MS2介導(dǎo)的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究.docx

1、第52卷第2期2013年3月Vol.52No.2Mar.2013廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)doi：10.6043/j.issn.0438-0479.2013.02.019MS2介導(dǎo)的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究董艷美】，張國(guó)廣很，汪衛(wèi)。范紅軍3,陳亮I(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361102；2.潦州師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系.福建潭州363000,3.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000)摘要：研究表明，口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)的VP1蛋白含有關(guān)

2、鍵的抗原決定簇.根據(jù)()/HL-JOC12/03豬源FMDV毒株VP1上第141160位敘基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用重橙延伸PCR(SOEPCR)技術(shù)將該序列插入在大腸桿菌(.Escherichiacoli)噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點(diǎn).然后連接到原核表達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒28a-CP-VPl,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),ITPG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合表達(dá)的CP-VP1.透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類病毒顆粒(virus-likeparticles,VLPs)狀.間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白能夠特異地結(jié)合豚鼠抗O型FMDV的陽性血清，30Mg的CP-VP1的VLPs蛋

3、白免疫小鼠后可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生高效價(jià)的特異抗體.故該口蹄疫病毒抗原決定簇展示在噬菌體MS2上表面的VLPs蛋白具有開發(fā)成口蹄疫疫苗的前景.關(guān)鍵詞：口蹄疫；MS2噬菌體;抗原決定簇；類病毒顆粒中圖分類號(hào)：Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0438-0479(2013)02-0237-07口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirusFMDV)引起的危害牛、豬、羊、駱駝、鹿、耗牛等約70種家畜及野生偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病口句.因?yàn)槠湟坏┍l(fā)則傳播速度快，流行范圍廣，補(bǔ)救措施少，可造成上百億美元的直接經(jīng)濟(jì)損

4、失，故被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)規(guī)定其為一類動(dòng)物疾病口.FMDV為單股正鏈RNA病毒，主要有7個(gè)血清型W,近年來，爆發(fā)流行于我國(guó)境內(nèi)的大都是。型、A型和AsiaI型.自緬甸98(MYA98)譜系FMDV2010年2月在我國(guó)廣州白云區(qū)疫區(qū)首次發(fā)現(xiàn)以來，該病毒已經(jīng)持續(xù)地給我國(guó)多省的畜牧業(yè)造成了巨大的損失，并FL該病毒在不同宿主變異較大雖然傳統(tǒng)的滅活疫苗的免疫原性比較好，也在FMD疫情的控制和在動(dòng)物保護(hù)上發(fā)揮了極其重要的作用，但是，滅活苗在生產(chǎn)過程中不僅要求嚴(yán)格，且存在安全隱患的問題W,并且免疫動(dòng)物和感染FMDV的動(dòng)物無法很好區(qū)分，限制了動(dòng)物產(chǎn)品的出口，此收稿日期：2

5、012-11-07基金項(xiàng)目：福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2009N0051);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010J01240)；廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20103007)*通信作者:chenlg外，滅活苗的有效期較短，諸如此類的缺陷使得尋找更安全穩(wěn)定的新型疫苗成了科學(xué)工作者的大方向口】。】2.與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗是一類非常安全高效的疫苗.大腸桿菌(Escherichiacoli)MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長(zhǎng)3659bp,編碼成熟酶蛋白(或A蛋白)、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等4種蛋白質(zhì)分子口歸們.研究發(fā)現(xiàn)，體外將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因以及包含

6、基因調(diào)節(jié)元件的5'非編碼序列的基因克隆到表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白可自我組裝為成熟的類病毒顆粒(virus-likeparticles»VLPs)1-1516-1，且在其外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)處插入幾個(gè)基因可以表達(dá)成外源氨基酸展示的VLPs狀mm,以此，我們可以開發(fā)出VLPs疫苗.VLPs疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強(qiáng)大的免疫優(yōu)勢(shì)：表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，大小合適，易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生很好的免疫效果；在血清中的半衰期較長(zhǎng)等等口"本項(xiàng)研究選擇了O/HL-JOC12/03毒株FMDV的VP1蛋白上關(guān)鍵的抗原決定簇第141160位氨基酸002。對(duì)應(yīng)的核昔酸序列，利用

7、重疊延伸RCR(SOEPCR)插入到MS2噬菌體的外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)，經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)出O/HLJOC12/03FMDV的抗原決定簇多肽表達(dá)展示在MS2病毒樣顆粒的表面的VLPs.體外和體內(nèi)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)該VLPs蛋白可以很好地誘導(dǎo)被免疫的小鼠產(chǎn)生特異的抗體，且具有很好的免疫原性本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)出新型的FMD的VLPs疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).1材料與方法1.1材料1.1.1菌株、質(zhì)粒和主要試劑BL2KDE3）表達(dá)菌株，為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMS27（包含有大腸桿菌噬菌體MS2的結(jié)構(gòu)基因序列尸門由美國(guó)新墨西哥大學(xué)的DavidS.Peabody教授惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶BamHI和

8、N/zeI酶，氨革青霉素、卡納霉素等抗生素及Taq酶，T4連接酶，dNTPs和克隆載體pMD18-TSimpleVector等購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；DNAMarker和ProteinMarker購(gòu)自北京天為時(shí)代科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；5X蛋白緩沖液、SDS-PAGE配制溶液、磷酸鹽緩沖液和電轉(zhuǎn)緩沖液等均按分子克隆實(shí)駛指南進(jìn)行配制.I.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、陽性血清實(shí)驗(yàn)選用的15只20g左右的健康清潔級(jí)的BAL（B/C）小鼠購(gòu)自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；（）型FMDV抗原和豚鼠的陽性血清等購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小

9、鼠的IgG抗體購(gòu)自成都的杰華科技有限公司.1.1.3引物根據(jù)PMS27序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增出能夠自我組裝的MS2的5非編碼區(qū)、成熟酶基因、外殼蛋白基因的序列的引物為U-CP和D-CP.引物序列見表1.根據(jù)網(wǎng)站http：/上公布的O/HL-JOC12/03毒株FMDV的VP1基因序列，我們將其141-160位氨基酸的基因設(shè)計(jì)到2個(gè)引物F-1-R98和F-2-F98中.1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建1）對(duì)照載體的構(gòu)建：以pMS27為模板，U-CP和D-CP為引物擴(kuò)增出MS2的5'非編碼區(qū)、成熟酶基因、外殼蛋白基因的序列，然后進(jìn)行N腥I和BamHI的雙酶切，酶切后的

10、片段連接到同樣線性化的pET28a上，挑取單克隆鑒定，構(gòu)建了重組質(zhì)粒28a-CP.2）28a-CPVPl重組質(zhì)粒的構(gòu)建：利用SOEPCR技術(shù)，以質(zhì)粒pMS27為模板，兩對(duì)引物U-CP和F-1-R98注：U-CP引物中序列斜線部分為NheI酶切位點(diǎn)；I>CP引物中序列斜線部分為BamHI酶切位點(diǎn).引物F-1-R98和F-2-F98下劃線部分為19bp的互補(bǔ)片段.表1PCR或者SOEPCR中用到的引物及其序列Tab.1ThesequencesoftheprimersusedinPCRorSOEPCR引物名稱引物序列（5'f3'）U-CPCTAGCTAGCTA（；GAGGTTT

11、GACCTGTGCGAGCI>CPAAACGGATCCCAACCATCTACCATTC5-CCTGCCF-1-R98GAGCCAGCACTTGGAGATCGCCTC'T.CACGTTTGGCACAGCGGTACCGCCATT-GTCGACGAGAACF-2-F98GATCTCCAAGTGCTGGCTCAGAAGGCAGCGAGGCCGCTGCCTGGAACTTCT-TTCGTGACTGTCGCCCC及F2F98和BCP分別擴(kuò)增出上、下游片段，凝膠回收后等量混合做模板，用引物U-CP和D-CP擴(kuò)增出片段CP-VPK圖1）.U-CPF-1-R98IpMS27F2F98F2F98SOE

12、PCRU-CPCP-VP1NVRGDLQVLAQKAARPLPTS圖1VP1抗原決定簇展示載體構(gòu)建示意圖Fig.1TheconstructionalschematicdiagramofdisplayvectorofVP1epitopesCP-VP1經(jīng)過Nhel和BamHI雙酶切，然后連接到線性化的原pET28a上.轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5q中，抗性板上挑出單克隆，鑒定序列正確的質(zhì)粒命名為28a-CP-VPl.1.2.2重組蛋白的表達(dá)與SDS-PAGE分析將重組質(zhì)粒28a-CP及28a-CP-VPl分別轉(zhuǎn)化大腸桿陶BL21感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（5。ptg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng).用1mm

13、ol/L的異丙基硫代半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)菌體合成重組蛋白.表達(dá)結(jié)束后4000r/min,25min離心收集菌體，按V（菌體）:V（破壁液）=1：6的比例加入破壁緩沖液.超聲破壁23次，每次約5min.12000r/min離心15min.上清中加入緩沖液，混勻，沸水煮5min,12000r/min離心15min.取15從L上樣，進(jìn)行SDS-PAGE.1.2.3表達(dá)蛋白的電鏡觀察IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì).據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南四r|.的X噬菌體的純化實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行純化操作.在破碎所得的I：清中加固體NaCl至終濃度為1mol/L，室溫12OOOr/min離心10min；然后上清中再加固體聚乙二醇PE

14、G8000至終質(zhì)址分?jǐn)?shù)為10%;離心10min,回收沉淀的VLPs,加適量的水,再加入等體積的三氯甲烷振蕩30s；室溫6000r/min離心15min,回收含VLPs的水相.即為初純的VLPs.所得的初純的VLPs再進(jìn)行蔗糖密度梯度32000r/min離心6h后,可觀察到VLPs位于約35%（質(zhì)量分?jǐn)?shù),不同）蔗搪位置處；取出再進(jìn)行透析.取5透析好的樣品經(jīng)1%（體積分?jǐn)?shù)）的乙酸雙氧鈾染色5min.自然干燥2h.用JEM2100透射電子顯微鏡分別觀察28a-CP及28a-CP-VP12種表達(dá)蛋白的形態(tài).1.2.4重組蛋白免疫原性分析免疫印跡檢測(cè)：將經(jīng)SDSPAGE分離的28a-CP及28aCPVP

15、1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上.用Tris-HCI（pH6.5）溶液進(jìn)行洗膜.洗3次.每次3min.將膜置于脫脂奶粉宅溫封閉1h.棄封閉液.用PBS洗滌3次.每次3niin.加入豚鼠的陽性血清，置25C3h.棄抗體,洗滌.加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠血清（1U000稀釋）.棄抗體.洗滌.取復(fù)3次.進(jìn)行E增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色.然后顯影定影.間接ELISA：以重組28a-CP-VPl的VLPs蛋白為包被抗原.用豚鼠的陽性血清做一抗HRP標(biāo)記的兔抗豚鼠血清做二抗設(shè)置28a-CP蛋白為陰性對(duì)照病毒抗原做陽性對(duì)照.進(jìn)行間接ELISA.鑒定重組VLPs能否與陽性血清發(fā)生免疫反應(yīng).動(dòng)物的免疫實(shí)驗(yàn)：

16、將15只小鼠隨機(jī)分3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組.其中陰性對(duì)照組的每只小鼠川28a-CP免疫,陽性對(duì)照組中的每只小鼠用傳統(tǒng)的滅活疫苗進(jìn)行免疫.每只小鼠肌肉注射30MgVLPs賀白.每周加強(qiáng)免疫1次.共加強(qiáng)免疫3次.末次免疫后采血.用EL1SA檢測(cè)血清抗體的特異性和效價(jià)，抗體效價(jià)定為能發(fā)生陽性顏色反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù).ELISA板每孔包被約15Mg的標(biāo)準(zhǔn)抗原.4C過夜.洗滌液洗滌5次封閉液封閉1.5h,然后加入梯度稀釋的待測(cè)血清.加陰性、陽性血清作為對(duì)照.36.5C溫育1h.再次洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠的二抗.加200“L/孔鄰苯二胺顯色底物.室溫避光30min，加入終止液終

17、止反應(yīng).用麗標(biāo)儀測(cè)（）D頌值.將空白孔的（）D值設(shè)為0.如（）D值大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍.認(rèn)為是陽性.2結(jié)果2.1表達(dá)載體28a-CP-VPl及28a-CP的構(gòu)建2.1.1CP-VP1片段的擴(kuò)增以pMS27質(zhì)粒為模板.以UCP和F1-R98為引物.擴(kuò)增出上游片段；以F-2-F98和D-CP為引物擴(kuò)增出下游片段.大小分別為700l）p（T游片段）、1300bp（上游片段）基因片段.片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖2（a）.上下游基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后的1叫收后作為模板.以D-CP和U-CP為引物進(jìn)行S（）EPCR.擴(kuò)增出預(yù)定大小2000bp的基因片段（圖2（1）.(a)bpM3(l>)(a

18、)M.DL2000DNAMarker；1.T游片斷；2.上游片斷.(b)M.DL5000DNAMarker；3.S()EPCR產(chǎn)物:CP-VP1.圖2CP-VP1的上下游片段及整條片段的擴(kuò)增電泳圖Fig.2Theupstream.downs!reamandthewholefragmentsof(P-VP1wereamplifiedandanalyzedbygelelectrophoresis2.1.2pET28a分別與CP、CP-VP1基因的連接經(jīng)過BamW1和Nhe酶切的CP及CP-VP1片段連接到同樣線性化的原核表達(dá)載體匕經(jīng)過街液PCR鑒定（圖3（a）和（b）、福切鑒定與測(cè)序鑒定.正確的連

19、接產(chǎn)物分別命名為28a-CP、28a-CPVP1.2.228a-CP及28aCPVPl的表達(dá)28a-CP-VPl及28aCP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿蹈BL2KDE3）中,活化到以）值為0.6時(shí)加IPTG誘導(dǎo),經(jīng)SD&PAGE證明rCP、CPVP1融合基因獲得了表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物大小分別約為11和16ku（圖l）".j預(yù)期大小一致.M20()0CP-VP1(a)(b)(a)M.DL2000DNAMarker；1-2.陽性克隆.(b)M.DL2000DNAMarker；!.陽性克隆.圖328a-CP(a)及28a-CP-VPl(b)連接產(chǎn)物的菌液PCR鑒定Fig.3Positiveclone

20、sof28a-CP(a)and28a-CP-VPl(1)wereidentifiedbyPCR-CP-VP1-CP-VP1M.蛋白Marker；!.陰性對(duì)照；2.28a-CP表達(dá)產(chǎn)物上清；3.28aCPVP1表達(dá)產(chǎn)物沉淀,4.28a-CP-VPl表達(dá)產(chǎn)物上清.圖428a-CP及28aCPVPl誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE圖Fig.4SDS-PAGEelectrophoresisresultsofproductsexpressedby28a-C'Pand28a-('PVPl蔗糖.透析后的樣品經(jīng)醋酸鈾染色5min.自然F燥2h.28a-CP-VPl純化后的表達(dá)蛋白在10000XJM

21、2100透射電鏡下觀察，可以看到28a-CP-VPl重組蛋白成直徑約為65nm的圓形顆粒.即誘導(dǎo)表達(dá)的VLPs（圖5）.圖528MP-VP1表達(dá)的VLPs的電鏡觀察結(jié)果Fig.5ElectronmicroscoperesultofVLPsexpressedby28a-CP-VPl2.3VLPs的電鏡觀察結(jié)果將28a-CP-VPl表達(dá)菌株BL2KDE3）中活化后擴(kuò)大培養(yǎng)至1L培養(yǎng)基,在1mmol/LIPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，收集菌體.經(jīng)超聲破碎處理后將超聲破碎液于37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化過夜.利用菌體本身含有的RNase除去其中的細(xì)菌RNA,而VLPs中的RNA由于蛋H外殼的保護(hù)不受影響,將

22、過夜消化的超聲破碎液離心棄去沉淀得到含VLPs的上清，上清用PEG8000初步純化后，通過庶糖密度梯度離心繼續(xù)純化.可以住35%蔗糖梯度X域內(nèi)看到經(jīng)純化濃縮后的VLPs,小心取出后進(jìn)行PBS透析以除去樣品中的2.428a-CP-VPlVLPs免疫原性的檢測(cè)2.4.1蛋白免疫印跡Westernblotting結(jié)果顯示28a-CP-VPl蛋白與FMDV陽性血清反應(yīng).可在16ku附近出現(xiàn)特異性免疫印跡條帶，與此相對(duì)照的28a-CP蛋白與陽性血清沒有相互作用（圖6）,表明CP-VP1具有良好的抗原性.2.4.2VLPs蛋白的免疫活性豚鼠的陽性血清做一抗，重組蛋白28aCPVPlM.蛋白質(zhì)Marker；

23、1.28a-CP-VPl表達(dá)產(chǎn)物;2.28a-CP表達(dá)產(chǎn)物.圖628a-CP-VPl表達(dá)的VLPs的蛋白免疫印跡結(jié)果Fig.6Immunoblotresultsofpurified28a-CP-VP1VLPsproteins活性的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果可以看到,28a-CP-VPl有很好的免疫活性(圖7(a).Thegradientdilutionoftheimmunesera(b)免疫小鼠抗血清的抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果圖728a-CP-VPl的免疫原性檢測(cè)結(jié)果Fig.7Theresultsof28a-CP-VPlimmunogenicitydetection重組蛋白28a-CP-VPl乳化制成疫苗

24、免疫豚鼠后的抗血清ELISA法測(cè)抗血清的效價(jià)，結(jié)果顯示與傳統(tǒng)的滅活苗對(duì)比，28a-CP-VPl的VLPs蛋白同樣能誘導(dǎo)出高效價(jià)的抗血清，純化蛋白免疫后血清的效價(jià)約為51200(圖7(b).這說明展示了20個(gè)FMDV抗原表位氨基酸的VLPs蛋白具有很好的免疫原性.3討論FMD的爆發(fā)和流行給許多國(guó)家的畜牧業(yè)造成了巨大的危害,發(fā)達(dá)國(guó)家實(shí)行“撲殺為主、經(jīng)濟(jì)補(bǔ)償”的綜合防控措施，發(fā)展中國(guó)家主要采用疫苗免疫為主的預(yù)防措施，故疫苗的需求市場(chǎng)很大.前人的研究證實(shí)。型FMDV的VP1蛋白中的第141160位氨基酸是FMDV最重要的抗原決定簇之一，可以誘導(dǎo)被免疫的肌體產(chǎn)生有效的抗體3°駕.基于此，基因工

25、程疫苗或者合成肽疫苗因?yàn)槠浒踩⒏咝V譜的免疫力等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已得到很大的推廣.但是，如果僅僅這20個(gè)氨基酸或者這20個(gè)氨基酸的重復(fù)肽段因?yàn)榉肿淤|(zhì)量太小或者構(gòu)象不足以使得被免疫的動(dòng)物產(chǎn)生足夠的抗體加，故研發(fā)者們常常選擇將它們與一個(gè)大的蛋白或者載體分子或者更多的淋巴細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)連接皿".本項(xiàng)研究將一段重要的FMDV的抗原表位插入到大腸桿菌MS2噬菌體的蛋白外殼基因的特定位點(diǎn)處，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌MS2噬菌體可以將FMDV表位展示且成大小均勻形狀規(guī)則的VLPs.VLPs疫苗近年來因?yàn)槠渥陨砭哂辛己玫拿庖咴缘┵|(zhì)量穩(wěn)定、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)吸引力眾多疫苗研發(fā)者的月光°

26、;。.本項(xiàng)研究中也發(fā)現(xiàn)展示()型FMDV抗原決定簇的VLPs蛋白活性較好，經(jīng)過蛋白免疫檢測(cè)和動(dòng)物免疫試驗(yàn)，都證實(shí)該VLPs有很好的且特異的免疫原性，能誘導(dǎo)被免疫的小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的抗血清.不管是基因工程疫苗還是合成肽疫苗都是選擇一部分免疫原性較好的抗原決定簇作為疫苗的有效成分，而完整的或者近完整的滅活病毒或減毒抗原保留了該病原體的絕大部分抗原性，故免疫效果一般不如后者好.但是我們的實(shí)驗(yàn)中VLPs蛋白免疫動(dòng)物后的抗血清的效價(jià)也算理想.由此看來可將該蛋白作為包被抗原，開發(fā)成FMDV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，為進(jìn)一步研制安全、高效、廣譜的FMD診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)；且該VLPs蛋白有望進(jìn)而研發(fā)成高效安

27、全的FMD疫苗，對(duì)FMD的預(yù)防或控制有很現(xiàn)實(shí)的意義.參考文獻(xiàn)：1 SobrinoF,SaizM,Jimenez-ClaveroMA,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus：alongknownvirus,butacurrentthreatJ.VetRes,2001,32：l30.2 李平花，白興文，盧曾軍，等.口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因組全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建J.畜牧獸醫(yī)報(bào)，2009,40:706-711.3GrubmanMJ,BaxtB.Foot-and-mouthdiseaseJ.ClinicalMicrobiologyReviews,20

28、04,17：465-493.4Pereira11G.Foot-and-mouthdiseasevirusM/Virusdiseasesoffoodanimals.NewYork：AcademicPressInc,1981;333-363.5吳錦艷，田宏.陳妍，等.20092011年國(guó)內(nèi)外口蹄疫的流行現(xiàn)狀與分析J.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011,41:23-24.6AcharyaR,FryE,StuartD,etal.Thethree-dimensional-ostructureoffoot-and-mouthdiseasevirusat2.9Aresolu-tionLJ.Nature,1989,337

29、：709-716.7 GrubmanMJ,BaxtB.Foot-and-mouthdiseaseJClinicalMicrobiologyReviews,200417：465-493.8 BeckE,StrohmaierK.SubtypingofEuropeanfoot-and-mouthdiseasevirusstrainsbynucleotidesequencedeter-minationJlJVirol,1987,61：1621-1629.9KingA,UnderwoodB,MccahonD,etal.Biochemical卜dentificationofvirusescausingth

30、e1981outbreaksoffoot-and-mouthdiseaseintheUK_JJ.Nature,1981,293：479-480.10 WangCY,ChangTY,WalfieldAM,etal.Effectivesyntheticpeptidevaccineforfoot-and-mouthdiseaseinswineJ.Vaccine,2002,20:2603-2610.11 SdizM,NunezJLJimenez-ClaveroMA,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus：biologyandprospectsfordiseasecon-trol

31、Jl.MicrobesandInfection,2002,4：1183-1192.12 CarrilloCtWigdorovitzAOliverosJC,etal.Protectiveimmuneresponsetofoot-and-mouthdiseaseviruswithVP1expressedintransgenicplantsJ.JVirol,1998,72:1688-1690.13JValegardK,LiljasL,FridborgK,etal.Thethree-dimensionalstructureofthebacterialvirusMS2J.Nature,1990,345(

32、6270):36-41.14StraussJIIJr,SinsheimerRL.PurificationandpropertiesofbacteriophageMS2andofitsribonucleicacidJJMolBiol,1963,7：43>54.15JPeabodyDS,Manifold-WheelerB,MedfordA,etal.Immunogenicdisplayofdiversepeptidesonvirus-likeparticlesofRNAphageMS2J,JMolBiol,2008,380：252-263.16AshleyCE,CarnesEC,Philli

33、psGK,etal.Cell-specificdeliveryofdiversecargosbybacteriophageMS2viruslikeparticlesJlACSNANO,2011,5：5729-5745.17HealKG,HillHR,StockleyPG,etal.ExpressionandimmunogenicityofaliverstagemalariaepitopepresentedasaforeignpeptideonthesurfaceofRNA-freeMS2bacteriophagecapsidsLJj.Vaccine,1999,18(3/4)：251-258.1

34、8PeabodyDS.SubunitfusionconferstolerancetopeptideinsertionsinaviruscoatproteinJ.ArchBiochemBio-phys,1997,347:85-92.19|BundyBCFranciszkowiczMJ,SwartzJR.Escherichiacolibasedcellfreesynthesisofviruslikepartic)esJBiotechnologyandBioengineering»2008100；28-37.20 WongH,ChengSCS,ChanEWC,etal.Plasmidsen

35、codingfoot-and-mouthdiseasevirusVP1epitopeselicitedimmuneresponsesinmiceandswineandprotected-swineagainstviralinfectionJ,Virology,2000,278：27-35.21 ShakleePN.NegativestrandRNAreplicationbyQbetaandMS2positive-strandRNAbacteriophagereplicasesJlVirology,1990,178:340-343.22 金冬雁，黎孟楓.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M.2版.北京：科學(xué)出版社

36、3999.23 徐宗香，高明春，李勵(lì).等.Asial型口蹄疫病毒VP2蛋AB細(xì)胞線性表位的鑒定口.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009.40(10):1508-1513.24 WadaM,NaganoM.KidoH,etal.SuitabilityofFBAmethodfortheevaluationoftheoxidativeeffectofnonwater-solubleandwater-solublerosemaryextracts|J.JournalofOleoScience,2011.60：579584.25 VerdaguerN,MateuMG,AndreuD,etal.Structureoft

37、hemajorantigenicloopoffoot-and-mouthdiseaseviruscomplexedwithaneutralizingantibody：directinvolvementoftheArg-Gly-Aspmotifintheinteraction|J|.TheEMBOJ,1995,14(8)：1690-1696.26DiMarchiR,BrookeG»GaleCetal.Protectionofcattleagainstfoot-and-mouthdiseasebyasyntheticpeptideJ.Science,1986,232:639-641.27

38、 MorganD,MooreD.Protectionofcattleandswinea-gainstfoot-and-mouthdiseaseusingbiosyntheticpeptidevaccinesJ.AmJVetRes,1990,51：40-45.28 LiGJ,ChenWZ,YanWY,etal.Comparisonofimmuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusinducedbyfusionproteinsusingtheswineIgGheavychainconstantregionor-galactosidaseasacar

39、rierofimmunogenicepitopesFj.Virology,2004,328：274-281.29 ZhangQ,LiLX,YanAG,etal.Immunogenicityofarecombinantfusionproteinoftandemrepeatepitopesoffoot-and-mouthdiseasevirustypeAsia1forguineapigsJ.ActaVirol,2002,46：1-9.30JSubramanianBM,MadhanmohanM,SriramanR,etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseaseviru

40、s(FMDV)serotype()virus-like-particles(VLPs)vaccineandevaluationofitspotencyCJJ.ANTIVIRRES,2012,96(3)：288-295.StudyonMS2MediatedVirus-likeParticlesVaccineAgainstFoot-and-monthDiseaseDONGYan-mei1,ZHANGGuo-guang】"，WANGWei1,FANHong-junCHENLiang1*(1.SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China；2.DepartmentofBiologicalScienceandTechnology,ZhangzhouNormalUniversityZh