糖化酶的固定化及其在葡萄糖-生產中的應用工藝

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上廣 州 大 學實 驗 報 告 實驗名稱：糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產中的應用工藝學 院：生命科學學院專業(yè)年級：學 號：姓 名： 組 員： 指導老師：王小蘭、柯德森摘要：利用有關固定化酶的理論和方法，研究固定化糖化酶的效率與固定時間的關系。本實驗中測定固定化糖化酶偶聯率、相對活力、活力回收來衡量其生產工藝的優(yōu)劣，并探討糖化酶的濃度對固定化效果及結合牢固程度的影響和驗證固定化糖化酶催化生產葡萄糖的重復使用能力及其效率。制備固定化糖化酶的方法為離子吸附法，并且使用DNS法測定固定化酶的活力。結果顯示：在該次實驗中，固定化60min時，固定化糖化酶的效率最好；固定化10mi

2、n時，固定化酶的活力回收為3.47，偶聯率為48.10，相對活力為7.23；固定化20min時，固定化酶的活力回收為4.74，偶聯率為54.76，相對活力為8.66；固定化30min時，固定化酶的活力回收為4.71，偶聯率為53.42，相對活力為8.82；固定化40min時，固定化酶的活力回收為3.84，偶聯率為58.13，相對活力為6.62；固定化50min時，固定化酶的活力回收為4.04，偶聯率為60.59，相對活力為6.67；固定化60min時，固定化酶的活力回收為6.34，偶聯率為70.00，相對活力為9.06。重復使用葡萄糖固定化酶的過程中，固定化酶的利用效率降低。酶與載體的濃度比例

3、較高固定化酶葡萄糖生產效率高。 關鍵詞：固定化酶 效率 時間 酶活力1、前言：糖化酶，又稱糖淀粉酶，糖化酶的底物專一性較低，它除了能從淀粉鏈的非還原性未端切開a-1.4鍵處，也能緩慢切開a-1.6。因此，它能很快的把從非還原性未端依次切下葡萄單位，在遇到1.6鍵分割，先將a-1.6鍵分割，再將a-1.4鍵分割，從而使水解成葡萄糖。糖化酶用于以作的各種抗生素、維生素的發(fā)酵；本品還大量用于生產各種規(guī)格的葡萄糖。總之，凡對淀粉、糊精必需進行酶水解的工業(yè)上，都可適用。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復多次使用。便于運輸和貯存，有利于自動化生產，但是活性降低，使用范圍減小，

4、技術還有發(fā)展空間。固定化酶是近十余年發(fā)展起來的酶應用技術，在工業(yè)生產、化學分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應用前景。酶的固定化方法通常按照用于結合的化學反應的類型進行分類，大致有三種：非共價結合法、化學結合法、包埋法。本實驗利用離子結合法制備固定化糖化酶。離子結合法就是酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的不溶性載體的固定化方法，常用的載體有：DEAE-纖維素，DEAE-葡萄糖凝膠,CM-纖維素等。本實驗采用:GF-201大孔強堿陰離子交換樹脂，應用離子交換結合法制備固定化酶，該法操作簡單，條件溫和，酶活性中心和高級結構不易受到破壞，酶活回收率比較高。其缺點是：結合力弱，容易脫落，受溶液離子強度和pH影響

5、較大。使用共價結合法不會使酶容易脫落，國外研究者已研究出用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生物偶聯糖化酶，結果使酶活較高，并且能連續(xù)生產3個酶半衰期。在此次實驗中還使用用DNS法測定固定化酶、殘留酶、原酶的活力。2、材料與方法：2.1材料（1）糖化酶液，GF-201大孔強堿陰離子交換劑，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基蘭，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，乙酸，乙酸鈉(配制pH4.6緩沖液)，無水乙醇，鹽酸。硫代硫酸鈉（0.05M），碘溶液（次碘酸鈉，0.1M）。硫酸2M。 （2）酶液、固定化酶及固定化后的殘留酶液。2.2實

6、驗儀器恒溫水浴鍋（可達99，5個），酸度計（3個），容量瓶，量筒，燒杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，錐形瓶，試管架，吸耳球，pH試紙，濾紙，離心機，離心管，分光光度計等。2.3試劑（1）標準葡萄糖溶液（1mg/mL）：精確稱取100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液 A液：（0.1mol/L 檸檬酸）

7、：稱取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。（4）1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。2.4操作步驟2.4.1試劑的配制（1）糖化酶液：市售商品化糖化酶,去離子pH7的磷酸緩沖液配制，根據標稱的活力單位配制為1萬單位/ml的溶液，離心去除不溶性雜質，共配4000ml, 4備用。（2）2mol/L氫氧化鈉：8gN

8、aOH-100ml，共配3000ml。（3）2mol/LHCL:17ml濃鹽酸-100ml，共配3000ml。2.4.2固定化酶實驗步驟（1）載體的預處理A：乙醇處理：15克濕離子交換劑-50ml燒杯加入30ml去離子水，攪拌，倒去水。注入2倍體積無水乙醇，乙醇浸泡過夜（12h），然后用去離子水連續(xù)沖洗以除去乙醇。B：堿處理：2倍體積（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分攪拌，再以去離子水沖至pH6.0-7.0C：酸處理:用2倍體積的2mol/L HCl溶液處理陰離子交換樹脂，然后用去離子水洗至pH6.0。D：重復B（2） 酶的固定化取4份糖化酶液，每份30ml，分別倒入4個貯液槽中，并

9、各加入預處理的離子交換劑15g，不斷輕輕攪拌，開始進行酶的固定化。分別在10min、20min、30min、60min后過濾去未固定的酶液，測量每份固定化酶及反應后殘留酶液活性。保存固定化后的酶于冰箱以備下一實驗。2.4.3葡萄糖標準曲線的制作取7支干凈的具塞刻度試管（可用封口膠代替），編號，按表1加入試劑：表1 葡萄糖標準曲線制作試 劑管 號1234567葡萄糖標準液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0搖勻

10、，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定光密度。以葡萄糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。（2） 酶活力的測定：取6支干凈的試管，編號，按表3-2進行操作。表3-2 酶活力測定取樣表操作項目淀粉酶活力測定固定化酶活力測定1%淀粉溶液/ml1.01.01.01.01.01.0預保溫將各試管和淀粉酶溶液置于40恒溫水溶液中保溫10min淀粉酶原液/ml0.10.10.10.2g0.2g0.2g保溫（空白管的酶預先煮沸失活）在40恒溫水溶液中準確保溫5min取反應液0.1ml，加入去1.9ml水，迅速加入以下DNS

11、3,5-二硝基水楊酸/ml2.02.02.002.02.0將各試管搖勻，顯色后進行比色測定光密度，記錄測定結果，操作同標準曲線（煮沸，定容）。， 2.4.5 裝柱模擬葡萄糖的生產將上周保存于冰箱的固定化酶全部裝柱，加足夠量的淀粉溶液進行洗脫操作，每隔5min取樣一次，共取16次。同樣處理后在540nm波長下比色測定每個樣品的光密度。（3） 實驗結果處理 在標準曲線上查出相應的葡萄糖含量（mg）,按下列公式計算酶活力。 酶活力單位（U）=1mol葡萄糖產生量/min 計算每毫升酶液及每克固定化酶的活力，計算殘留酶活力，從而計算酶偶聯率及相對活力，評價固定化的效果。3 實驗結果及數據分析3.1葡萄

12、糖標準曲線表3 葡萄糖標準曲線制作（葡萄糖含量/mg）試管號1234567葡萄糖含量/mg00.20.61.01.41.82.0A54000.0370.1710.3150.4540.6010.655表4 原酶吸光值原酶12A5400.2440.272A540平均值0.258酶活力單位0.8199總活力單位819.9表5 固定化酶與殘留酶吸光值固定化時間（min）A540含量殘留酶平均值固定化酶平均值殘留液體積（mL）固定化酶含量（g）100.2890.2970.2930.1510.1400.14554517.1200.2980.3420.320.2430.2590.2514715.6300.2

13、690.2530.2610.2390.2270.2334616.1400.2390.2710.2550.2480.2580.2534814500.2370.2190.2280.2860.2480.2674314600.1830.1890.1860.2920.2860.2894816.9表6實驗結果計算固定化時間（min）殘留酶葡萄糖含量（g）固定化酶葡萄糖含量（g）0.1mL殘留酶活力單位0.2g固定化酶活力單位殘留酶總活力單位固定化酶總活力單位活力回收相對活力偶聯率1044.328.348.8641.668425.47228.52283.477.2348.102043.1312.478.62

14、62.494370.91838.90644.748.6654.763039.7812.017.9562.402381.88838.67224.718.8253.424037.3111.277.4622.254343.25231.5563.846.6258.135034.3711.856.8742.37323.07833.184.046.6760.596027.3315.405.4663.08245.9752.0526.349.0670.00表7 固定化10min第一次生產A540試管號A540淀粉溶液體積（mL）生產時間（min）樣品葡萄糖含量總葡萄糖含量葡萄糖生產效率10.1393050.4

15、6914.0572.81120.137100.46313.8802.77630.133150.45113.5252.70540.129200.43913.1712.63450.124250.42412.7282.54660.121300.41512.4622.49270.117350.40412.1082.42280.116400.40112.0192.404表8固定化10min第二次生產A540試管號A540淀粉溶液體積（mL）生產時間（min）樣品葡萄糖含量總葡萄糖含量葡萄糖生產效率10.1133050.39111.732.34620.102100.35910.772.15430.0891

16、50.3209.61.9240.077200.2858.551.7150.059250.2326.961.39260.036300.1644.920.98470.022350.1233.690.73880.018400.1113.330.6664 結論由表5、表6可知，固定化酶的活力回收、相對活力、 偶聯率均隨著固定化的時間的增加而增加，因此固定化酶效果最好的是60min。我們小組做的固定化10min，所以以下分析根據固定化10min的結果進行分析！固定化酶總活力單位加殘留酶總活力單位僅為453.9948，而原酶總活力單位有819.9，占比為55%，可能原因有：在固定化過程中，損耗的固定化酶的

17、質量太多；殘留液測量不準確；有可能在測量酶活的時候先加入 3,5-二硝基水楊酸后加入酶液，導致計算過程中有大誤差。在兩次生產過程中，葡萄糖生產效率隨著時間的減小而減小，符合生產規(guī)律。葡萄糖生產效率最高的時間點為前5min。5.實驗心得 在本次實驗過程中，我們學習到了如何正確的固定化酶，雖然固定化酶的相對活力很低，但是在這過程中，我們學會了很多新知識，我們可以自己實操地生產出固定化酶，可以簡單地使用固定化酶生產葡萄糖，這對于我們的相關知識得到了鞏固！感謝王老師以及柯老師的悉心教導，也謝謝組員們的相互配合！6.參考文獻1 柯德森.生物工程下游技術實驗手冊.北京:科學出版社.2010.2 陳雄.  固定化糖