創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織脂多糖受體CD14mRNA核因子κB的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)

1、創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織脂多糖受體CD14 mRNA、核因子-B的基因動(dòng)態(tài)表達(dá) 作者：鄭阿邁，陳玉熹，李萌芳，梁歡，盧中秋【摘要】 目的:探討創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）膿毒癥大鼠肺組織脂多糖受體CD14 mRNA、核因子-B（NF-B）基因的表達(dá)及其動(dòng)態(tài)變化。方法:SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只。第1組：正常對(duì)照組（NC組）；第26組為VV組: 予大鼠下肢皮下注射VV，造成VV膿毒癥模型，以注射VV后2、6、9、12、16 h各時(shí)間點(diǎn)分別為26組。取各組大鼠部分肺組織，用RT-PCR法測(cè)定大鼠肺組織不同時(shí)間點(diǎn)CD14 mRNA、NF-B mRNA的表達(dá)。

2、結(jié)果: NC組大鼠肺組織有少量CD14、NF-B mRNA表達(dá)，分別為0.3920.056和0.3660.179。感染VV后大鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)增加，2、6、9、12、16 h的表達(dá)量分別為0.9760.180，1.1480.218，1.0260.033，0.9880.129，0.9700.125。大鼠肺組織NF-B mRNA表達(dá)量也明顯增加，2、6、9、12、16 h的表達(dá)量分別為0.7630.215，1.1000.101，1.0680.174，1.0570.076和0.8000.205。與NC組相比，二者均明顯升高（P0.05）。結(jié)論:VV膿毒癥大鼠肺組織CD14、NF-B的基

3、因表達(dá)水平在膿毒癥中明顯升高，其與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其改變對(duì)VV膿毒癥發(fā)病過(guò)程具有一定的預(yù)警意義。 【關(guān)鍵詞】 創(chuàng)傷弧菌；膿毒癥；脂多糖受體CD14；核因子-B；基因 Abstract: Objective: To detect the Gene expression and the dynamic change of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in rats with Vibrio vulnificus (VV) sepsis. Methods: Sixty male Sprague-Dawley

4、 (SD) rats were equally divided into six groups randomly. The first group was named control group. VV groups include the second to sixth group which were injected VV to make VV sepsis model. Samples were taken from control group and the second group to the sixth group at the timepoint of 2，6，9，12，16

5、 h after injection respectively，the genes of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in ratslung were measured in the different time by the method of RT-PCR. Results: The Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the control group was a low level（0.3920.05

6、6，0.3660.179），but they increased significantly at 2 h（0.9760.180，0.7630.215），6 h（1.1480.218，1.1000.101），9 h（1.0260.033，1.0680.174），12 h（0.9880.129，1.0570.076），16 h（0.9700.125，0.8000.205）after VV being injected（P 0.05）. Conclusion: Our data suggest that the Gene expression of pulmonary lipopolysaccha

7、ride receptor CD14 and NF-B elevation are associated with the development of VV sepsis. Monitoring the change of the Gene expression of pulmonary lipopolysaccharide receptor CD14 and NF-B in the lung have the benefit of mastering the VV sepsis progress. Key words: Vibrio vulnificus；sepsis；CD14；NF-B；

8、gene 創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）是一種高致死性嗜鹽性G-弧菌，可引起嚴(yán)重的傷口感染、膿毒癥等1。CD14作為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的重要受體，與脂多糖結(jié)合蛋白（Lipopolysaccharide-Binding Protein，LBP）共同作用可明顯提高各種細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的敏感性，在炎癥反應(yīng)、膿毒癥等病理反應(yīng)中起重要作用，其在膿毒癥中的地位日益受到重視2。核轉(zhuǎn)錄因子-B (NF -B) 是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)許多細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)的基因都有調(diào)控作用3。我們通過(guò)制作大鼠VV膿毒癥模型，測(cè)定肺組織 CD14、NF-B的基因的

9、表達(dá)及其動(dòng)態(tài)變化，并探討VV膿毒癥時(shí)肺組織 CD14、NF-B的基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化和規(guī)律，為進(jìn)一步研究創(chuàng)傷弧菌膿毒癥發(fā)病機(jī)制提供資料。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠60只，體重為270300 g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證為SCXK(滬) 2003- 0003）。 1.2 細(xì)菌來(lái)源 從VV感染患者下肢血皰中抽取皰液，接種在血平板上，37 、24 h培養(yǎng)分離純化，細(xì)菌鑒定為 VV，菌株編號(hào)為812013，按常規(guī)方法制作成創(chuàng)傷弧菌懸液，濃度為9108 cfu/ml備用。 1.3 實(shí)驗(yàn)材料 Trizol試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均由Invit

10、rogen公司提供。PCR試劑盒由Fermentas公司提供。Rat CD14引物（引物序列：Forward 5-GTGCTCCTGCCCAGTGAAAGAT-3，Reverse5-GATCTGTCTGACAACCCTGAGT-3，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度: 268 bp），Rat NF-B（引物序列：Forward 5-CCAGATCAATGGCTACACGG-3，Reverse 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度: 286 bp），Rat -actin引物（引物序列：Forward 5-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3，Reverse 5-GAAGCATT

11、TGCGGTGGACGAT-3，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度: 315 bp）由上海生物工程公司合成。酶標(biāo)儀由BioRAD公司提供。梯度PCR儀由Eppendof公司提供。水平電泳儀由北京六一電泳廠(chǎng)提供。凝膠成像分析系統(tǒng)由Pharmacia公司提供。 1.4 實(shí)驗(yàn)方法 1.4.1 建立大鼠VV膿毒癥模型。SD雄性大鼠60只，購(gòu)來(lái)后飼養(yǎng)1周以上，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由進(jìn)水。隨機(jī)分為6組，每組10只。第1組：正常對(duì)照組（NC組），麻醉后處死。第26組：VV膿毒癥組（VV組），予雙下肢皮下注射VV，細(xì)菌濃度為9108 cfu/ml，劑量為1 ml/100 g，制作 VV 膿毒癥模型。大鼠膿毒癥模型診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文

12、獻(xiàn)4。VV組大鼠分別在注射創(chuàng)傷弧菌后2、6、9、12、16 h各時(shí)間點(diǎn)分別為26組，麻醉后處死。無(wú)菌取部分肺組織，用4 生理鹽水沖洗后迅速置于液氮中保存待用。 1.4.2 RT-PCR法測(cè)定大鼠肺組織 CD14、NF-B的mRNA表達(dá)。取凍存大鼠肺組織約50 mg，按Trizol說(shuō)明書(shū)，提取大鼠肺組織總RNA。用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.82.0之間。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用1.5%瓊脂糖凝進(jìn)行電泳。同時(shí)加合適的DNA ladder。采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀(guān)察電泳結(jié)果，并用Quantity One軟件進(jìn)行凝膠掃描分析。以目的基因/-a

13、ctin為該基因表達(dá)的相對(duì)值。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。 2 結(jié)果 2.1 VV膿毒癥大鼠肺組織CD14 mRNA的表達(dá) NC組大鼠肺組織有少量CD14 mRNA表達(dá)量為（0.3920.056），感染VV后其表達(dá)增加，VV組染菌后2、6、9、12、16 h肺組織的CD14 mRNA表達(dá)量分別為0.9760.180、1.1480.218、1.0260.033、0.9880.129、0.9700.125，與 NC 組相比，均明顯升高（F36.30，P0.05），其中以染菌后6 h的表達(dá)量最高，9 h后其表達(dá)量較前有所降低，但染菌16 h的表達(dá)量仍明

14、顯高于正常水平。 2.2 VV膿毒癥大鼠肺組織NF-B mRNA的表達(dá) NC組大鼠肺組織NF-B mRNA表達(dá)量低（為0.3660.179），感染VV后其表達(dá)增加，VV組染菌后2、6、9、12、16 h肺組織的NF-B mRNA表達(dá)量分別為0.7630.215、1.1000.101、1.0680.174、1.0570.076、0.8000.205，與NC組相比，均明顯升高（F28.58，P0.05），其中以染菌后6 h的表達(dá)量最高。 3 討論 VV是一種嗜鹽性G-弧菌，在熱帶、亞熱帶環(huán)境中，可廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中，可通過(guò)生食海鮮和經(jīng)過(guò)肢體破損創(chuàng)口感染人體，迅速發(fā)展為膿毒癥，死亡率高達(dá)70%

15、以上，是一種沿海地區(qū)發(fā)生的致命性疾病。膿毒癥及其引發(fā)的多器官功能障礙綜合征（MODS）是VV膿毒癥患者死亡的主要原因5。作為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）最常見(jiàn)的致病因素，膿毒癥所致的MODS往往最先導(dǎo)致ALI，在此基礎(chǔ)上惡化，累及其他臟器，以致發(fā)生MODS6。ALI的病理基礎(chǔ)是廣泛的肺泡-毛細(xì)血管膜損傷，這種損傷可原發(fā)于侵襲肺的理化或生物性因子的直接作用，但更重要的是炎性反應(yīng)引起的損傷，它往往是全身性炎癥反應(yīng)的肺部表現(xiàn)。 近年來(lái)的研究顯示，LPS先與LBP結(jié)合，再傳遞給CD14分子，形成LPS/LBP/CD14復(fù)合物，該復(fù)合物與TLR4-MD2相互作用，激活胞內(nèi)的幾種信

16、號(hào)通路，包括NF-B通路和三種絲裂原活化蛋白激酶通路，可導(dǎo)致NF-B和AP-1(c-fos/c-jun)活化，誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子活化表達(dá)，從而造成組織損害3。 CD14的主要生物學(xué)活性是作為L(zhǎng)PS受體，識(shí)別、結(jié)合LPS或LPS/LBP復(fù)合物，介導(dǎo)LPS所致的細(xì)胞反應(yīng)。它分為膜性CD14(mCD14)和可溶性CD14(sCD14)兩種。mCD14是一種55 kD的糖蛋白，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨固于細(xì)胞膜，mCD14主要分布在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面，對(duì)LPS有高親和力；sCD14無(wú)GPI結(jié)構(gòu)，存在于血清、尿液和培養(yǎng)mCD14陽(yáng)性細(xì)胞的上清液中, 由mCD14脫落或細(xì)胞分

17、泌產(chǎn)生。sCD14是LPS 作用于CD14陰性細(xì)胞的重要途徑7。 LPS還可通過(guò)mCD14誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表面黏附受體的表達(dá)以及單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用8。李紅云等9的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠燙傷合并金葡菌感染后，各重要臟器中CD14 mRNA表達(dá)均會(huì)明顯增加，其中以肺組織的CD14 mRNA 表達(dá)升高最為顯著，這可能與肺組織局部有大量炎性細(xì)胞聚集且CD14陽(yáng)性細(xì)胞量較多有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中NC組大鼠肺組織僅有少量CD14 mRNA表達(dá)，注射VV后其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均增加，與NC組相比，均明顯升高（P0.05），其中以染菌后6 h的表達(dá)量最高，9 h后其表達(dá)量較前有所降低，但染菌16 h的表達(dá)量仍明顯高于正

18、常水平。本結(jié)果表明VV感染可誘導(dǎo)肺組織CD14 mRNA表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步刺激機(jī)體產(chǎn)生各種炎性遞質(zhì)，介導(dǎo)機(jī)體組織器官損傷。 NF-B廣泛存在于靜止細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，由 Sen和Baltimoer于1986年發(fā)現(xiàn)。其蛋白二聚體與特異性抑制蛋白IB形成三聚體，以非活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到如細(xì)菌、細(xì)胞因子等刺激后IB可磷酸化而失活，進(jìn)而使NF-B活化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄10。它是多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交匯點(diǎn)，廣泛參與了機(jī)體免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等生理及病理過(guò)程，可高效誘導(dǎo)多種前炎性細(xì)胞因子（包括TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等）、白細(xì)胞黏附分子、單核細(xì)胞趨化因子等的基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)

19、參與炎癥級(jí)聯(lián)及放大效應(yīng)的多種酶的基因轉(zhuǎn)錄也具有重要的調(diào)控作用3，11。目前認(rèn)為膿毒癥發(fā)生的分子機(jī)制在于細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)的過(guò)度釋放，LPS是主要誘導(dǎo)因素，NF-B經(jīng) LPS-CD14-TLR傳導(dǎo)通路的激活，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控眾多炎性遞質(zhì)的基因表達(dá)，尤其是 TNF-和IL-1等原發(fā)性遞質(zhì)的增加，進(jìn)一步作用于巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量的繼發(fā)性細(xì)胞因子和遞質(zhì)，這些炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又可以進(jìn)一步激活NF-B，從而形成正反饋的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)，引起組織和細(xì)胞的損害3，12。Browder等13在鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）致敗血癥研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)CLP刺激引起多細(xì)菌性敗血癥后NF-B和NF-IL

20、-6核結(jié)合活性在肺臟出現(xiàn)迅速而明顯的增加，敗血癥鼠的肺組織中轉(zhuǎn)錄因子激活過(guò)程與病死率呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常大鼠肺組織NF-B mRNA表達(dá)量低，感染VV后其表達(dá)量較NC組明顯升高（P0.05），其中以染菌后6 h的表達(dá)量最高。說(shuō)明NF-B在VV膿毒癥大鼠肺組織中明顯被活化，可能與膿毒癥的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。 綜上所述，VV膿毒癥時(shí)大鼠肺組織CD14、NF-B mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，它們的變化趨勢(shì)相近，提示組織CD14 mRNA的表達(dá)上調(diào)能進(jìn)一步迅速激活細(xì)胞內(nèi)NF-B。它們與VV膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)它們的變化對(duì)VV膿毒癥的發(fā)病過(guò)程具有一定預(yù)警意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 盧中

21、秋,盧才教,陳雷,等.下肢創(chuàng)傷弧菌感染所致膿毒血癥的臨床治療J.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,33(3):327.2 Gegner JA,Ulevitch RJ,Tobias PS. Lipopolysaccharide (LPS)signal transduction and clearanceJ. J Biol Chem,1995,270(10):5320-5325.3 盧中秋,梁歡,李萌芳,等.創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子-B活性表達(dá)及抗菌藥物的影響J.中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2007,27(12):1090-1093.4 盛志勇,胡森.多器官功能障礙綜合征M.北京:科學(xué)出版社, 1999:18

22、5-188.5 盧中秋,李秉煦,黃唯佳,等.創(chuàng)傷弧菌敗血癥的臨床和流行病學(xué)特點(diǎn)J. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,37(5):378.6 Bi X,Flach CR,Perez-Gil J,et al.Secondary structure and lipidinteractions of the N-terminal segment of pulmonary sur-factant SP-C in Langmuir films: IR reflection-absorptionspectroscopy and surface pressure studiesJ. Biochemistry,2002,41(26):8385-8395.7 盧中秋,梁歡,李