生物的粗提取與鑒定

1、DNADNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 1.1.血細(xì)胞在蒸餾水中會(huì)滲透吸水過(guò)度而導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)血細(xì)胞在蒸餾水中會(huì)滲透吸水過(guò)度而導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。的溶液。2.2.DNA在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度在氯化鈉溶液中的溶解度，是隨著氯化鈉的濃度的變化而改變的。的變化而改變的。DNA在在物質(zhì)的量濃度為物質(zhì)的量濃度為0.14 molL的氯化鈉溶液中的溶解度最低，的氯化鈉溶液中的溶解度最低，利用這一原理，可以使利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中的溶解在氯化鈉溶液中的DNA析出析出。 3.

2、3.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶某些物質(zhì)則可以溶于酒精。于酒精。利用這一原理，可以進(jìn)一步利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少提取出含雜質(zhì)較少的的DNA。 4.4.DNA遇二苯胺（沸水?。?huì)變成藍(lán)色，因此，遇二苯胺（沸水浴）會(huì)變成藍(lán)色，因此，二苯胺二苯胺可以作為鑒定可以作為鑒定DNA的試劑的試劑。 二、方法與過(guò)程二、方法與過(guò)程 1.1.制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）制雞血細(xì)胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）0.1g/mL檸檬酸鈉檸檬酸鈉100mL活雞鮮血活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒燒杯中，玻棒攪拌攪拌，離心、分離或靜置沉淀。離心

3、、分離或靜置沉淀。2.提取提取DNA。取血細(xì)胞取血細(xì)胞5-10mL20mL蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向蒸餾水，用玻棒沿一個(gè)方向快速攪拌快速攪拌。紗布紗布過(guò)濾過(guò)濾：濾液中含：濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。原理：血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核摸吸水脹破，玻璃棒原理：血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核摸吸水脹破，玻璃棒快速快速攪拌攪拌，機(jī)械加速血細(xì)胞破裂。，機(jī)械加速血細(xì)胞破裂。.提取提取血血細(xì)胞核物質(zhì)：細(xì)胞核物質(zhì)：.溶解核內(nèi)的溶解核內(nèi)的DNA： 濾液濾液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一個(gè)方向，玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌輕緩攪拌。.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.濾取含濾取含DN

4、A的粘稠物：的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解： 在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個(gè)方向輕輕輕攪拌輕攪拌，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停止加，出現(xiàn)絲狀物；當(dāng)絲狀物不在增加時(shí)，停止加水（此時(shí)水（此時(shí)NaCl溶液的濃度相當(dāng)于溶液的濃度相當(dāng)于0.14mol/L）。）。 用多層紗布用多層紗布過(guò)濾過(guò)濾，含，含DNA的粘稠物留在紗布上。的粘稠物留在紗布上。 20mL2mol/L的的NaCl溶液溶液步驟含步驟含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL燒杯中燒杯中輕緩攪拌輕緩攪拌3min，使盡可能多的，使盡可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液溶液。.過(guò)濾

5、含有過(guò)濾含有DNA的的NaCl溶液：溶液： 用放有兩層紗布的漏斗用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾過(guò)濾步驟所得的溶液，步驟所得的溶液，濾液中含有濾液中含有DNA。.提取含有雜質(zhì)較少的提取含有雜質(zhì)較少的DNA： 步驟所得的濾液體積分?jǐn)?shù)為步驟所得的濾液體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻酒精的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個(gè)方向，用玻棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌輕緩攪拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。吸取上面的水分。3.DNA的鑒定：的鑒定： 加入二苯胺試劑加入二苯胺試劑4mL，用玻棒，用玻棒攪拌攪拌使使DNA溶解，溶解，沸水

6、浴沸水浴5min，觀(guān)察溶液是否出現(xiàn)淺藍(lán)色。，觀(guān)察溶液是否出現(xiàn)淺藍(lán)色。1.共有共有“三次過(guò)濾，兩次析出，七次攪拌三次過(guò)濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入加入“兩次蒸餾水，兩次蒸餾水，三次三次NaCl溶液，一次酒精，一次酒精”三、實(shí)驗(yàn)小結(jié)三、實(shí)驗(yàn)小結(jié)四、實(shí)驗(yàn)原理拓展介紹。四、實(shí)驗(yàn)原理拓展介紹。1.DNA的釋放。的釋放。 DNA主要在雞血細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，正常情況下不會(huì)主要在雞血細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，正常情況下不會(huì)釋放出來(lái)，蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞是一種低滲液，水分可釋放出來(lái)，蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞是一種低滲液，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞，使之脹破，同時(shí)加上玻璃棒快速攪以大量進(jìn)入血細(xì)胞，使之脹破，同時(shí)加上玻璃棒快速攪拌的機(jī)

7、械作用，加速血細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜的破裂。但拌的機(jī)械作用，加速血細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜的破裂。但釋放出來(lái)的大量釋放出來(lái)的大量DNA與與RNA、蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，即釋、蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，即釋放的不是純凈的放的不是純凈的DNA，常稱(chēng)為，常稱(chēng)為DNA核蛋白核蛋白。2.DNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。 在高濃度（在高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液中，核蛋白易溶）的氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，析出解，析出DNA并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中3.DNA的析出與獲取。的析出與獲取。 因?yàn)橐驗(yàn)镈NA在低濃度（在低濃度（ 0.14mol/L ）的氯化鈉溶液中）的氯化鈉溶液中溶解度小，而蛋

8、白質(zhì)的在其中的溶解度大溶解度小，而蛋白質(zhì)的在其中的溶解度大。所以在向含。所以在向含DNA的高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化的高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，從而使鈉溶液，從而使DNA溶解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。溶解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。4.DNA的再溶解。的再溶解。用高濃度（用高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液再溶解）的氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。粘稠物。5.DNA的沉淀和濃縮。的沉淀和濃縮。 對(duì)于除去了蛋白質(zhì)的對(duì)于除去了蛋白質(zhì)的DNADNA的氯化鈉溶液，必須再進(jìn)的氯化鈉溶液，必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮，常用一步沉淀和濃縮，常用酒精沉淀法酒精沉淀法。即往。即往含

9、有含有NaNa的的DNADNA溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為溶液，加入體積分?jǐn)?shù)為95%95%的冷卻酒精，混勻后可的冷卻酒精，混勻后可以使以使DNADNA沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少的沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少的DNADNA絲狀物絲狀物，懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后的箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后的DNADNA絲狀物可以用玻棒絲狀物可以用玻棒（玻棒有吸附（玻棒有吸附DNADNA的作用）緩緩旋轉(zhuǎn)的方法卷起。的作用）緩緩旋轉(zhuǎn)的方法卷起。6.DNA的鑒定。的鑒定。100DNA二苯胺二苯胺 藍(lán)色物藍(lán)色物鑒定時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中鑒定

10、時(shí)藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關(guān)。的含量多少有關(guān)。方法步驟方法步驟 加入物質(zhì)加入物質(zhì) 目的目的 1.制備雞血細(xì)胞液 檸檬酸鈉溶液 2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì) 20 m1蒸餾水 3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA 2 mo1 L 的NaCI溶液40mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸餾水 5.濾取含DNA的黏稠物 6.將DNA的黏稠物再溶解 2 molL 的NaCl溶液20 mL 7.過(guò)濾含DNA的NaCl 溶液 8.提取含有雜質(zhì)較少的 DNA 冷卻的95的酒精50 mL A:(1)向試管中加入0.015 molL 的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺試劑 9.DNA的鑒定

11、B:(1)向試管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL 二苯胺試劑 加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固加速血細(xì)胞破裂加速血細(xì)胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀釋至溶液稀釋至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地釋出最大限度地釋出 使含使含DNA的黏稠物被留在紗布上的黏稠物被留在紗布上使含使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)的濾液中的雜質(zhì)提取提取DNA A出現(xiàn)藍(lán)色出現(xiàn)藍(lán)色 B無(wú)變化無(wú)變化2.實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)中NaCl的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為2

12、molL和和0.14 molL對(duì)對(duì)DNA有何影響有何影響?1.在在DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯的粗提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是中加入蒸餾水的作用是( )。A.稀釋血液、沖洗樣品稀釋血液、沖洗樣品B.使血細(xì)胞破裂、降低使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使?jié)舛仁笵NA析出析出C.使血細(xì)胞破裂、增大使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )會(huì)染成會(huì)染成( ) ( ) A. A.磚紅色磚紅