殺菌劑毒力測(cè)定

1、.1 殺菌劑生物測(cè)定殺菌劑生物測(cè)定.2第三章第三章 殺菌劑毒力測(cè)定殺菌劑毒力測(cè)定l室內(nèi)測(cè)定與田間試驗(yàn)有一定的差異l殺菌劑田間藥效試驗(yàn)受寄主(作物)、環(huán)境、以及發(fā)病階段的影響較大。.3第三章第三章 殺菌劑毒力測(cè)定殺菌劑毒力測(cè)定l多菌靈對(duì)鐮刀菌及由鐮刀菌引起的赤霉病、惡苗病的室內(nèi)毒力測(cè)定和田間藥效比較一致。l但多菌靈在室內(nèi)測(cè)定對(duì)由鐮刀菌引起的棉花枯萎病效果較好，而田間多菌靈對(duì)棉花枯萎病效果較差。.4第三章第三章 殺菌劑毒力測(cè)定殺菌劑毒力測(cè)定l三環(huán)唑（黑色素合成抑制劑）在室內(nèi)測(cè)是無(wú)效的。l嘧啶胺類殺菌劑（嘧菌胺）室內(nèi)對(duì)灰霉病孢子萌發(fā)沒有抑制作用（300L/ ml），但在植物上(1L/ ml)，對(duì)灰霉

2、病防效較好。(該類藥劑能抑制病菌甲硫氨酸的生物合成和細(xì)胞壁降解酶的分泌，從而影響病菌侵入寄主植物).5一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1、孢子萌發(fā)法 (spore germination method)l快速。廣泛用于保護(hù)劑的測(cè)定l此法適用于抑制病菌能量合成系統(tǒng)，而使孢子不能萌發(fā)的殺菌劑。.6一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.1 玻璃器皿的處理l清潔：以洗液浸泡數(shù)十分鐘,用自來水沖洗, 用蒸餾水清洗,防塵干燥.l載玻片保存于70%的酒精溶液內(nèi).7一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.2 液劑的附著lA、混合滴加l將供試藥劑與孢子懸浮液混合滴加于載玻片上

3、。對(duì)水溶性藥和穩(wěn)定的懸浮劑可得到正確的結(jié)果。對(duì)于非水溶性藥劑，因沉降快而不易獲得正確結(jié)果。l簡(jiǎn)單迅速，適于大規(guī)模初篩。測(cè)得結(jié)果一般偏高。.8一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法lB、定量滴加藥膜法l定量滴加藥液（用水或有機(jī)溶劑均可），形成均勻的藥膜，再滴加孢子液。l許多有機(jī)溶劑（丙酮、乙醚）表面張力小，不易形成均勻的藥膜，因此，應(yīng)采用凹玻片。防塵條件下干燥。.9一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法lC、裝置噴霧l利用精確噴霧裝置將藥液噴于載玻片上，干燥后滴加孢子懸浮液。.10一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制l孢子萌發(fā)法常用菌種l馬鈴薯晚疫病，

4、水稻稻瘟病，小麥赤霉病，甘薯黑疤病，水稻胡麻葉斑病，玉米大斑病。.11一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制l真菌在一定條件下才產(chǎn)生孢子，一般來說，生殖生長(zhǎng)的條件比較嚴(yán)格。lA、改變培養(yǎng)基成分：先在高濃度養(yǎng)分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再移到營(yíng)養(yǎng)成分較低的培養(yǎng)基中，可促進(jìn)孢子的產(chǎn)生。.12一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制lB、選用不同培養(yǎng)基：l植物質(zhì)培養(yǎng)基或利用植物的組織或它們的煎汁往往可促進(jìn)真菌產(chǎn)生孢子。.13一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制lC、培養(yǎng)基的理化性狀l增加培養(yǎng)基的酸度，可促進(jìn)某些真菌產(chǎn)生孢

5、子。固體培養(yǎng)基上比液體培養(yǎng)基上容易產(chǎn)生孢子。.14一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制lD、病菌培養(yǎng)條件l高溫、低溫或高低溫交替有時(shí)可促進(jìn)孢子的產(chǎn)生。一般半知菌在有光照的條件下易產(chǎn)生孢子。但有的病菌在無(wú)光下易產(chǎn)生孢子。.15一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.3孢子懸浮液的配制l配制：一般將已培養(yǎng)好的菌種（斜面或三角瓶培養(yǎng)）加入無(wú)菌水，用接種環(huán)在表面輕輕摩擦，使孢子懸浮于水中，然后用雙層紗布過濾，除去菌絲體和培養(yǎng)基碎塊。最好在1000r/min的離心機(jī)上用無(wú)菌水洗滌三次。l一般規(guī)定孢子的濃度最好是5萬(wàn)/ml。10*10觀察時(shí)，每個(gè)視野約有35個(gè)。.

6、16一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l孢子濃度可用計(jì)數(shù)器測(cè)定l紐鮑爾（Neubauer）血球計(jì)數(shù)器。l邊長(zhǎng)為0.05mm的小方格，深度為0.1mm.17一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lA、溫度：各種真菌孢子萌發(fā)的最適溫度不同。適于低溫的孢子，如小麥黑穗病菌的厚垣孢子，溫度超過2122 就不能萌發(fā)。.18一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lB、濕度：真菌孢子一般要求在水滴中才能萌發(fā)，但也有少數(shù)真菌孢子，如白粉病菌的分生孢子，在相對(duì)濕度很低的情況下也能萌發(fā)。.19一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.4 孢

7、子萌發(fā)條件lC：光照：光照對(duì)多數(shù)真菌孢子萌發(fā)的影響不大，但對(duì)某些真菌孢子有刺激或抑制作用，如光照可刺激水稻黑粉病菌厚垣孢子的萌發(fā)，抑制小麥稈銹病菌夏孢子的萌發(fā)。.20一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lD：空氣：孢子萌發(fā)多需要空氣，所以水滴表面的孢子比沉在水滴中的萌發(fā)好。但玉米黑粉病菌孢子萌發(fā)需要15%的CO2。.21一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lD：養(yǎng)分：有的不需外源養(yǎng)分，有的則必須由外界提供養(yǎng)分。l植物組織煎汁常常是促進(jìn)孢子萌發(fā)的物質(zhì)，其刺激作用是因?yàn)楹猩L(zhǎng)素或揮發(fā)性物質(zhì)。但有研究表明，萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)可增加孢子對(duì)藥劑的抵

8、抗力。.22一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l有些病菌在蒸餾水中萌發(fā)不好，可加入某些促進(jìn)物質(zhì)。許多病菌孢子，按10毫升孢子液加入0.1%葡萄糖溶液0.01毫升，可使孢子萌發(fā)整齊。l玉米小斑病菌孢子，適當(dāng)加入一點(diǎn)玉米苗的新鮮汁液，在26下2h，孢子萌發(fā)率高，整齊。.23一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.5 調(diào)查方法l一般病菌培養(yǎng)2024小時(shí)即可鏡檢。一般在100200倍下鏡檢，每處理隨機(jī)檢查200個(gè)孢子。l孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：芽管大于孢子短半徑即算萌發(fā)。l或以孢子囊產(chǎn)生游動(dòng)孢子為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，如馬鈴薯晚疫病菌。.24一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l1.5 調(diào)查方法

9、l對(duì)照萌發(fā)率至少大于80%，低于80%應(yīng)重做。%100對(duì)照萌發(fā)率處理萌發(fā)率對(duì)照萌發(fā)率抑制萌發(fā)率.25Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl1. 試驗(yàn)靶標(biāo)l易產(chǎn)生孢子,便于鏡檢,如稻瘟病菌,梨黑星病菌等.在培養(yǎng)基上培養(yǎng),或?qū)⒉〗M織保濕培養(yǎng),待產(chǎn)生孢子后備用。.26Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl2. 孢子懸浮液配制l將培養(yǎng)好的病原真菌孢子用去離子

10、水從培養(yǎng)基或病組織上洗脫、過濾、離心（1000r/min）5min，倒去上清液，加入去離子水，再離心。最后用去離子水將孢子重懸浮至每毫升105107個(gè)孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液。.27Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl3. 藥劑的配制l水溶性藥劑直接用水溶解，其它藥劑選用合適的有機(jī)溶劑（甲醇、丙酮、二甲基亞砜等）溶解，再用0.1%的吐溫80水溶液稀釋，設(shè)置57個(gè)濃度，有機(jī)溶劑最終含量不超過2%.28Determining fungicide inhibition

11、of pathogen spore germination on concave slidesl4. 藥劑處理l使藥液與孢子懸浮液在小試管中等量混合均勻。用微量加樣器吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后架放于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中，加蓋保濕培養(yǎng)。每處理不少于3次重復(fù)。.29Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl5. 調(diào)查l當(dāng)空白對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)，每重復(fù)了隨機(jī)觀察3個(gè)以上視野，調(diào)查孢子總數(shù)不少于200個(gè)，分別記錄萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)。.30Determining fun

12、gicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl6. 數(shù)據(jù)處理l計(jì)算校正的孢子萌發(fā)率，求出毒力回歸線，EC50，EC90及95%置信限。.31一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 生長(zhǎng)速率法(mycelium growth rate test)l將不同濃度的藥液與融化的培養(yǎng)基混合，制成帶毒培養(yǎng)基平面，在平面上接種病原菌，以病原菌生長(zhǎng)速度快慢來判定藥劑毒力大小。.32一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 生長(zhǎng)速率法l病菌易培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)快，不易產(chǎn)生孢子。l棉花炭疽、紅麻炭疽、小麥赤霉等病菌

13、具有生長(zhǎng)快速、整齊、平伏的特點(diǎn)，有利于此法測(cè)定。.33一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 .1 含毒培養(yǎng)基的制備l一般以1ml藥液加入 9ml培養(yǎng)為宜,這樣的比例不會(huì)影響培養(yǎng)基凝固.l對(duì)揮發(fā)性強(qiáng)、受熱易分解的藥劑應(yīng)注意培養(yǎng)基的溫度，最好當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到50左右時(shí)再加入藥劑。.34一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 .2 接種病原菌l菌餅接種法：0.4cm的打孔器打出菌餅，用接種針或鑷子放入含毒培養(yǎng)基的中央。.35一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 .2 接種病原菌l劃線接種法：用接種針沾取病菌孢子液在培養(yǎng)基上劃一直線進(jìn)行接種，培養(yǎng)一段時(shí)間后，測(cè)量菌絲伸向

14、直線垂直方向的長(zhǎng)度。.36一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l2 .3結(jié)果檢查及其表示方法l十字交叉測(cè)2個(gè)直徑，以其平均值代表菌落大小。%1001菌餅直徑對(duì)照菌落直徑菌餅直徑處理菌落直徑抑制生長(zhǎng)率.37一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l3 濾紙片附著法(adsorption technique)l此法是將真菌孢子懸浮液用適當(dāng)方法附著在滅菌的濾紙片上，使其接觸一系列不同濃度的藥劑，放在一定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。.38一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l3 濾紙片附著法l定性濾紙滅菌（130，1h），70-80%的酒精20-30分鐘， 滴加孢子懸浮

15、液，無(wú)菌干燥，浸入藥液中10分鐘，放入培養(yǎng)基上培養(yǎng)。.39一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法（抑菌圈法,detection of inhibition zone）l基本原理是在已接種的瓊脂培養(yǎng)基上加少量的抗菌物質(zhì)，使其接觸培養(yǎng)基和病原菌，經(jīng)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，接觸部分的周圍由于抗菌物質(zhì)的擴(kuò)散而產(chǎn)生抑菌圈。l擴(kuò)散法廣泛用于醫(yī)用和農(nóng)用抗菌物質(zhì)的篩選和抗菌性物質(zhì)有效成分的定量.40一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法l管碟法：國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)抗菌素效價(jià)測(cè)定l將直徑9.0cm的培養(yǎng)皿保持水平，倒入約20ml瓊脂培養(yǎng)基，凝固后作為底層，然后將馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基溶化

16、，在5060時(shí)，接種供試菌（細(xì)菌、霉菌孢子），取其少量均勻倒入培養(yǎng)皿的底層培養(yǎng)基上，做成試驗(yàn)平面（菌層）。.41一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法l管碟法：l在試驗(yàn)平面上放4個(gè)牛津杯（外徑8mm，內(nèi)徑6mm，高10mm）。用移液管將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和不同濃度的待測(cè)液移圓筒內(nèi)，在適溫下培養(yǎng)，讓其形成抑菌圈。測(cè)其直徑。.42一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法：農(nóng)用抗菌素效價(jià)測(cè)定l抗菌素效價(jià)的衡量單位分兩類：lA、稀釋單位，將1mg抗菌素配成溶液，在一定條件下進(jìn)行稀釋，對(duì)某一細(xì)菌能抑制其生長(zhǎng)的最高稀釋度，即為1mg抗菌素所含的單位。如1mg青霉素，在一定條

17、件下稀釋3600倍能抑制白色念球菌的繁殖，則1mg青霉素含有3600單位。.43一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法：農(nóng)用抗菌素效價(jià)測(cè)定lB、重量單位，將純凈的抗菌素直接作為抗菌素效能的衡量單位，即1g相當(dāng)于于1個(gè)單位。例如，純凈的1mg鏈霉素含有1000個(gè)單位。.44一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l4 擴(kuò)散法：l濾紙片法：藥劑加于一定大小的圓形濾紙片上。l孔碟法：在培養(yǎng)基上打孔或留孔，藥液加于此孔內(nèi)。l滴下法：利用注射器、毛細(xì)管、移液管等將藥液直接滴加于培養(yǎng)基上。.45一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l5 稀釋法(最低抑制濃度測(cè)定法, deter

18、mination of minimum inhibitory concentration)l在液體或固體培養(yǎng)基中，加入一系列濃度的供試藥液，分別注入滅菌的試管或培養(yǎng)皿內(nèi)，在其中接種供試菌進(jìn)行培養(yǎng)，把具有使病菌發(fā)育完全停止的最低濃度定為抗菌力的指標(biāo)。l此法也可用抗菌素的效價(jià)測(cè)定。.46一、殺菌劑毒力測(cè)定方法一、殺菌劑毒力測(cè)定方法l6 氣體效力測(cè)定法l一般把表示揮發(fā)物質(zhì)的抗菌力叫氣體效果。l一般在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)固定的培養(yǎng)上接種供試菌，將皿倒置，在蓋內(nèi)放上藥劑，用2%洋菜液或玻璃紙密封，調(diào)查適溫下的病菌生長(zhǎng)狀況。 .47二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法l1 噴布用殺菌劑效

19、力測(cè)定l1.1 鮮葉孢子萌發(fā)試驗(yàn)法l在（梨等的）葉表面撒布藥劑，噴布梨黑斑病菌孢子懸浮液,葉片放在保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25-28保持20小時(shí)后，用龍膽紫或亞甲基藍(lán)（0.1%水溶液）將芽管染色,將葉片風(fēng)干,用涂有甘油透明膠的蓋玻片輕輕壓在葉面上,等明膠凝固后,剝?nèi)∩w玻片,鏡檢。.48l梨黑斑病二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.49l1.1 鮮葉孢子萌發(fā)試驗(yàn)法l蘋果葉（蘋果灰霉病菌(Botrytis cinerea )孢子懸浮液）也可用此法。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.50l1.2 葉片接種試驗(yàn)法l在附著藥劑的葉片上接種病原菌，一定時(shí)間后

20、觀察發(fā)病情況，以判斷藥劑效果。此法可用于甘薯黑星病，白菜軟腐病、麥類葉白粉病等。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.51以蠶豆法（高坂氏法）為例，測(cè)定步驟如下：a）用適當(dāng)方法在蠶豆成葉（有一對(duì)小葉的復(fù)葉）的兩面撒布藥劑或?qū)⑿Q豆葉在藥液中迅速浸沾一下，使葉片充分附著劑，在室內(nèi)干燥后，置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)。b）將在馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基平面上培養(yǎng)（28）3d的水稻紋枯病菌（Hypochuns sasakii）用打孔器，將帶菌的培養(yǎng)基打成直徑為5mm的小塊，放在藥劑處理過的葉片中部，并蓋上蓋玻片（7mm7mm）進(jìn)行接種。c）接種后把葉片放到恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（30）約20h后調(diào)查菌絲生長(zhǎng)

21、長(zhǎng)度，測(cè)定對(duì)菌絲的抑制作用。同時(shí)在接種3d后，當(dāng)對(duì)照組的發(fā)病面積擴(kuò)展到全葉面時(shí)，觀察藥劑處理后的發(fā)病程度，判斷藥劑的防治效果。.52以蠶豆法（高坂氏法）為例，測(cè)定步驟如下：d）在未進(jìn)行藥劑處理前接種病菌，當(dāng)發(fā)病面積到全葉面積的1/101/5時(shí)（接種后24h左右）取出病葉，進(jìn)行藥劑處理，藥劑干后，置培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行上述保溫培養(yǎng)，12d 內(nèi)觀察對(duì)病勢(shì)進(jìn)展的抑制作用。e）測(cè)定殘效時(shí)，在蠶豆的青苗上（也可剪取室內(nèi)水培的幼苗枝葉）灑布藥劑，在預(yù)定的施藥若干天后，采集附有藥劑的葉片，同上進(jìn)行接種試驗(yàn)。f）在對(duì)照組病斑擴(kuò)大到全葉面時(shí)進(jìn)行藥效調(diào)查。出現(xiàn)的病斑（合并后的病斑）大?。娣e），以發(fā)病面積對(duì)全葉面積的比

22、率來表示。進(jìn)行本試驗(yàn)的蠶豆盡量一致（葉片所在部位的大?。粋€(gè)試驗(yàn)處理的供試葉數(shù)至少要10枚以上。.53l1.3 幼苗接種試驗(yàn)法l一般認(rèn)為此方法是最可信賴的方法，稻瘟病、稻胡麻葉斑病、稻紋枯病、甘藍(lán)黑斑病等可用此法。l稻胡麻葉斑病二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.54例如甘藍(lán)黑斑病的接種試驗(yàn)，是把小油菜、白菜栽培在盆中，當(dāng)長(zhǎng)到35片真葉時(shí)，將馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基上培養(yǎng)（2528）一周的黑斑病菌孢子懸浮液（可用滅菌水制備，如果用馬鈴薯浸煮液或Hepkins培養(yǎng)母液制備孢子懸殊浮液，則發(fā)病率可提高），用玻璃噴霧器噴出接種，接種前后進(jìn)行藥劑處理。把噴藥、接種后的植物放入接種箱

23、或適當(dāng)?shù)谋仄髦?，?528下保持24h，取出放到室內(nèi)有陽(yáng)光處或溫室內(nèi)，保持25左右的室溫。當(dāng)看到有病斑生時(shí)，調(diào)查病斑數(shù)目。若病斑過多或造成葉片枯萎時(shí)，應(yīng)確定適當(dāng)?shù)谋缓?biāo)準(zhǔn)，以判定藥效。.55l2 種子殺菌劑效力測(cè)定l通常采用將病原菌附著在種籽的試驗(yàn)法。人工制備帶菌種籽常用的病原菌有：棉花炭疽病菌，稻麥赤霉病菌等。l種子殺菌劑的作用是抑制附著或潛伏在種苗上病原菌的活動(dòng)，以防止田間發(fā)病。它不能損害在土壤中的種子發(fā)芽，但能抑制寄生在幼苗而引起發(fā)病的有害病菌，以便使幼苗生長(zhǎng)良好的。 二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.56例如，用棉花炭疽病菌對(duì)棉花籽接種進(jìn)行藥劑效力測(cè)定時(shí)，

24、先把棉籽用溫湯浸種，以除去棉籽上的雜菌。晾干后拌以一定量的棉花炭疽病孢子懸浮液，再?zèng)龅狡叱筛?，進(jìn)行藥劑處理；然后將藥劑處理過的棉籽置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基平面上，一定時(shí)間后觀察種籽發(fā)病情況和發(fā)芽率，比較效果。.57l3 土壤殺菌劑效力測(cè)定l供試土壤不能僅限于1種，至少應(yīng)選2-3種土壤。l有直接法和盆栽試驗(yàn)法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.58l3 土壤殺菌劑效力測(cè)定l直接法：在玻璃容器內(nèi)裝入病原菌和土壤，進(jìn)行藥劑處理，直接判斷殺菌效果。l土壤過篩、滅菌、接種病原菌、注入藥液、培養(yǎng)、用水將土壤沖掉，取出菌絲、菌核、在培養(yǎng)基上培養(yǎng)看能否發(fā)育。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二

25、、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.59Zentmyer方法：將風(fēng)干土用8目篩篩過，裝入高壓滅菌的玻璃管內(nèi)（直徑2cm，長(zhǎng)8.5cm），裝土厚度為2.5cm。其上放入一定量培養(yǎng)好的供試菌絲或菌核，然后再裝入2.5cm厚的滅菌土，注入5ml供試藥液，在適溫下培養(yǎng)24h后，將玻璃管內(nèi)的土壤倒在金屬網(wǎng)上，用自來水將土壤沖掉，取出菌絲、菌核、置清潔的濾紙上，除去水分，接種在酸性真菌培養(yǎng)基上（即加有0.05%檸檬酸的馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基），在適溫下培養(yǎng)，觀察能否發(fā)育，以判定藥效。也可采用下述方法：菌種用秧苗枯萎病菌類（Rhizoctonia SP,Pythium SP,Fu Sarium Oxysporum）、油

26、菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等。在普通試管內(nèi)（直徑1.5cm）加入洋菜培養(yǎng)基5ml，培養(yǎng)菌核病（高層培養(yǎng)），當(dāng)菌絲生長(zhǎng)到布滿全培養(yǎng)基時(shí)，將滅菌土和定量藥劑混合（含水量為30%左右）每支試管內(nèi)輕輕裝入20g混合藥的土壤，保持在28下，然后測(cè)定管壁上菌絲的伸長(zhǎng)度。 .60荻原氏法：荻原氏（1960）報(bào)道培養(yǎng)皿的試驗(yàn)方法。這是揮發(fā)性小的藥劑對(duì)土壤表層病菌（秧苗枯萎病菌、菌核病菌）毒力測(cè)定的有用方法。在直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入風(fēng)干土20g，使其均勻平整，在土壤表面噴布一定濃度的藥液1.7ml。若用粉劑，可取一定量的藥粉混入土中，或?qū)⒓啿集B成雙層，把藥粉包好，均勻地撒

27、在土表。在土表中央放一蓋玻片，上面放洋菜培養(yǎng)基塊，并接種菌核病菌。保存在28的保濕器中，一定時(shí)間后測(cè)定菌絲伸向土壤表面的長(zhǎng)度。用蒸氣滅菌供試土壤。也可用濾紙片代替蓋玻片，用秧苗立枯病菌(Rhizoctonia SP)代替菌核病菌。如果在培養(yǎng)皿的整個(gè)平面播種小油菜類種籽，可以明確的判定藥劑的藥效和藥害。.61l3 土壤殺菌劑效力測(cè)定l盆栽法：用致病性強(qiáng)的秧苗枯萎病菌進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，一般可得到與田間藥效一致的結(jié)果。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.62將秧苗枯萎病菌在麥麩培養(yǎng)基上培養(yǎng)（28）10d左右取出，盡量在無(wú)菌條件下涼干（達(dá)到能過篩的程度）將其松散成10篩目大小一致

28、的顆粒。取2g加入蒸汽消毒的（100，30min）1L土樣中，混合均勻，然后取混合好的帶菌土100ml裝入直徑為78cm普通花盆的孔洞用濾紙或吸濕紙堵住，而不用碎瓦片。然后根據(jù)藥劑性能用相應(yīng)的方法（混入，溶于水全面灌注或具有揮發(fā)性藥劑，注加于中心部位）進(jìn)行處理。立即或過一定時(shí)間后，播種綠豆，瓜類種籽510粒，放在2030的室內(nèi)、溫室或露天，在土表尚未太干時(shí)灌水，并觀察發(fā)芽，幼苗生長(zhǎng)狀況，通常經(jīng)過7d14d，當(dāng)有侵染力的病菌生存的情況下，幼苗生長(zhǎng)不良，即可判斷有無(wú)效果。 .63以菌核病菌為供試菌種時(shí)，將滅菌土放入盆缽后，再把培養(yǎng)好的菌核均勻地放到土表（用直徑7cm的盆，每盆放1020粒），然后用

29、滅菌土把菌核完全復(fù)蓋好，再進(jìn)行藥劑處理。菌核應(yīng)采用在馬鈴薯洋菜或稻草培養(yǎng)基上，25左右培養(yǎng)23周的、成熟度一致的菌核。如果將菌核在甜菜培養(yǎng)基上（即在甜菜渣培養(yǎng)基中加等量水進(jìn)行高壓滅菌）進(jìn)行培養(yǎng)，可得到非常大的菌核。一次進(jìn)行大量試驗(yàn)時(shí)，盆內(nèi)可多半裝不滅菌的土，僅在上部裝2cm 厚的滅菌土即可。試驗(yàn)用的盆缽不限于素?zé)ㄅ?，也可用上了釉的花盆或培養(yǎng)皿、搪瓷盆等容器。.64l4 果實(shí)防腐效力測(cè)定l先用砂紙輕擦果實(shí)，使果皮擦傷，也可用刀尖或昆蟲針刺傷。將果實(shí)放在藥液中浸漬一定時(shí)間或噴上藥液，晾干后，進(jìn)行接種，然后將接種后的果實(shí)放入玻璃保濕器，在25下保持5天，觀察發(fā)病情況。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法

30、二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.65l5 內(nèi)吸殺菌劑效力測(cè)定l英國(guó)等常用室溫下沙培西紅柿苗法：當(dāng)苗高15cm左右時(shí)，將藥液灌于幼苗根部或莖部注射或用羊毛脂混合涂莖，處理57天后接種早疫病菌孢子，在室溫下讓其發(fā)病，觀察病斑發(fā)生程度。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.66l5 內(nèi)吸殺菌劑效力測(cè)定l還可將普通盆栽的蠶豆芽拔出(不使根損傷),于藥液中浸一定時(shí)間后,再放置原位繼續(xù)栽培,待完全成活后,接種赤霉病菌,并判斷其效果。二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法二、不同類型殺菌劑效力測(cè)定方法.67三、抗病毒劑測(cè)定方法三、抗病毒劑測(cè)定方法l1 病毒磨擦接種法l切取少量植物病癥嚴(yán)重的新

31、組織，放入研缽內(nèi)，加入與組織鮮相等或5倍量的1/15mol磷酸緩沖液，充分磨碎（先把組織冰凍，可更易磨碎）。把棉球在制備的病組織汁液中浸蘸一下，用鑷子夾住棉球在接種植物的葉面沿其支脈方向輕輕擦1-2次。為了提高接種效率，最好在含病毒的汁液中加少量金剛砂（400-600目）再接種。.68三、抗病毒劑測(cè)定方法三、抗病毒劑測(cè)定方法l2 藥劑施用方法l2.1 浸漬法l2.2 組織培養(yǎng)法l2.3 涂莖法l2.4 撒布法l2.5 土壤使用法.69四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l殺菌劑的開發(fā)：l室內(nèi)測(cè)定l溫室植株測(cè)定l田間試驗(yàn).70四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l1、供試

32、植物l我國(guó)常用植物：小麥、水稻、黃瓜、棉花、番茄、馬鈴薯。l植物不同發(fā)育時(shí)期感病性不一樣，黃瓜霜霉病成株易感病。l兼性寄生菌易侵害弱的寄主，專性寄生菌要求正常植物代謝作為其營(yíng)養(yǎng)，如小麥銹病接種時(shí)，健壯的植株才易接種成功。.71四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l2、供試菌種l易培養(yǎng)，易產(chǎn)生大量孢子，應(yīng)是我國(guó)主要病害的病原菌。l小麥銹病菌、黃瓜霜霉病菌目前不能在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可植株培養(yǎng)。霜霉病菌需新鮮孢子接種才能成功。.72四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l接種時(shí)應(yīng)注意l（1）病原菌的培養(yǎng)條件及其退化l不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的病菌，其致病力往往不同。l有的菌種連續(xù)培養(yǎng)，

33、致病力減弱，須經(jīng)過植物接種及重新分離的方法使其恢復(fù)致病力。.73四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l接種時(shí)應(yīng)注意l（2）病原菌的菌系及生理小種l來源于不同地區(qū)或不同寄主，其致病力往往有很大差異。.74四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l接種時(shí)應(yīng)注意l（3）接種量l一般病害需要一定數(shù)量的孢子接種才能發(fā)病。一般孢子濃度要在低倍鏡下每視野20-30個(gè)孢子。.75四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l3、接種時(shí)環(huán)境因子的控制l接種后需保持一定時(shí)間的溫度，才能滿足病菌萌發(fā)和侵入寄主的要求。l馬鈴薯晚疫病菌在低溫時(shí)才能產(chǎn)生大量孢子，但孢子的侵入寄主后又需要較高的溫度

34、。.76四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l4、接種方法l對(duì)氣流和雨水傳播的病害，可采用噴灑法、噴粉法及涂抹法接種。如病菌主要是氣孔侵入，接種時(shí)主要是葉背面，對(duì)由傷口侵入的病害，可先將植物表面用細(xì)砂損傷。.77四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法四、殺菌劑溫室植株測(cè)定法l4、接種方法l銹病和白粉病菌的接種，可直接用孢子粉（用滑石粉稀釋）噴撒于植物葉片上。.78Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl盆栽法測(cè)定防黃瓜霜病試驗(yàn)l1、試材準(zhǔn)備l選用感病黃瓜品種盆栽，幼苗長(zhǎng)至4到6片真葉期備用。.79Po

35、tted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、孢子囊懸浮液的準(zhǔn)備l選擇病源葉片，用4蒸餾水洗下葉片背面霜霉病菌孢子囊，配成懸浮液（濃度為每毫105到107個(gè)孢子囊),4 下存放備用。.80Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、藥劑的配制l水溶性藥劑直接用水溶解，其它藥劑選用合適的有機(jī)溶劑（甲醇、丙酮、二甲基亞砜等）溶解，再用0.1%的吐溫80水溶液稀釋，設(shè)置57個(gè)濃度，有機(jī)溶劑最終含量不超過1%.81Po

36、tted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl3、藥劑處理l將藥液均勻噴施于葉片兩面至全部潤(rùn)濕，待藥液自然風(fēng)干后備用。試驗(yàn)設(shè)不含藥劑的處理作空白對(duì)照。.82Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl4、接種與培養(yǎng)l將新鮮孢子囊懸浮液噴霧接種于葉片背面，每處理不少于5盆，每盆2株，保護(hù)性試驗(yàn)在藥劑處理后24小時(shí)接種，治療性試驗(yàn)在藥劑處理前24小時(shí)接種。接種后培養(yǎng)，光照/黑暗各12小時(shí)，溫度為17到22，RH90%以上。

37、.83Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl5、調(diào)查l根據(jù)空白對(duì)照發(fā)病情況，對(duì)接種葉片進(jìn)行分級(jí)調(diào)查：l0級(jí)：無(wú)病l1級(jí)：病斑面積5%以下；l3級(jí)：610%l5級(jí)：1125%l7級(jí)：2650， 9級(jí)：50%以上.84Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl6、數(shù)據(jù)處理l根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算防治效果，求出毒力回歸線，EC50、EC90及95%置信限。.85五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定1 抗藥性測(cè)定的要點(diǎn)1）測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)：

38、測(cè)定時(shí)并不是觀測(cè)其絕對(duì)數(shù)值，而是將測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)菌株是指歷來存在于自然界中的普通菌株或菌株群。2）檢測(cè)菌的采集和處理： 單孢分離培養(yǎng)或單細(xì)胞分離培養(yǎng)。3）藥劑的選擇和處理：.86五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定4）試驗(yàn)方法的選擇： 將從田間采集的病原菌進(jìn)行離體測(cè)定。 一種方法是使供試菌產(chǎn)生一定反應(yīng)的藥劑濃度（LD50或MIC）；另一種是比較在一定藥劑濃度下與不添加藥劑情況下供試菌的生長(zhǎng)狀況，推測(cè)藥劑對(duì)菌生長(zhǎng)的抑制程度。.872 抗藥性測(cè)定方法：1）水稻稻瘟病菌（pyricularia oryzae) 對(duì)春雷霉素的抗藥性測(cè)定采用MIC法；對(duì)有機(jī)磷的抗藥性測(cè)定采用MIC法，孢子萌發(fā)法或菌絲生

39、長(zhǎng)法。五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定.88稻瘟病菌的分離和春雷霉素、有機(jī)磷抗性菌的測(cè)定 從田向采集的病稻樣本放在聚氯乙烯或聚乙烯袋內(nèi)用橡皮圈封住。分離之前保存在5冰箱內(nèi)(可保存一年左右)。分離時(shí)首先切取病斑及其外圍部并浸于80乙醇中，然后再浸于0.1升汞水中，最后用無(wú)菌水洗凈，進(jìn)行表面消毒。消毒液也可用20倍安替佛民(antiformine)液代替。培養(yǎng)皿中注入一薄層瓊脂平板，平板表面放置病組織塊并使其充分附著瓊脂表面。在20-27下用近紫外光照射，2-7天后病斑部即產(chǎn)生孢子，孢子可在立體顯微鏡下用眼科手術(shù)刀進(jìn)行單孢分離并接種，在26-27下培養(yǎng)，大約十天后菌絲擴(kuò)展，然后用打孔器打成菌塊，菌絲朝上移置

40、到含藥PSA培養(yǎng)基和不含藥PSA培養(yǎng)基表面，在26-27下培養(yǎng)4-7天，通過測(cè)量菌落直徑求藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率。.89稻瘟病菌的分離和春雷霉素、有機(jī)磷抗性菌的測(cè)定 春雷霉素抗性程度大，采用l0-l00ppm之間任何濃度均可進(jìn)行抗藥性測(cè)定(10 ppm對(duì)敏感菌抑制率約60，對(duì)抗性菌不抑制。100ppm對(duì)敏感菌抑制率90，抗性菌約20)。配制春雷霉素要用檸檬酸緩沖掖將pH值調(diào)到5左右。 有機(jī)磷殺菌劑的田間抗性菌抗性程度多較弱，與普通菌區(qū)別本大。對(duì)異稻瘟凈來說，一般可采用l00mM濃度進(jìn)行測(cè)定(在此濃度下敏感菌抑制率約90，抗性菌約40或以下)。.90五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：2）

41、蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本病菌對(duì)多果定、苯來特、甲基托布津已產(chǎn)生抗藥性。在進(jìn)行抗藥性測(cè)定存在的問題是該病原菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的很慢，將本菌從寄主病斑部進(jìn)行單孢分離直至作為供試菌進(jìn)行抗藥性測(cè)定需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，因此多采用從病斑部直接采集孢了進(jìn)行測(cè)定的方法。.91五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：2） 蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本菌對(duì)多果定的抗藥性采用子囊孢子萌發(fā)的方法進(jìn)行測(cè)定 。對(duì)苯來特和甲基托布津的抗性，通常采用孢子蔭芽率、萌發(fā)管長(zhǎng)度及菌絲生長(zhǎng)的方法進(jìn)行測(cè)定。這兩種藥劑屬細(xì)胞分裂抑制劑，抑制菌絲生長(zhǎng)比抑制孢子萌發(fā)的能力強(qiáng)，因此

42、一般認(rèn)為采用測(cè)量萌發(fā)管或菌絲生長(zhǎng)的方法比較適合。.92五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：3） 梨黑星病菌(Venturia nashicola) 已有報(bào)道指出，采用菌絲生長(zhǎng)的方法證明本菌已對(duì)苯來特和甲基托布津產(chǎn)生了抗性。與蘋果黑星病菌同樣，本菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)很慢，分離培養(yǎng)測(cè)定所需時(shí)間長(zhǎng)。一般認(rèn)為，進(jìn)行抗藥性測(cè)定不宜采用孢子萌發(fā)的方法，梅本等建立了以異常萌發(fā)作指標(biāo)的萌發(fā)管隔膜法。.93萌發(fā)管隔膜法測(cè)定梨黑星病菌對(duì)苯并咪唑類藥劑抗藥性試驗(yàn) 在PDA培養(yǎng)基中加入供試藥劑，然后高壓蒸氣滅菌。從梨的葉采集分生孢子放在含藥瓊脂培養(yǎng)基表面。為防止混入細(xì)菌的繁殖，可放在稍低溫度下(15)使其發(fā)芽。大約

43、經(jīng)48小時(shí)即產(chǎn)生萌發(fā)管。但為可靠起見，最好在72小時(shí)后進(jìn)行調(diào)查，觀測(cè)萌發(fā)管有無(wú)隔膜。一般認(rèn)為苯來特、甲基托布津均采用0.2ppm濃度為宜。 也可采用子囊孢子進(jìn)行測(cè)定。此時(shí)，可將形成子囊殼葉片用葉穿孔器切取病組織片，放在水中浸3-5分鐘，然后貼在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面，使子囊孢子落在培養(yǎng)皿內(nèi)含藥PDA培養(yǎng)基表面。其他過程與上述相同。.94五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：4）梨黑斑病菌(Alternara kikuchiana) 本菌對(duì)多氧霉素的抗藥性已成為問題。多氧霉素對(duì)孢子萌發(fā)抑制并不顯著，但具有強(qiáng)烈的使萌發(fā)管膨潤(rùn)的作用。因此，可通過異常萌發(fā)或抑制菌絲生長(zhǎng)的方法進(jìn)行抗藥性測(cè)定。.95五 殺菌

44、劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和綠霉病菌(Penicillium dijitatum) 本菌對(duì)苯來特、甲基托布津及涕必靈產(chǎn)生抗藥性，并觀察到前兩種藥劑之間具有交叉抗藥性。與涕必靈之間有的有交互抗藥性，有的則不那么明顯。抑霉唑(R-23979)盡管與這三種藥劑屬同一系列藥劑，但也不具有交叉抗藥性。 本菌容易形成孢子，菌絲生長(zhǎng)也快，所以很容易在含藥培養(yǎng)基上接種孢子或菌絲塊。通過測(cè)定菌落的生長(zhǎng)進(jìn)行抗藥性測(cè)定。此外，采用果實(shí)測(cè)定在寄主上效果的方法也很容易進(jìn)行。.96五 殺菌劑的抗藥性測(cè)定2 抗藥性測(cè)定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和綠霉病菌(Penicillium dijitatum) 已發(fā)現(xiàn)苯來特甲基托布津、涕必靈藥劑對(duì)本菌同屬的梨青霉菌(Pe