第10章生化(劉建華)

1、BiochemistrySixth EditionChapter 10:Regulatory StrategiesCopyright 2007 by W. H. Freeman and Company Berg Tymoczko Stryer如同機動車交通，用信號調(diào)節(jié)代謝途徑流動效率更高。CTP是一個多步驟反應(yīng)的最終產(chǎn)物。CTP抑制限速步驟催化酶（即天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶ATCase）活性能夠控制這個代謝途徑。酶活性的調(diào)節(jié)方式主要有五種。變構(gòu)控制。變構(gòu)蛋白質(zhì)含有調(diào)節(jié)位點和多個活性位點。信號小分子與調(diào)節(jié)位點結(jié)合,控制酶蛋白活性。變構(gòu)蛋白有協(xié)同性：一個活性位點的活性影響其它活性位點。因此有變構(gòu)蛋

2、白能夠?qū)⑿盘柗肿踊蛲幻傅鞍谆钚晕稽c的信息傳遞給蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)酶蛋白活性。酶的多重形式。同功酶（isozyme，isoenzyme）是在不同位置或時間調(diào)節(jié)酶活性的另一種形式。同功酶是同一生物體內(nèi)存在的催化同一反應(yīng)的同源酶，它們之間在結(jié)構(gòu)上稍有差異，但是催化反應(yīng)的Km和Vmax，以及調(diào)節(jié)特性差異顯著。通常同功酶隨表達的時間、地點和發(fā)育狀態(tài)而改變。1. 可逆共價修飾。有很多酶共價連接一個基團后催化活性顯著改變，最常見的修飾基團是磷酸。ATP是磷酸供體，催化的酶是蛋白激酶。蛋白磷酸酯酶負責刪除蛋白質(zhì)的磷酸基團。 蛋白裂解活化。有些調(diào)節(jié)使酶蛋白活性能夠來回變化，使之處于有活性和無活性兩種狀態(tài)。還有一種調(diào)

3、節(jié)方式是酶蛋白活性不可逆轉(zhuǎn)地激活。只要水解少數(shù)幾個肽鍵甚至一個肽鍵就能夠酶激活的蛋白質(zhì)稱為酶原(zymogen, or proenzyme)。這種機制能夠產(chǎn)生消化酶如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶。血液凝固就是酶原激活的級聯(lián)反應(yīng)。特異抑制蛋白與分子靶標不可逆結(jié)合關(guān)閉凝血過程。 酶量控制。調(diào)節(jié)酶量也是調(diào)節(jié)酶活性的一種方法。通常在轉(zhuǎn)錄水平進行這種調(diào)節(jié)。在31章我們將介紹這種調(diào)節(jié)模式。圖圖10.1 ATCase酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)。ATCase催化嘧啶合成途經(jīng)的限速反應(yīng)，天冬氨酸與胺?；姿岬目s合生成N-氨甲酰天冬氨酸。天冬氨酸天冬氨酸- -氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶是一種變構(gòu)氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶是一種變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，

4、受該途徑終端產(chǎn)物抑制調(diào)節(jié)酶，受該途徑終端產(chǎn)物抑制 圖圖10.2 CTP抑制抑制ATCase酶促反應(yīng)。酶促反應(yīng)。盡管CTP與反應(yīng)物或產(chǎn)物沒有結(jié)構(gòu)類似性，但是CTP能夠抑制ATCase活性。圖圖10.3 ATCase酶促反應(yīng)動力學(xué)呈酶促反應(yīng)動力學(xué)呈S曲線。曲線。天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)得產(chǎn)物形成速度對底物Asp濃度作圖呈S型曲線，表明一個活性位點結(jié)合底物能夠增加這個酶蛋白分子其它位點的活性。因此這個酶是正協(xié)同酶。ATCase含有獨立的催含有獨立的催化亞基和調(diào)節(jié)亞基?；瘉喕驼{(diào)節(jié)亞基。圖圖10.4 半胱氨酸殘基的修飾。半胱氨酸殘基的修飾。對羥基汞苯甲酸與天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶關(guān)鍵的半胱氨酸

5、反應(yīng)。圖圖10.5 超離心研究超離心研究ATCase酶。酶。天然ATCase （A）和經(jīng)過p-羥基汞苯甲酸處理的ATCase的沉降速度顯示酶蛋白可以分成催化亞基( c) 和調(diào)節(jié)亞基 ( r )。 較大的亞基稱為催化亞基。這個亞基有催化活性，但是不受CTP調(diào)節(jié)，其催化動力學(xué)也不呈S曲線。較小的亞基能夠結(jié)合CTP，但是沒有催化活性，稱為調(diào)節(jié)亞基。催化亞基有三條多肽鏈，稱為c3 (每條多肽鏈有34 kD)。調(diào)節(jié)亞基有兩條多肽鏈，稱為r2 (每條多肽鏈有17 kD)。將催化亞基和調(diào)節(jié)亞基混合，兩者能迅速結(jié)合成與天然ATCase一樣的c6r6 （即兩個催化亞基和三個調(diào)節(jié)亞基結(jié)合而成的復(fù)合物）。 2 c3

6、 + 3 r2 = c6r6重組酶的催化動力學(xué)性質(zhì)和變構(gòu)調(diào)節(jié)性質(zhì)與天然酶完全相同。因此，ATCase有獨立的調(diào)節(jié)亞基和催化亞基。天然酶分子中催化亞基與調(diào)節(jié)亞基之間相互作用產(chǎn)生了酶促特性和變構(gòu)調(diào)節(jié)特性。 亞基之間究竟是什么作用能夠解釋ATCase的特性？大量的思路來自ATCase的三維結(jié)構(gòu)測定。William Lipscomb實驗室首先用x-晶體衍射測定ATCase結(jié)構(gòu)。兩個催化三體疊加在一起，三體之間用調(diào)解多肽鏈聯(lián)系起來（圖10.6）。催化亞基和調(diào)節(jié)亞基之間有大量接觸：調(diào)節(jié)亞基（二聚體）的每條r鏈與催化三體的一條c鏈相互作用。一個Zn 2+與四個半胱氨酸殘基結(jié)合穩(wěn)定c鏈與r鏈的一個結(jié)構(gòu)域接觸。

7、汞化合物p-羥基汞苯甲酸與半胱氨酸結(jié)合力強，替代Zn 2+導(dǎo)致r-鏈結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定，結(jié)果催化亞基和調(diào)節(jié)亞基發(fā)生解離。圖圖10.6 ATCase結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。（A）從頂部觀察天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的四級結(jié)構(gòu)。中間圖僅僅代表亞基之間的關(guān)系。只能看到一個催化三體（黃色）的c鏈，另一個催化亞基（三體）被遮住。一個r鏈經(jīng)過Zn 2+離子與一個c鏈相互作用。（B）ATCase側(cè)視圖。 為了確定活性位點，在N-膦酰乙?；?L-天冬氨酸（PALA）存在的情況下進行ATCase結(jié)晶。PALA是雙底物類似物，類似于催化途徑的中間物（圖10.7）。雙底物類似物ATCase-PALA復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，PALA結(jié)合于催化亞

8、基三聚體兩個相鄰的c鏈之間。圖圖10.8 ATCase酶的活性位點。酶的活性位點。與PALA抑制劑結(jié)合的一些關(guān)鍵位點的殘基特異標出。活性位點的氨基酸殘基主要有一個c鏈提供，相鄰c鏈也提供了一些重要側(cè)鏈（用綠色方框標出）。PALA與ATCase結(jié)合導(dǎo)致酶四級結(jié)構(gòu)變化顯著。兩個催化三聚體亞基之間疏遠了12A，旋轉(zhuǎn)了10o。相應(yīng)地，調(diào)節(jié)亞基葉旋轉(zhuǎn)了15o以適應(yīng)之。因此PALA與ATCase結(jié)合導(dǎo)致美蛋白分子膨大。圖圖10.9 ATCase酶的酶的T態(tài)向態(tài)向R態(tài)轉(zhuǎn)化。態(tài)轉(zhuǎn)化。天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)ATCase移酶有兩種結(jié)構(gòu)狀態(tài)，即活性低的T態(tài)和活性高的R態(tài)。從T態(tài)轉(zhuǎn)變成R態(tài)結(jié)構(gòu)變化明顯。PALA結(jié)合能夠

9、穩(wěn)定蛋白質(zhì)的R態(tài)結(jié)構(gòu)。圖圖10.10 S型曲線的基礎(chǔ)。型曲線的基礎(chǔ)。將變構(gòu)酶想象成兩種米氏酶的混合物，一種酶Km低（相當于R態(tài)結(jié)構(gòu)），一種酶Km高（相當于T態(tài)結(jié)構(gòu)）。隨著底物濃度的增加，平衡從T向R移動，導(dǎo)致反應(yīng)速度雖底物濃度增加急劇增高。 ATCase的S型曲線可以看作是兩種米氏酶(一種是T態(tài)酶，另一種是R態(tài)酶)酶促反應(yīng)的疊加。底物濃度的增加有助于酶促反應(yīng)從T態(tài)曲線轉(zhuǎn)化成R態(tài)曲線（圖10.10）。注意這種S型動力學(xué)曲線有另一個結(jié)果，當?shù)孜餄舛冗_到T向R轉(zhuǎn)化時，增加底物濃度使酶促反應(yīng)速度急劇上升。酶分子從活性低轉(zhuǎn)變成活性高的底物濃度區(qū)間很窄。如果細微的濃度變化就需要應(yīng)答的話，這種酶促行為就非常

10、有用。底物對變構(gòu)酶的這種效應(yīng)叫同質(zhì)效同質(zhì)效應(yīng)應(yīng)（homotropic effects）。圖圖10.12 R態(tài)與態(tài)與T態(tài)處于平衡狀態(tài)。態(tài)處于平衡狀態(tài)。即使沒有底物，沒有調(diào)節(jié)因子，天冬氨酸-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)處于R態(tài)和T態(tài)之間的平衡狀態(tài)。此時，T態(tài)比R態(tài)多200倍。圖圖10.13 CTP對對ATCase的影響。的影響。CTP穩(wěn)定T態(tài)結(jié)構(gòu)，使ACTase更難與底物結(jié)合，更難轉(zhuǎn)變成R態(tài), 動力學(xué)曲線右移（紅色）。ATP也是ATCase的別構(gòu)效應(yīng)劑。但是ATP能夠增加特定底物濃度時ATCase酶促反應(yīng)速率（圖10.14）。ATP濃度愈高，S形曲線就越不明顯。ATP與CTP競爭性結(jié)合ATCase的調(diào)節(jié)位

11、點。結(jié)果，ATP濃度高阻止CTP與ATCase結(jié)合。非底物分子對變構(gòu)酶的影響稱為異質(zhì)效異質(zhì)效應(yīng)應(yīng)（heterotropic effects）。 圖圖10.14 ATP對對ATCase動力學(xué)的影響。動力學(xué)的影響。ATP是ATCase的異質(zhì)活化劑，因為它能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的R態(tài)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)易于與底物結(jié)合。結(jié)果動力學(xué)曲線向左邊移動（藍色）。ATP濃度增加導(dǎo)致ATCase活性高有兩個潛在的生理意義。ATP濃度高表示細胞內(nèi)嘌呤的密度高，需要增加ATCase活性促成細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的平衡。ATP的濃度高表明細胞內(nèi)能量充足，能用來合成mRNA和復(fù)制DNA，也需要合成更多的嘧啶。 L = T/R圖圖10.15

12、MWC模型的定量表述。模型的定量表述?；钚晕稽c比例Y對底物濃度（用a表示，a是底物濃度與R態(tài)酶-底物復(fù)合物解離常數(shù)的比值）作圖。L是T態(tài)酶濃度與R態(tài)酶濃度之間的比值。與ATCase的結(jié)合，ATP和CTP能夠改變L值，從而改變酶對底物濃度的應(yīng)答。同功酶是進行組織特異性和時間特異性調(diào)節(jié)同功酶是進行組織特異性和時間特異性調(diào)節(jié)的一種方式的一種方式同功酶同功酶(isozyme，或，或isoenzyme)是同一生物體是同一生物體內(nèi)，氨基酸序列不同，但催化同一化學(xué)反應(yīng)內(nèi)，氨基酸序列不同，但催化同一化學(xué)反應(yīng)的酶。通常這些酶的動力學(xué)常數(shù)（如的酶。通常這些酶的動力學(xué)常數(shù)（如Km值）值），或者對不同調(diào)節(jié)信號的應(yīng)答能

13、力不同。這，或者對不同調(diào)節(jié)信號的應(yīng)答能力不同。這些酶的編碼基因不同，通常是同一基因發(fā)生些酶的編碼基因不同，通常是同一基因發(fā)生重復(fù)和差異化所致。通常利用生化性質(zhì)例如重復(fù)和差異化所致。通常利用生化性質(zhì)例如電泳遷移率差異區(qū)分同功酶。電泳遷移率差異區(qū)分同功酶。 大鼠發(fā)育過程中，心臟LDH表達譜的變化情況。H亞基用方塊表示，M亞基用圓圈表示。負數(shù)表示出生前的天數(shù)，正數(shù)表示出生后的天數(shù)。 成年大鼠不同組織的成年大鼠不同組織的LDH同功酶同功酶 有些同功酶在血液中出現(xiàn)表示相應(yīng)組織出現(xiàn)損傷，可以用作臨床診斷指標。 血清中H4（相對于H3M）水平增加表示心肌破裂(Myocardial infraction)或心

14、臟病，損傷心肌細胞導(dǎo)致胞內(nèi)組分釋放。 10.3 共價修飾時調(diào)節(jié)酶活性的一種方式共價修飾時調(diào)節(jié)酶活性的一種方式 與另一個分子共價連接能夠調(diào)節(jié)酶促活性和蛋白質(zhì)活性。在這方面，供體分子提供蛋白質(zhì)共價連接的功能基團。大多數(shù)修飾是可逆的。最常見的共價修飾是磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化。乙乙酰化和去乙?；；腿ヒ阴；橇硪环N常見的蛋白共價修飾。將DNA包裝壓縮成染色體的蛋白質(zhì)，即組蛋白，在或體內(nèi)有深度的乙?；腿ヒ阴；?1.3節(jié)）?；钴S轉(zhuǎn)錄基因所結(jié)合的組蛋白，乙?；潭雀?。乙?；D(zhuǎn)移酶和去乙酰酶自身的活性受磷酸化-去磷酸化調(diào)節(jié)。說明修飾酶的共價修飾可能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)共價修飾。有些情況下共價修飾不可逆

15、。在信號傳導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)不可逆地與脂質(zhì)分子共價連接，變成面向細胞漿的固定于細胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)，如Ras（一種GTPase）和Src(一種蛋白酪氨酸激酶)。固定在這種地方，蛋白質(zhì)更能夠接受沿信號途徑傳遞的信號，并將信號向下游傳遞（第14章）。有些癌癥，其Ras和Src有變異。與小蛋白ubiquitin連接，是銷毀該蛋白的信號，也是一種調(diào)節(jié)方式（第23章）。當細胞經(jīng)過細胞周期進入細胞分裂后期(anaphase)之前，就得使蛋白質(zhì)cyclin與ubiquitin連接并銷毀之。乙?；嚢彼崃姿峄钦{(diào)節(jié)目標蛋白或性的有效方式磷酸化是調(diào)節(jié)目標蛋白或性的有效方式 真核細胞各種代謝途徑的調(diào)節(jié)方式幾乎都用到磷酸化

16、機制。實際上，細胞內(nèi)有30%的蛋白質(zhì)被磷酸化。催化磷酸化反應(yīng)的酶叫蛋白激酶。這些酶構(gòu)成了目前所知的最大的蛋白家族。酵母有100多種同源蛋白激酶，人類有500多種同源蛋白激酶。品種眾多的蛋白激酶使之能夠精細調(diào)節(jié)各種活性以滿足特定組織、特定時間、和特定底物的需求。 ATP是最常用的磷酸供體分子。ATP的g-磷酸能夠轉(zhuǎn)移給蛋白質(zhì)特定的氨基酸。在真核生物，磷酸受體是三個側(cè)鏈帶有羥基的氨基酸。一類蛋白激酶能夠?qū)⒘姿徂D(zhuǎn)移給絲氨酸或蘇氨酸，另一類蛋白激酶能夠?qū)⒘姿徂D(zhuǎn)移給酪氨酸。多細胞生物獨有的酪氨酸蛋白激酶在生物生長控制方面起非常重要的作用。通常癌細胞含有這些蛋白激酶的變異。磷酸基團的受體：絲氨酸、蘇氨酸、

17、酪氨酸磷酸化反應(yīng)的受體處于細胞內(nèi)細胞內(nèi)。胞內(nèi)含有大量的ATP（即磷酸供體）。完全處于細胞外的蛋白質(zhì)不受可逆磷酸化調(diào)節(jié)。蛋白磷酸酯酶的作用與蛋白激酶相反。這個酶能夠?qū)⒌鞍走B接的磷酸基團水解，再生出側(cè)鏈含有羥基的氨基酸殘基，并釋放磷酸。這些酶在細胞內(nèi)的功能也很重要，因為它們能夠關(guān)閉激酶活化的信號途徑。一類高度保守的磷酸酯酶是PP2A，能夠阻遏受癌促進的一些激酶活性。在生理條件下磷酸化和去磷酸化反應(yīng)不可逆。特定蛋白質(zhì)的磷酸化必需相應(yīng)的蛋白激酶并消耗ATP。脫磷酸化反應(yīng)只要相應(yīng)的蛋白磷酸酯酶催化，無需能量。因此目標蛋白的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)得方向是單一的。磷酸化、去磷酸化轉(zhuǎn)換的速度取決于激酶和磷酸酯酶

18、活性的相對大小。磷酸化是控制酶蛋白活性的有效方式，理由如下：磷酸基團修飾蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)增加兩個負電荷。破壞沒有修飾蛋白質(zhì)間的靜電相互作用，建立新的靜電作用。顯著改變酶蛋白的底物結(jié)合性和催化活性。磷酸基團能形成三個或更多的氫鍵。磷原子四面體幾何形狀使之具有很高的方向性，能夠與氫鍵供體形成特異的相互作用。1. 磷酸化的自由能很大。ATP提供了-50kJ mol-1，大約一半的能量用于驅(qū)動蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)。另一半能量儲存在磷酸化蛋白中。蛋白磷酸化反應(yīng)不可逆。自由能變化5.69 kJ mol-1能夠使反應(yīng)平衡增加10倍，因此消耗ATP的磷酸化反應(yīng)能夠使反應(yīng)平衡增加104倍。 磷?；腿チ柞；磻?yīng)可以

19、在1秒內(nèi)完成，也可以在幾小時內(nèi)完成。這些可以調(diào)控以滿足生理需求。 磷酸化反應(yīng)常常有很高的放大效應(yīng)。一個磷酸化的激酶短期內(nèi)能夠使幾百個目標蛋白磷酸化。如果目標蛋白是酶分子，后者將能轉(zhuǎn)化大量的底物分子。 ATP是細胞內(nèi)能源分子（15章）。利用這個化合物作為磷酸供體能夠?qū)⒓毎哪芰繝顟B(tài)和代謝調(diào)控聯(lián)系起來。蛋白激酶的特異性不同，有的只能磷酸化一種或密切相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)。多功能蛋白激酶能夠磷酸化很多種蛋白質(zhì)，涉及很多生物過程。此時將許多蛋白底物磷酸化位點的序列比較，顯示多功能蛋白激酶的識別序列相關(guān)。蛋白激酶A識別的共有序列是Arg-Arg-X-Ser（Thr）-Z, 其中X是小氨基酸，Z是大的疏水性氨基

20、酸，Ser或Thr是磷酸化位點。但是，Lys替代Arg也可充當?shù)孜?，只是蛋白底物與酶的親和性稍微偏低。含有共有序列的合成多肽幾乎總能為絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶磷酸化。因此磷酸化位點附近的氨基酸序列是蛋白激酶A特異性的主要決定因素。但是，遠距離的氨基酸殘基對底物特異性也有貢獻，使酶分子易于或難于進入相應(yīng)的磷酸化位點。蛋白酶A的活化需要cAMP每條R鏈都有一段Arg-Arg-Gly-Ala-Ile序列，這段序列與PKA酶促反應(yīng)的磷酸化位點序列幾乎相同，只是將Ser用Ala替代。因此調(diào)節(jié)亞基是假底物，能夠占據(jù)催化亞基的活性位點（但是不能被磷酸化），阻止真正的底物蛋白與活性位點結(jié)合（圖10.17）。cA

21、MP與R鏈結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)變化（變構(gòu)），使假底物從活性位點脫下。釋放出來的催化鏈能結(jié)合底物并使后者磷酸化。 抑制肽與PKA催化亞基復(fù)合物。催化亞基有350個氨基酸，構(gòu)成兩個葉(lobes)。ATP和抑制肽結(jié)合于兩兩葉之間的狹縫葉之間的狹縫中。小葉與ATP-Mg2+接觸多。大葉與多肽抑制劑接觸多。大葉提供了催化活性的關(guān)鍵殘基。底物結(jié)合后兩葉相互兩葉相互靠近靠近。限制兩葉相互靠近能控制酶活性。所有已知的蛋白激酶都有第40到 280位氨基酸殘基構(gòu)成的保守催化核。為了磷酸化不同蛋白質(zhì)，進化過程中多次使用同一生化策略。占據(jù)活性位點的抑制劑含有Arg-Arg-Asn-Ala-Ile序列（圖10.19）。第一個

22、精氨酸的胍基與酶蛋白Glu127的羧基形成離子對。第二個精氨酸與其他羧基形成離子對。假底物的非極性異亮氨酸（Z）與酶分子構(gòu)成疏水溝的兩個亮氨酸緊密結(jié)合。圖圖10.19 假底物與蛋白激酶假底物與蛋白激酶A的結(jié)合。的結(jié)合。抑制劑與酶分子有多個接觸點。兩個Arg的側(cè)鏈與酶分子三個谷氨酸側(cè)鏈形成鹽橋。疏水氨基酸殘基在底物識別過程中也很重要。假底物的異亮氨酸殘基與酶分子的兩個亮氨酸殘基接觸。肽鍵斷裂活化酶原或蛋白質(zhì)前體消化酶在胃和胰臟是酶原的形式合成的。血液的凝固是蛋白酶原活化的級聯(lián)反應(yīng)，能夠?qū)?chuàng)傷應(yīng)答迅速、放大。有些蛋白激素合成的初級產(chǎn)物是沒有活性的前體。水解刪除一段肽鏈，才能將胰島素前體轉(zhuǎn)化成胰島素

23、構(gòu)成皮膚、骨的纖維蛋白膠原，來自膠原蛋白前體。膠原蛋白前體是可溶的。很多發(fā)育過程由酶原活化控制。例如，蝌蚪形變成青蛙，幾天之內(nèi)就將尾巴德膠原蛋白吸收（如同哺乳動物生產(chǎn)后降解子宮膠原蛋白）。膠原蛋白酶前體活化成膠原蛋白酶的時間非常精確，實現(xiàn)組織重構(gòu)。程序化死亡或細胞凋亡是caspase蛋白酶介導(dǎo)的。從線蟲到人類，caspases一旦活化就能啟動細胞死亡。細胞凋亡給生物體提供了重構(gòu)發(fā)育過程中生物體形態(tài)、清除受到感染或損傷的細胞的一種途徑。胰凝乳蛋白酶的前體是沒有活性的胰凝乳蛋白酶原，在胰臟合成（其他幾種酶原和消化酶也是在胰臟合成）。胰臟是合成和分泌蛋白質(zhì)最活躍的器官，胰臟的acinar細胞合成酶和

24、酶原，儲存于用膜包裹的顆粒（membrane-bounded granules）內(nèi)（圖10.20）。酶原顆粒在acinar細胞的頂部積累。當細胞受到激素或神經(jīng)脈沖刺激，便將顆粒內(nèi)的物質(zhì)釋放到與十二指腸（duodenum）接通的管腔中。 圖圖10.20 胰臟胰臟acinar細胞分泌酶原。細胞分泌酶原。圖圖10.21 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶原的蛋白水解活化。原的蛋白水解活化。a-胰凝乳蛋白酶的三條多肽鏈用兩個鏈間二硫鍵連接（A與B，和B與C）。新的N-端即Ile 16向內(nèi)移動與Asp194形成離子鍵，啟動一系列構(gòu)象變化。Met 192從深度包埋狀態(tài)（在酶原分子）移動到活性酶分子表面，187位和1

25、93位氨基酸殘基更為伸展。這些變化形成了針對芳香氨基酸和大的非極性氨基酸特異性底物結(jié)合位點。一邊是189至192位氨基酸構(gòu)成。酶原分子不能構(gòu)建出底物結(jié)合位點的這一部分。酶原缺氧負離子洞，胰凝乳蛋白酶有完整的氧負離子洞。有些區(qū)域構(gòu)象變化細微。因此，從無活性的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成有活性的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化是局部的、不連續(xù)的。這些變化是一個肽鍵斷裂啟動的。（1）胰蛋白酶原活化受內(nèi)肽酶或自身酶催化。產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化范圍大，產(chǎn)生四段多肽（相當于蛋白質(zhì)分子的15%左右）。在酶原分子中幾個區(qū)域構(gòu)象可變，但是在胰蛋白酶分子中構(gòu)象穩(wěn)定。（2）胰蛋白酶原的氧負離子洞距離His 57太遠，無法促進四面體轉(zhuǎn)化態(tài)的形成。排列在十二

26、指腸上的細胞分泌內(nèi)肽酶(enteropeptidase)。 胰臟的胰蛋白酶抑制劑。胰蛋白酶抑制劑是一個6kD的蛋白質(zhì)，與胰蛋白酶活性位點結(jié)合緊密，抑制胰蛋白酶活性。胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)是0.1 pM，相當于結(jié)合的標準自由能達到-75 kJ mol-1。用變性試劑如8M 尿素或6M 鹽酸胍處理不能將這種復(fù)合物分開。這點幾乎與所這點幾乎與所有的蛋白質(zhì)復(fù)合物不同。有的蛋白質(zhì)復(fù)合物不同。 該復(fù)合物特別穩(wěn)定。該抑制劑是非常有效的胰蛋白酶底物類似物。抑制劑占居胰蛋白酶活性位點。抑制劑15位賴氨酸與胰蛋白酶底物結(jié)合口袋的天冬氨酸側(cè)鏈結(jié)合。胰蛋白酶主鏈和抑制劑主鏈之間形成了很多氫鍵。而且，

27、抑制劑15位賴氨酸的羰基及其附近的原子與酶活性位點匹配緊密。比較與酶結(jié)合的抑制劑結(jié)構(gòu)和沒有與酶結(jié)合的抑制劑結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，酶蛋白與抑制劑結(jié)合幾乎沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)變化（圖10.24）。因此這個抑制劑是預(yù)先做好的、與胰蛋白酶完全匹配的抑制劑。胰蛋白酶催化斷裂抑制劑15位的賴氨酸和16位的丙氨酸之間的肽鍵非常慢：半壽期是幾個月。本質(zhì)上，胰蛋白酶抑制劑就是胰蛋白酶的底物，但是這個底物與酶活性位點匹配得太完美以致酶的活性位點與這個底物結(jié)合太緊，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化速度太慢。圖圖10.24 胰蛋白酶與胰蛋白酶抑制劑之間的相互作用。胰蛋白酶與胰蛋白酶抑制劑之間的相互作用。胰蛋白酶（黃色）與胰蛋白酶抑制劑（紅色）形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

28、抑制劑15位的賴氨酸插入酶活性位點，與酶活性位點的Asp189形成鹽鍵。結(jié)合抑制劑和游離抑制劑的結(jié)構(gòu)幾乎一致。胰蛋白酶量比抑制劑量大得多。為什么還要抑制劑？胰蛋白酶能夠活化其他酶原。因此阻止不當活化產(chǎn)生的少量胰蛋白酶活性是非常重要的。在胰臟或胰腺管，用抑制劑阻止胰蛋白酶活性，阻止酶活化對器官的傷害。否則會導(dǎo)致胰腺炎。1. a1-抗胰蛋白酶是嗜中性白細胞分泌的、大小為53kD的血漿蛋白，能夠保護組織免受彈性蛋白酶水解。嗜中性白細胞能吞噬細菌。該抑制劑對彈性蛋白酶抑制效率比它對胰蛋白酶活性的抑制效率高得多，因此稱之為抗彈性蛋白酶（anti-elastase）更準確。a1-抗胰蛋白酶與酶蛋白活性位點

29、結(jié)合幾乎不可逆，抑制彈性蛋白酶。a1-抗胰蛋白酶Z突變體的53位賴氨酸變成谷氨酰胺，抑制劑從肝臟向外分泌速度慢，血清抑制劑的水平相當于正常純合子水平的15%左右，導(dǎo)致血清彈性蛋白酶水平過高，后者水解彈性纖維和其它組織粘連蛋白，導(dǎo)致肺泡（alveolar）壁受損（肺氣腫）。吸煙能夠氧化這個抑制劑358位的甲硫氨酸（圖10.25）。358位甲硫氨酸是這個抑制劑與彈性蛋白酶結(jié)合所必需的氨基酸，它就是彈性蛋白酶結(jié)合這個抑制劑的誘餌誘餌。但是，甲硫氨酸的氧化產(chǎn)物不能誘導(dǎo)彈性蛋白酶?？矗粋€氧原子加入就徹底改變了這個蛋白質(zhì)的生物化學(xué)行為。10.26 血液凝固的級聯(lián)反血液凝固的級聯(lián)反應(yīng)。應(yīng)。內(nèi)在的、外在的、

30、和最后共同的途徑互作，形成纖維凝血快。內(nèi)在途徑從XII因子活化開始。XII因子與損傷產(chǎn)生的異常表面接觸產(chǎn)生活化。外在途徑由創(chuàng)傷啟動。創(chuàng)傷釋放組織因子(TF)。TF與VII因子形成復(fù)合物，活化凝血酶，啟動凝血反應(yīng)。無活性的凝血因子用紅色標出，相應(yīng)的活化成分后面添加下標字母a，用黃色標出。刺激蛋白不是自身的，用藍色框出。一個凝血因子的活化形式是下一個凝血因子活化的酶。級聯(lián)反應(yīng)最后一步是凝血酶催化將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白。纖維蛋白原是6條多肽鏈組成的340kD蛋白質(zhì)。三個球狀單位為兩個棒狀單位連接起來。Aa，Bb，和g鏈各有兩條。棒狀單位是三條多肽鏈構(gòu)成的a-螺旋的螺旋。a-螺旋的螺旋是蛋白質(zhì)分子

31、中重復(fù)出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。凝血酶酶切纖維蛋白原中央球部區(qū)域的4個Arg-Gly肽鍵。每條Bb多肽鏈釋放一條二十肽，每條Aa鏈釋放一條十八肽。這些A肽和B肽稱為纖維蛋白肽。缺乏纖維蛋白肽的纖維蛋白原分子叫纖維蛋白單體，有亞單位結(jié)構(gòu)(abg)2。 圖圖10.29 纖維蛋白凝塊的形成。纖維蛋白凝塊的形成。（1）凝血酶酶切纖維蛋白原中央球區(qū)域，釋放纖維蛋白肽A和B。b-和g-鏈C-端的球狀區(qū)域分別與b-和g-鏈新生的N-端鈕扣相互作用，形成凝血塊。圖圖10.28 纖維蛋白的電子顯微圖譜。纖維蛋白的電子顯微圖譜。沿纖維軸，每23nm出現(xiàn)一個重復(fù)，相當于纖維蛋白原分子長度的一半。這種交聯(lián)反應(yīng)受轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的催化

32、。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶就是有活性的凝血因子XIIIa。XIII因子前體（即轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶前體）受凝血酶催化。凝血酶基因的直接產(chǎn)物是凝血酶原，沒有活性，有四個主要的結(jié)構(gòu)域。N-端結(jié)構(gòu)域是gla結(jié)構(gòu)域，富含g-羧基谷氨酸。第二個和第三個結(jié)構(gòu)域是Kringle結(jié)構(gòu)域。C端結(jié)構(gòu)域是絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，保證凝血酶原處于無活性狀態(tài)，并能夠?qū)⒛冈f送到適當位點用Xa因子（絲氨酸蛋白酶）和Va因子(刺激蛋白)活化。凝血酶活化的起始是蛋白酶水解274位和275位氨基酸之間的肽鍵，釋放N-端的三個結(jié)構(gòu)域。Arg323-Ile324之間肽鍵（類似于胰凝乳蛋白酶原的關(guān)鍵肽鍵）的斷裂產(chǎn)生有活性的凝血酶。已

33、知凝血酶和其他因子的合成需要維生素K這一事實有多年。缺乏維生素K凝血有缺陷（koagulation是北歐的拼寫）。研究結(jié)果顯示，維生素K缺乏或者有維生素K的拮抗劑存在時，凝血酶前體合成異常，揭示維生素K的作用模式。雙香豆醇（dicoumarol）出現(xiàn)于腐敗三葉草，小牛食入這樣的干草患致命的出血病(hemorrhagic disease)。臨床上用這類雙香豆素衍生物作為抗凝劑，治療血栓。雙香豆醇和相關(guān)的維生素K拮抗劑如warfarin用作殺鼠劑。牛攝入雙香豆醇合成的凝血酶前體不能結(jié)合Ca2+，而正常的凝血酶前體能夠結(jié)合Ca2+。這個現(xiàn)象困擾多年，因為異常的凝血酶前體與正常的凝血酶前體氨基酸組成、

34、水解后氨基酸分析得結(jié)果都完全相同。凝血酶前體gla結(jié)構(gòu)域的g-羧基谷氨酸的合成依賴維生素K，催化這個反應(yīng)的酶是依賴于維生素K的羧化酶。殺鼠靈雙香豆醇凝血酶前體能夠與Ca2+結(jié)合。但是結(jié)合Ca2+有什么作用？損傷后，Ca2+結(jié)合能夠?qū)⒛盖绑w錨定在血小板磷脂雙層膜表面。這一步很關(guān)鍵，使凝血酶原到達兩個血凝蛋白附近，后者將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶。刪除Ca2+結(jié)合域，從膜上釋放凝血酶，使之能夠酶切纖維蛋白原和其他目標蛋白。 血友病揭示凝血過程的早期反應(yīng)血友病揭示凝血過程的早期反應(yīng) 在闡明凝血途徑方面很多重要的突破源于對出血疾病的研究。經(jīng)典的血友病，或血友病A，是大家熟知的凝血缺陷疾病，是性連鎖隱性遺

35、傳疾病。經(jīng)典的血友病，沒有內(nèi)在途徑的VIII因子（抗血友病因子）或者這個因子的含量非常低。盡管VIII因子自身不是蛋白酶，但是它能顯著促進X因子的活化。X因子活化的催化酶是IXa（一種絲氨酸蛋白酶）（圖10.33）。因此血友病的內(nèi)在凝血途徑嚴重受損。 過去輸入含有VIII因子的濃縮血漿治療血友病。這種治療技術(shù)有感染的風(fēng)險。實際上很多血友病患者有肝炎或最近流行的AIDS病。需要發(fā)展更為安全的VIII因子治療試劑。采用生物化學(xué)純化和DNA重組技術(shù)，用培養(yǎng)細胞表達VIII因子?，F(xiàn)在治療血友病多用重組VIII因子，很少用血漿純化的VIII因子。圖圖10.33 抗血友病因子（即抗血友病因子（即VIII因

36、子）的作用。因子）的作用?？寡巡∫蜃樱碫III因子）促進IXa因子催化的X因子的活化。凝血酶限制性酶切VIII因子能顯著增加VIII因子活性。一旦達到一定的閾值，這個正反饋能放大凝血信號，加速凝血過程。凝血必須迅速，局限于受傷區(qū)域。凝血區(qū)域局限于損傷位點的機制是什么？ 凝血因子的不穩(wěn)定性有助于凝血控制。由于血液流動稀釋迅速、肝臟清除、蛋白酶降解等原因，活化的凝血因子壽命短。例如蛋白酶C能夠降解Va和VIIIa。蛋白酶C是凝血酶活化的蛋白酶。因此凝血酶有雙重活性，即催化纖維蛋白形成，啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)途徑銷毀。凝血因子的特殊抑制劑也是終止凝血過程所必需的。例如，組織因子途徑抑制劑（TFPI）抑制TF-VIIa-Xa復(fù)合物，TFPI獨立的結(jié)構(gòu)域能夠抑制VIIa和Xa。另一個關(guān)鍵的抑制劑是抗凝血因子抗凝血