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。3 展望在實(shí)際工作中 ,很難用單一方法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化 ,往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質(zhì)。理想的蛋白質(zhì)分離提純方法 ,要求產(chǎn)品純度和總回收率越高越好 ,但實(shí)際上兩者