糖化酶的固定化及其在葡萄糖-生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上廣 州 大 學(xué)實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 實(shí)驗(yàn)名稱：糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級(jí)：學(xué) 號(hào)：姓 名： 組 員： 指導(dǎo)老師：王小蘭、柯德森摘要：利用有關(guān)固定化酶的理論和方法，研究固定化糖化酶的效率與固定時(shí)間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定固定化糖化酶偶聯(lián)率、相對(duì)活力、活力回收來(lái)衡量其生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣，并探討糖化酶的濃度對(duì)固定化效果及結(jié)合牢固程度的影響和驗(yàn)證固定化糖化酶催化生產(chǎn)葡萄糖的重復(fù)使用能力及其效率。制備固定化糖化酶的方法為離子吸附法，并且使用DNS法測(cè)定固定化酶的活力。結(jié)果顯示：在該次實(shí)驗(yàn)中，固定化60min時(shí)，固定化糖化酶的效率最好；固定化10mi

2、n時(shí)，固定化酶的活力回收為3.47，偶聯(lián)率為48.10，相對(duì)活力為7.23；固定化20min時(shí)，固定化酶的活力回收為4.74，偶聯(lián)率為54.76，相對(duì)活力為8.66；固定化30min時(shí)，固定化酶的活力回收為4.71，偶聯(lián)率為53.42，相對(duì)活力為8.82；固定化40min時(shí)，固定化酶的活力回收為3.84，偶聯(lián)率為58.13，相對(duì)活力為6.62；固定化50min時(shí)，固定化酶的活力回收為4.04，偶聯(lián)率為60.59，相對(duì)活力為6.67；固定化60min時(shí)，固定化酶的活力回收為6.34，偶聯(lián)率為70.00，相對(duì)活力為9.06。重復(fù)使用葡萄糖固定化酶的過(guò)程中，固定化酶的利用效率降低。酶與載體的濃度比例

3、較高固定化酶葡萄糖生產(chǎn)效率高。 關(guān)鍵詞：固定化酶 效率 時(shí)間 酶活力1、前言：糖化酶，又稱糖淀粉酶，糖化酶的底物專一性較低，它除了能從淀粉鏈的非還原性未端切開(kāi)a-1.4鍵處，也能緩慢切開(kāi)a-1.6。因此，它能很快的把從非還原性未端依次切下葡萄單位，在遇到1.6鍵分割，先將a-1.6鍵分割，再將a-1.4鍵分割，從而使水解成葡萄糖。糖化酶用于以作的各種抗生素、維生素的發(fā)酵；本品還大量用于生產(chǎn)各種規(guī)格的葡萄糖?？傊矊?duì)淀粉、糊精必需進(jìn)行酶水解的工業(yè)上，都可適用。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用。便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)，但是活性降低，使用范圍減小，

4、技術(shù)還有發(fā)展空間。固定化酶是近十余年發(fā)展起來(lái)的酶應(yīng)用技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景。酶的固定化方法通常按照用于結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)的類型進(jìn)行分類，大致有三種：非共價(jià)結(jié)合法、化學(xué)結(jié)合法、包埋法。本實(shí)驗(yàn)利用離子結(jié)合法制備固定化糖化酶。離子結(jié)合法就是酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的不溶性載體的固定化方法，常用的載體有：DEAE-纖維素，DEAE-葡萄糖凝膠,CM-纖維素等。本實(shí)驗(yàn)采用:GF-201大孔強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)脂，應(yīng)用離子交換結(jié)合法制備固定化酶，該法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，酶活性中心和高級(jí)結(jié)構(gòu)不易受到破壞，酶活回收率比較高。其缺點(diǎn)是：結(jié)合力弱，容易脫落，受溶液離子強(qiáng)度和pH影響

5、較大。使用共價(jià)結(jié)合法不會(huì)使酶容易脫落，國(guó)外研究者已研究出用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生物偶聯(lián)糖化酶，結(jié)果使酶活較高，并且能連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)酶半衰期。在此次實(shí)驗(yàn)中還使用用DNS法測(cè)定固定化酶、殘留酶、原酶的活力。2、材料與方法：2.1材料（1）糖化酶液，GF-201大孔強(qiáng)堿陰離子交換劑，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基蘭，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，乙酸，乙酸鈉(配制pH4.6緩沖液)，無(wú)水乙醇，鹽酸。硫代硫酸鈉（0.05M），碘溶液（次碘酸鈉，0.1M）。硫酸2M。 （2）酶液、固定化酶及固定化后的殘留酶液。2.2實(shí)

6、驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋（可達(dá)99，5個(gè)），酸度計(jì)（3個(gè)），容量瓶，量筒，燒杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，錐形瓶，試管架，吸耳球，pH試紙，濾紙，離心機(jī)，離心管，分光光度計(jì)等。2.3試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1mg/mL）：精確稱取100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過(guò)濾后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液 A液：（0.1mol/L 檸檬酸）

7、：稱取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。（4）1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。2.4操作步驟2.4.1試劑的配制（1）糖化酶液：市售商品化糖化酶,去離子pH7的磷酸緩沖液配制，根據(jù)標(biāo)稱的活力單位配制為1萬(wàn)單位/ml的溶液，離心去除不溶性雜質(zhì)，共配4000ml, 4備用。（2）2mol/L氫氧化鈉：8gN

8、aOH-100ml，共配3000ml。（3）2mol/LHCL:17ml濃鹽酸-100ml，共配3000ml。2.4.2固定化酶實(shí)驗(yàn)步驟（1）載體的預(yù)處理A：乙醇處理：15克濕離子交換劑-50ml燒杯加入30ml去離子水，攪拌，倒去水。注入2倍體積無(wú)水乙醇，乙醇浸泡過(guò)夜（12h），然后用去離子水連續(xù)沖洗以除去乙醇。B：堿處理：2倍體積（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分?jǐn)嚢?，再以去離子水沖至pH6.0-7.0C：酸處理:用2倍體積的2mol/L HCl溶液處理陰離子交換樹(shù)脂，然后用去離子水洗至pH6.0。D：重復(fù)B（2） 酶的固定化取4份糖化酶液，每份30ml，分別倒入4個(gè)貯液槽中，并

9、各加入預(yù)處理的離子交換劑15g，不斷輕輕攪拌，開(kāi)始進(jìn)行酶的固定化。分別在10min、20min、30min、60min后過(guò)濾去未固定的酶液，測(cè)量每份固定化酶及反應(yīng)后殘留酶液活性。保存固定化后的酶于冰箱以備下一實(shí)驗(yàn)。2.4.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支干凈的具塞刻度試管（可用封口膠代替），編號(hào)，按表1加入試劑：表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試 劑管 號(hào)1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0搖勻

10、，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2） 酶活力的測(cè)定：取6支干凈的試管，編號(hào)，按表3-2進(jìn)行操作。表3-2 酶活力測(cè)定取樣表操作項(xiàng)目淀粉酶活力測(cè)定固定化酶活力測(cè)定1%淀粉溶液/ml1.01.01.01.01.01.0預(yù)保溫將各試管和淀粉酶溶液置于40恒溫水溶液中保溫10min淀粉酶原液/ml0.10.10.10.2g0.2g0.2g保溫（空白管的酶預(yù)先煮沸失活）在40恒溫水溶液中準(zhǔn)確保溫5min取反應(yīng)液0.1ml，加入去1.9ml水，迅速加入以下DNS

11、3,5-二硝基水楊酸/ml2.02.02.002.02.0將各試管搖勻，顯色后進(jìn)行比色測(cè)定光密度，記錄測(cè)定結(jié)果，操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線（煮沸，定容）。， 2.4.5 裝柱模擬葡萄糖的生產(chǎn)將上周保存于冰箱的固定化酶全部裝柱，加足夠量的淀粉溶液進(jìn)行洗脫操作，每隔5min取樣一次，共取16次。同樣處理后在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定每個(gè)樣品的光密度。（3） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量（mg）,按下列公式計(jì)算酶活力。 酶活力單位（U）=1mol葡萄糖產(chǎn)生量/min 計(jì)算每毫升酶液及每克固定化酶的活力，計(jì)算殘留酶活力，從而計(jì)算酶偶聯(lián)率及相對(duì)活力，評(píng)價(jià)固定化的效果。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析3.1葡萄

12、糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（葡萄糖含量/mg）試管號(hào)1234567葡萄糖含量/mg00.20.61.01.41.82.0A54000.0370.1710.3150.4540.6010.655表4 原酶吸光值原酶12A5400.2440.272A540平均值0.258酶活力單位0.8199總活力單位819.9表5 固定化酶與殘留酶吸光值固定化時(shí)間（min）A540含量殘留酶平均值固定化酶平均值殘留液體積（mL）固定化酶含量（g）100.2890.2970.2930.1510.1400.14554517.1200.2980.3420.320.2430.2590.2514715.6300.2

13、690.2530.2610.2390.2270.2334616.1400.2390.2710.2550.2480.2580.2534814500.2370.2190.2280.2860.2480.2674314600.1830.1890.1860.2920.2860.2894816.9表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算固定化時(shí)間（min）殘留酶葡萄糖含量（g）固定化酶葡萄糖含量（g）0.1mL殘留酶活力單位0.2g固定化酶活力單位殘留酶總活力單位固定化酶總活力單位活力回收相對(duì)活力偶聯(lián)率1044.328.348.8641.668425.47228.52283.477.2348.102043.1312.478.62

14、62.494370.91838.90644.748.6654.763039.7812.017.9562.402381.88838.67224.718.8253.424037.3111.277.4622.254343.25231.5563.846.6258.135034.3711.856.8742.37323.07833.184.046.6760.596027.3315.405.4663.08245.9752.0526.349.0670.00表7 固定化10min第一次生產(chǎn)A540試管號(hào)A540淀粉溶液體積（mL）生產(chǎn)時(shí)間（min）樣品葡萄糖含量總葡萄糖含量葡萄糖生產(chǎn)效率10.1393050.4

15、6914.0572.81120.137100.46313.8802.77630.133150.45113.5252.70540.129200.43913.1712.63450.124250.42412.7282.54660.121300.41512.4622.49270.117350.40412.1082.42280.116400.40112.0192.404表8固定化10min第二次生產(chǎn)A540試管號(hào)A540淀粉溶液體積（mL）生產(chǎn)時(shí)間（min）樣品葡萄糖含量總葡萄糖含量葡萄糖生產(chǎn)效率10.1133050.39111.732.34620.102100.35910.772.15430.0891

16、50.3209.61.9240.077200.2858.551.7150.059250.2326.961.39260.036300.1644.920.98470.022350.1233.690.73880.018400.1113.330.6664 結(jié)論由表5、表6可知，固定化酶的活力回收、相對(duì)活力、 偶聯(lián)率均隨著固定化的時(shí)間的增加而增加，因此固定化酶效果最好的是60min。我們小組做的固定化10min，所以以下分析根據(jù)固定化10min的結(jié)果進(jìn)行分析！固定化酶總活力單位加殘留酶總活力單位僅為453.9948，而原酶總活力單位有819.9，占比為55%，可能原因有：在固定化過(guò)程中，損耗的固定化酶的

17、質(zhì)量太多；殘留液測(cè)量不準(zhǔn)確；有可能在測(cè)量酶活的時(shí)候先加入 3,5-二硝基水楊酸后加入酶液，導(dǎo)致計(jì)算過(guò)程中有大誤差。在兩次生產(chǎn)過(guò)程中，葡萄糖生產(chǎn)效率隨著時(shí)間的減小而減小，符合生產(chǎn)規(guī)律。葡萄糖生產(chǎn)效率最高的時(shí)間點(diǎn)為前5min。5.實(shí)驗(yàn)心得 在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們學(xué)習(xí)到了如何正確的固定化酶，雖然固定化酶的相對(duì)活力很低，但是在這過(guò)程中，我們學(xué)會(huì)了很多新知識(shí)，我們可以自己實(shí)操地生產(chǎn)出固定化酶，可以簡(jiǎn)單地使用固定化酶生產(chǎn)葡萄糖，這對(duì)于我們的相關(guān)知識(shí)得到了鞏固！感謝王老師以及柯老師的悉心教導(dǎo)，也謝謝組員們的相互配合！6.參考文獻(xiàn)1 柯德森.生物工程下游技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè).北京:科學(xué)出版社.2010.2 陳雄.  固定化糖