A型肉毒神經(jīng)毒素理化及生物學(xué)特性研究.docx

1、.論著A型肉毒神經(jīng)毒素理化及生物學(xué)特性研究李小娟，張若暉，苗承輝，蘇娟，何星，崔保峰，張雪平蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司毒素制劑室甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州,730046摘要：目的探究A型肉毒神經(jīng)毒素的理化及生物學(xué)特性，為A型肉毒神經(jīng)毒素制品的研制提供依據(jù)。方法采用SDS-PAGE.HPLC測定A型肉毒神經(jīng)毒素的純度;采用毛細(xì)管凝膠電泳分析其在非還原條件及還原條件下各組分的相對分子質(zhì)量;采用等電點聚焦電泳測定其等電點;對其N-末端氨基酸序列進行測序，并將測序結(jié)果與NCBIblast數(shù)據(jù)庫中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列作比對，確證其各組分的成分;對A型肉毒毒素岌合物及A型肉毒神

2、經(jīng)毒素進行曰服毒性分析，并對3批A型肉毒神經(jīng)毒素原液和其半成品進行生物學(xué)穩(wěn)定性研究。結(jié)果A型肉毒神經(jīng)毒素純度99.00%;非還原條件下其相對分子質(zhì)量約為152000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,為完整的A型肉毒神經(jīng)毒素;還原條件下，由相對分子質(zhì)最約為101000.N-末端氨基酸序列為ALNDLQINVN的重鏈和相對分子質(zhì)量約為101000、N-末端基基酸序列為PEVNKQFNYK的輕鏈組成;等電點為4.91；口服A型肉毒神經(jīng)毒素的小鼠LDW為1.50X107U/kg,是其復(fù)合物的7.9倍;3批A型肉毒神經(jīng)毒素原液在28Y放置28d生物學(xué)活性無下降,平均比活性為2.13X10U/mg

3、,是其復(fù)合物的7.1倍;3批半成品在1826T放置28d生物學(xué)活性無下降。結(jié)論A型肉毒神經(jīng)毒素純度較高,非還原條件下為單鏈，還原條件下裂解為輕鏈和重鏈，其原液及其半成品的生物學(xué)穩(wěn)定性較好。關(guān)鍵詞:A型肉毒神經(jīng)毒素;A型肉毒毒索復(fù)合物;理化特性;生物學(xué)特性中圖分類號：R971文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1005-5673(2016)04-0007-05DOI：10.13309/ki.pmi.2016.04.002PhysicochemicalpropertyandbiologicalcharacteristicsofbotulinumneurotoxintypeALlXiao-juan,ZHANGR

4、uo-hui,MIAOCheng-hui,SUJuan,HEXing,CUIBao-feng,ZHANGXue-pingDepartmentofToxinPreparation,IxinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor：ZHANGXue-ping,E-mail:zhangxp_lzAbstract:ObjectiveTostudytheph

5、ysicochemicalandbiologicalcharactrristicsofbotulinumneurotoxintypeA(BoNT/A)(simplifiedasneurotoxin),soastoprovideabasisondevelopmentofneurotoxinpreparation.MethodsThepurity,relativemolecularweight,isoelectricpoint,N-terminalaminoacidsequence,oraltoxicity,andbiologicalstabilityofneurotoxinwereinvesti

6、gatedbyusingofSDS-PAGE,HPI.C,CGE,sequencinganalysisandsoon,andthenincomparasionoftheobtainedsequenceresultofneurotoxinandtheaminoacidsintoxincomplexpreparationfromHallstrain(simplifiedastoxincomplex)publishedinNCBIblasttomakecertaintheformationincomponentofneurotoxin.Thetoxincomplexandneurotoxinprep

7、arationwerecarriedoutanoraladministrationtest.Thebulkandfinalbulkfbrthreebatchesofneurotoxinpreparationwereperformedastabilitytest.ResultsThePhysicalpurityofneurotoxinpreparationwasgreaterthan99.00%.TheprofileofSDS-PAGEandCGEshowedasinglebandundernon-reducingcondition,whichwasconfirmedtobeafull作者簡介:

8、李小ifi(1983-),女，醫(yī)學(xué)生物學(xué)工程師，主要從事細(xì)菌毒素的研究工作。通訊作者：張雪平，研究員,E-mail:zhangxp_kneurotoxinwitharelativemolecularweightabout152000andN-terminalaminoacidsequenceasALNDLQINVN.Underreducingconditionneurotoxinwascleavedtotwofragmentsasoneheavychainwitharelativemolecularweightabout101000andN-terminalaminoacidsequenceA

9、LNDLQINVN,andtheotherlightchainwith51000andN-terminalaminoacidsequencePFVNKQFNYK.Inaddition,isoelectricpointforneurotoxinwas4.91.LDS0ofneurotoxinbyoraladministrationwas1.50x10U/kginmouse,whichwas7.9timesthantoxincomplex.Finallypotencyofneurotoxindidnotdeclinewithin28daysstoredat2-8X.withahighspecifi

10、cactivitya-bout2.13x108U/mgproteinwhichwas7.1timesthantoxincomplex,thepotencyforfinalbulkdidnotdeclinewithin28daysstoredat18-26Y.ConclusionTheobtaindneurotoxinhasahighpurity(99%),theresultshowsthatneurotoxinisanintactdi-chainstructureconsistingofonelightchainandoneheavychainlinkedbya(leastonedisulfi

11、debondinnon-reducingcondition,butbecomestwochainsseparatelyinreducingcondition.Thebiologicalactivityofbulkandfinalbulkmaintainsanexcellentstability.Keywords:BotulinumneurotoxinoftypeA(Neurotoxin)；ToxincomplexpreparationfromHallstrain(Toxincomplex);Physicochemicalproperty;BiologicalcharacteristicsA型肉

12、毒毒素(BotulinumneurotoxinoftypeA)是由A型肉毒梭狀芽胞桿(Clostridiumbolulinumtype4)產(chǎn)生的，可阻斷神經(jīng)肌肉接頭及神經(jīng)元突觸乙酰膽堿的釋放，引起人和動物肉毒中毒，致死率極高在自然狀態(tài)或人工培養(yǎng)基上，A型肉毒神經(jīng)毒素與血凝素(Hemagglutinin,HA)和非毒素非血凝素蛋白(Non-loxicnon-HA,NTNH)通過非共價鍵蛆成A型肉毒毒素夏合物2。目前，國內(nèi)市售的A型肉毒毒素制品均為A型肉毒毒素復(fù)合物，注射后,A型肉毒毒素復(fù)合物在偏堿性的體液中非共價鍵被破壞,解離為獨立的A型肉毒神經(jīng)毒素、HA和NTNH分子:A型肉毒神經(jīng)毒素隨血液到

13、達靶位點發(fā)揮其作用;HA和NTNH不具有功能性作用，但具有刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的風(fēng)險O因此，研發(fā)純化的A型肉毒神經(jīng)毒素制品是未來應(yīng)用及發(fā)展的趨勢。實驗對A型肉毒毒素復(fù)合物純化得到的A型肉毒神經(jīng)毒素進行理化特性分析及生物學(xué)特性研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。1材料與方法11毒素A型肉毒毒素夏合物、A型肉毒神經(jīng)毒素、A型肉毒神經(jīng)毒素原液(批號：試B-20131201、試B-20140201.試B-20140302)均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司毒素制劑室制備。1.2 實驗動物SPF級昆明鼠(以下簡稱為小鼠)，雌性,26-30日齡，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司實驗動物室提供。1.3 主要試劑及儀

14、器聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)預(yù)制膠購自Invitrogen公司。AKTAPurifier層析系統(tǒng)購自GE公司；Waters高壓液相色譜(HighParss-ureLipuidChromatography,HPLC)購自美國Waters公司；GSKG2000SW分子排阻色譜柱購自日本東洋曹達公司;PA800plus毛細(xì)管凝膠電泳儀購自Backman公司理化特性1.4.1 純度采用4%12%SDS-PAGE對A型肉毒神經(jīng)毒素進行SDS-PAGE電泳，用Bio-RadImageLab3.0軟件對凝膠電泳條帶進行占比分析；對A型肉毒神經(jīng)毒素進行HPLC分析，色譜條件:分析柱為G2000SW分子排阻

15、色譜柱，流動相為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，流速為0.5mL/min,以4280nm檢測A型肉毒神經(jīng)毒素樣品，峰面積計算方法為歸化法Q14.2等電點測定將A型肉毒神經(jīng)毒素樣品送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心進行等電點聚焦電泳，測定其等電點。1.4.3相對分子質(zhì)量測定采用毛細(xì)管凝膠電泳(Capillarygelelectrophoresis,CGE)分析A型肉毒神經(jīng)毒素在非還原條件和還原條件下測定各組分的相對分子質(zhì)量。14.4N-末端氨基酸測序?qū)型肉毒毒素復(fù)合物及A型肉毒神經(jīng)毒素樣品送中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心進行N-末端10個氨基酸序列的測定，將測

16、序結(jié)果與NCBIblast數(shù)據(jù)庫中A型肉毒梭菌Hall株氨基酸序列進行比對,確證各組分的成分。1.5生物學(xué)特性151口服毒性將A型肉毒毒素復(fù)合物與A型肉毒神經(jīng)毒素分別等比稀釋,4只/稀釋度，小鼠通過灌胃途徑給藥，觀察96h,記錄小鼠的死亡情況，以Reed-Muench法計算其半數(shù)動物致死劑量(l&haldose50%,LDW)o1.5.2生物學(xué)穩(wěn)定性采用小鼠腹腔測定法，測定3批A型肉毒神經(jīng)毒素原液分別在28T保存0、7、14、21、28、35d的毒力。L5.3比活性根據(jù)毒力測定結(jié)果及蛋白含量計算3批A型肉毒神經(jīng)毒素原液的比活性。比活性=毒力/蛋白濃度。1.5.4半成品生物學(xué)穩(wěn)定性將3批A型肉毒

17、神經(jīng)毒素原液加入凍干保護劑分別制成半成品(批號：試20131205、試20140201、試20140302),于18-26幻分別放置0、7、14、21、28、35d,分別測其毒力，測定方法同1.3.2項。2結(jié)果2.1理化特性2.1.1純度SDS.PAGE圖譜結(jié)果顯示,A型肉毒神經(jīng)毒素在非還原條件下,SDS-PAGE蛋白條帶占比為99.03%,見圖1；HPLC圖譜結(jié)果顯示，其峰面積占比為99.27%,見圖2。即A型肉毒神經(jīng)毒素純輕鏈51000種徑毒素152000就。注：l.Marker；2.A型肉毒神經(jīng)毒素（非還原）;3.A型肉毒神經(jīng)毒素（還原）。圖1A型肉毒神經(jīng)毒素SDS-PAGE圖譜和N-末

18、端測序結(jié)果Fig.1SDS-PAGEanalysisandMterminalsequencetestforBotulinumneurotoxintypeA0.0400.0350.0300.0250.0200.0150.0100.005005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.00時間（min）圖2A型肉毒神經(jīng)毒素HPLC圖譜Fig.2TheHPLCofneurotoxin2.1.2等電點等電點凝膠電泳圖譜結(jié)果顯示,A型肉毒神經(jīng)毒素的等電點為4.91,見圖3。23注：1.PI;2.Marker；3.神經(jīng)毒素。圖3A型肉毒神經(jīng)毒素等電點聚焦電泳圖譜Fig.3TTiepro

19、fileofisoelectricfocusingelectrophoresisofneurotoxin2.1.3相對分子質(zhì)量非還原條件下A型肉毒神經(jīng)毒素的相對分子質(zhì)量為152000左右，見圖4；還原條件下呈現(xiàn)有兩種組分，分別為重鏈（約101000）和輕鏈（約51000）,見圖5。0.10rO0.08%12141618202224時間(min)Fig.4TheCGEchromatographyofneurotoxin(non-reducing)圖5A型肉毒神經(jīng)毒素毛細(xì)管凝膠電泳圖譜(還原)Fig.5TheCGEchromatographyofneurotoxin(reducing)圖4A型肉毒

20、神經(jīng)毒素毛細(xì)管凝膠電泳圖譜(非還原)214N-末端氨基酸非還原條件下為完整的A型肉毒神經(jīng)毒素（約152000）,還原條件下裂解為重鏈（約101000）和輕鏈（約51000）,見圖1。通過與NCBIblast數(shù)據(jù)庫比對，已確證的A型肉毒毒素復(fù)合物組分有：A型肉毒神經(jīng)毒素（152000）,HA70組分（57000J7000J5OOO）,HA33組分（30000.28000）0由于SDS-PAGE圖譜上136000與120000條帶距離較近，均未檢出氨基酸序列，推測其成分分別為NTNH（136000）、NTNH片段（120000）,見圖6。910M,注：lane8.A型肉毒毒素復(fù)合物(非還原);la

21、ne9,A型肉毒毒素復(fù)合物(還原)；lane10.Marker,圖6A型肉毒毒素SDS-PAGE圖譜和N-末端測序結(jié)果Fig.6SDS-PAGEanalysisandN-terminalsequencetestofBotulinumtoxintypeA(complex)口服樣品LDw(U/kg)A型肉毒毒素復(fù)合物1.90X106A型肉毒神經(jīng)毒素1.50X107表1A型肉毒毒素在小鼠中的口服毒性研究Tab.1TheoraltoxicityofBotulinumtoxintypeAinmouse圖7A型肉毒神經(jīng)毒素原液毒力趨勢圖Fig.7Thebiologicalstabilityofneurot

22、oxin(qlu/wae-R*善2.2生物學(xué)特性2.2.1 口服毒性A型肉毒神經(jīng)毒素小鼠的LD為1.50X107U/kg,是A型肉毒毒素復(fù)合物ID#的7.9倍，見表1。2.2.2 生物學(xué)穩(wěn)定性3批A型肉毒神經(jīng)毒素28T放置28d內(nèi)毒力無下降趨勢,波動范圍均未超過0天測定值的10%;2935d毒力均呈現(xiàn)下降趨勢，見圖7。2.2.3比活性3批A型肉毒神經(jīng)毒素的比活性分別為2.06x108、2.05xIO、2.27x108u/mg,平均值為2.13xl08U/mg,是A型肉毒毒素復(fù)合物比活性（平均值3.00X107U/mg）的7.1倍。2.2.4半成品穩(wěn)定性3批A型肉毒神經(jīng)毒素半成品（試201312

23、05、試20140201、試20140302）1826乜放置28d內(nèi)毒力無下降趨勢，波動范圍均未超過0d測定值的10%,見圖8。3Erae-R99%)。相對分子質(zhì)量測定結(jié)果和N-末端氨基酸序列測定結(jié)果均與Inoue等的報道一致。對A型肉毒神經(jīng)毒素各項理化特性分析結(jié)果確證，A型肉毒神經(jīng)毒素(152000)由輕鏈(51000)和重鏈(101000)至少通過一個二硫鍵連接。等電點為4.91；經(jīng)口服A型肉毒神經(jīng)毒素的小鼠LD*為1.50xIO,U/kg,是其復(fù)合物的7.9倍，其原因是A型肉毒毒素復(fù)合物中的非毒性蛋白可保護神經(jīng)毒素免受消化系統(tǒng)低pH以及消化酶的降解，HA70和HA33上具有多個糖類結(jié)合位

24、點，使復(fù)合物通過與糖類的多價連接，在小腸細(xì)胞表面富集復(fù)合物分子，從而增加其吸收兇。A型肉毒神經(jīng)毒素在28T放置28d,半成品在18-26T放置28d,生物學(xué)活性均無下降，表明其具有良好的穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化尚待進一步研究。A型肉毒神經(jīng)毒素比活性可達到2.13X108U/mg,遠(yuǎn)高于歐洲藥典(8.0)的規(guī)定(1.0x108U/mg),是復(fù)合物比活性的7.1倍。20092015年生產(chǎn)的A型肉毒神經(jīng)毒素比活性平均值為1.92xU/mg(0.98x2.86xU/mg)，推算出100U/瓶神經(jīng)毒素制品的活性藥用成分(Activepharmaceuticalingredient,API)平均含量為0

25、.52ng,50U/瓶神經(jīng)毒素制品的API平均含量為0.26ng。與在售制品注射用A型肉毒毒素(衡力)相比,蛋白載量進一步降低，使抗體產(chǎn)生的概率下降。綜上所述，純化得到的A型肉毒神經(jīng)毒素純度和比活性高,成品和半成品的穩(wěn)定性好。A型肉毒毒素具有廣泛的應(yīng)用前景,不僅在醫(yī)學(xué)美容方面,隨著在各種肌張力障礙、手足多汗癥、疼痛等領(lǐng)域的臨床應(yīng)用,A型肉毒神經(jīng)毒素作為一種新的產(chǎn)品，將逐步替代A型肉毒毒素復(fù)合物。實驗分析了A型肉毒神經(jīng)毒素的理化及生物學(xué)特性，為A型肉毒神經(jīng)毒素制品的研制提供了有力的依據(jù)。參考文獻王萌椿，湯曉芙.肉毒毒素臨床治療手冊M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005：9-12.1 何星，苗承輝,李小蛆，等.注射用A型肉毒毒素的生物學(xué)特性及質(zhì)量分析JL生物制品學(xué)雜志,2012,25(11):1488-1491,1497.2 李小娟，張若暉，周易，等.不同pH和溫度對A型肉毒毒素結(jié)構(gòu)及活性的作用J.微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2015,43(5):23-26.3 KukrejaR,ChangTW,CaiS,elal.Inununologicalcharacterizationofthesubunitsoftyp