先天性巨結(jié)腸患兒一氧化氮合酶的免疫組織化學(xué)觀察

1、先天性巨結(jié)腸患兒一氧化氮合酶的免疫組織化學(xué)觀察先天性巨結(jié)腸是兒科較常見的疾病，新生兒的發(fā)病率為1/20 0001/30 0001。其病理表現(xiàn)主要為結(jié)腸遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞完全缺乏?，F(xiàn)已證實一氧化氮（NO）是人類腸道非腎上腺非膽堿能神經(jīng)的遞質(zhì)，能有力地松弛平滑肌。我們采用一氧化氮合酶（NOS）免疫組織化學(xué)方法間接反應(yīng)NO的情況，以了解在先天性巨結(jié)腸擴(kuò)張段，移行段，狹窄段NOS的分布狀況，探討NO在先天性巨結(jié)腸發(fā)病中的意義。 一、材料與方法1標(biāo)本的收集與處理：收集1998年內(nèi)先天性巨結(jié)腸新鮮標(biāo)本10份，患者年齡10 d3歲，其中新生兒5例。每例分別取擴(kuò)張段，移行段，狹窄段3個部位全層腸壁。先天性巨結(jié)腸的

2、診斷均依據(jù)病史，體征，鋇灌腸綜合判斷確診，術(shù)后均經(jīng)常規(guī)病理檢查證實。2免疫組織化學(xué)染色技術(shù)：所有標(biāo)本均做6 m厚冷凍連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)采用SP法染色，NOS多克隆抗體選用Santa Cruz公司產(chǎn)品，神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、S-100蛋白單克隆抗體選用Zymed公司產(chǎn)品，顯示系統(tǒng)選用Histostain-SP試劑盒，DAB顯色。所有染色均用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。所有標(biāo)本同時行常規(guī)石蠟切片，HE染色。3免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：以腸壁粘膜下及肌間神經(jīng)叢內(nèi)NOS、S-100、NSE 陽性著色的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維的有無，增生或減少作為觀察指標(biāo)。二、結(jié)果1大體觀察：

3、結(jié)腸的一部分顯著擴(kuò)張、肥厚，直徑可達(dá)56 cm。而狹窄部分直徑僅為1 cm，腸壁無明顯增厚。移行段直徑界于擴(kuò)張段和狹窄段之間。2HE染色：擴(kuò)張段粘膜下層及肌間神經(jīng)叢內(nèi)均可見清晰的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可見到尼氏小體。移行段：粘膜下層和肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞少，且明顯變性，胞膜不清，胞質(zhì)濃染，尼氏小體消失，細(xì)胞核固縮。狹窄段：各層均未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，粘膜下及肌間神經(jīng)纖維較擴(kuò)張段顯著增粗。3免疫組織化學(xué)染色：NOS陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維分布于擴(kuò)張段和移行段的肌間神經(jīng)叢及粘膜下神經(jīng)叢內(nèi)。以擴(kuò)張段最多。擴(kuò)張段：在肌間神經(jīng)叢及粘膜下神經(jīng)叢內(nèi)出現(xiàn)NOS及NSE強(qiáng)陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（1）。且二者的分布基本一致

4、。S-100蛋白對此神經(jīng)節(jié)細(xì)胞無免疫反應(yīng)。在肌間神經(jīng)叢、環(huán)行肌、縱行肌內(nèi)及粘膜下可見NSE、S-100、NOS陽性神經(jīng)纖維。這些纖維呈黃褐色，以S-100蛋白更清晰。三者均在環(huán)形肌分布最多,粘膜下層最少。S-100及NSE陽性纖維在各層均多于NOS陽性纖維，前兩者分布相似。移行段：肌間神經(jīng)叢及粘膜下神經(jīng)叢內(nèi)有NOS和NSE陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但明顯少于擴(kuò)張段。粘膜下及肌層內(nèi)NOS陽性的神經(jīng)纖維亦少于擴(kuò)張段。而S-100和NSE陽性的神經(jīng)纖維與擴(kuò)張段比較無明顯減少。狹窄段：各層均缺乏NOS和NSE陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。粘膜下及肌間僅見少量NOS弱陽性的神經(jīng)纖維，大部分神經(jīng)纖維呈NOS陰性反應(yīng)。但NSE

5、，S-100蛋白仍成強(qiáng)陽性表達(dá)， 且神經(jīng)叢較擴(kuò)張段明顯增粗。1擴(kuò)張段肌間神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞NOS表達(dá)SP法400三、討論1990年Bult等2證實刺激胃腸道的非腎上腺非膽堿能神經(jīng)可引起NO的釋放。由于NO半衰期很短，常規(guī)方法不易測到，但可通過對NOS的檢測間接反應(yīng)NO的情況。本實驗通過NSE、S-100染色來顯示腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維的分布，將其作定位與NOS染色對照觀察。其結(jié)果，NOS和NSE陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布基本一致。在擴(kuò)張段，陽性著色的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯多于移行段。在狹窄段，未見NOS和NSE陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。 NOS陽性的神經(jīng)纖維在擴(kuò)張段明顯多于移行段，而在狹窄段僅見少量弱陽性表達(dá)的神經(jīng)

6、纖維。NSE、S-100陽性的神經(jīng)纖維在狹窄段非但沒有減少，而且有增生。許多學(xué)者已證實增生的神經(jīng)纖維是引起腸道平滑肌收縮的膽堿能神經(jīng)。這樣，在狹窄段就造成了引起腸道平滑肌松弛的非腎上腺非膽堿能神經(jīng)和引起平滑肌收縮的膽堿能神經(jīng)的失衡，導(dǎo)致該段腸管持續(xù)性痙攣，進(jìn)而發(fā)生巨結(jié)腸。 本實驗結(jié)果與Larsson等3的實驗結(jié)果一致。Okelly等4用還原性輔酶依賴性黃遞酶NADPH-d觀察先天性巨結(jié)腸病人腸道NOS的分布，其結(jié)果亦與本實驗所用免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。Hanani等5在對3例先天性巨結(jié)腸病人NOS的定量分析中發(fā)現(xiàn)，在狹窄段，3例病人的平均NOS活性明顯低于擴(kuò)張段。擴(kuò)張段的含量與非先天性巨結(jié)腸病人

7、十分相似。作者單位：胡曉麗（天津市兒童醫(yī)院病理科 300074）王學(xué)文（天津市兒童醫(yī)院病理科 300074）詹江華（天津市兒童醫(yī)院外科 300074）參考文獻(xiàn)1，劉彤華.食管、胃、腸和肛門.見:劉彤華,主編.診斷病理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社,1995.96.2，Bult H，Boeckxstaens GE，Pelckmans PA, et al. Nitric oxide as an inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature，1990，345：346-347.3，Larsson LT，Shen Z，Ek

8、blad E，et al. Lack of neuronal nitric oxide synthase in nerve fibers of aganglionic intestine：a clue to Hirschsprungs disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr，1995，20：49-53. 4，OKelly TJ, Davies JR,Tam PK, et al. Abnormalities of nitric- oxide- producing neurons in Hirschsprungs disease：morphology and implications. J Pediatr Surg，1994，29：294-299.5，Hanani M，Louzon V, Udass