干細(xì)胞特性以及培養(yǎng)技術(shù)交流

1、干細(xì)胞1. 干細(xì)胞(stem cell)：干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。 2.干細(xì)胞分類(1)胚胎干細(xì)胞：指胚胎早期的干細(xì)胞。這類干細(xì)胞分化潛能寬，具有分化為機體任何組織細(xì)胞的力量。如囊胚期內(nèi)細(xì)胞團的細(xì)胞。(2)成體干細(xì)胞：指成體各組織器官中的干細(xì)胞，成體干細(xì)胞具有自我更新力量，但分化潛能窄，只能分化為相應(yīng)(或相鄰)組織器官組成的細(xì)胞。如神經(jīng)干細(xì)胞，表皮干細(xì)胞。第一節(jié) 干細(xì)胞生物學(xué) 1. 組織自體穩(wěn)定性：特定組織通過使自身細(xì)胞死亡和增生的方式保持組織細(xì)胞數(shù)量動態(tài)平衡的特征稱組織自穩(wěn)定性。2. 干細(xì)胞是個體發(fā)育和組織再生的基礎(chǔ)。 一、干細(xì)胞的形態(tài)和生化特征 1干細(xì)胞的形態(tài)特征干細(xì)胞形

2、態(tài)共性：細(xì)胞呈圓形或卵圓形，體積小，核質(zhì)比大，增殖力強。干細(xì)胞的固定組織位置：有的干細(xì)胞有固定存在部位與方式。如表皮干細(xì)胞與其四周的子細(xì)胞形成增殖結(jié)構(gòu)單元。但很多組織的干細(xì)胞沒有這種分布特點。2干細(xì)胞的生化特性端粒酶活性高：如造血干細(xì)胞具癌細(xì)胞的端粒酶活性，增殖力量強。隨著增殖與分化，端粒酶活性下降。蛋白標(biāo)志分子：不同干細(xì)胞有各異的蛋白質(zhì)標(biāo)志分子，可作為確定干細(xì)胞位置、分別提純干細(xì)胞的標(biāo)志。如：巢素蛋白神經(jīng)干細(xì)胞；角蛋白15表皮干細(xì)胞。 二、干細(xì)胞的增殖特征（一）增殖緩慢性1干細(xì)胞增殖速度慢：細(xì)胞動力學(xué)爭辯表明，干細(xì)胞的增殖速度較慢，組織中快速分裂的細(xì)胞是過渡放大細(xì)胞。如小腸干細(xì)胞的分裂速度(

3、Tc=11小時)比過渡放大細(xì)胞(Tc24小時)慢一倍。2過渡放大細(xì)胞：過渡放大細(xì)胞是介于干細(xì)胞和分化細(xì)胞之間的過渡細(xì)胞，過渡放大細(xì)胞經(jīng)若干次分裂產(chǎn)生分化細(xì)胞。通過這種方式，機體可用較少干細(xì)胞獲得較多分化細(xì)胞。3干細(xì)胞增殖緩慢的意義：(1)利于干細(xì)胞對外界信號作出反應(yīng)，以打算細(xì)胞的進展方向增殖或分化。(2)削減基因突變的危急。增殖緩慢使干細(xì)胞有時間發(fā)覺并訂正處于增殖周期過程中的錯誤。（二）干細(xì)胞的自穩(wěn)定性1自穩(wěn)定性：自穩(wěn)定性是干細(xì)胞的基本特征之一。指干細(xì)胞可在個體生命過程中自我更新并維持其自身數(shù)目恒定。干細(xì)胞的自穩(wěn)定性是區(qū)分腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征。干細(xì)胞通過其特有的分裂方式維持自穩(wěn)定性。2干細(xì)胞的分

4、裂方式干細(xì)胞有對稱與不對稱兩種分裂方式。不對稱分裂的結(jié)果使兩個子細(xì)胞一個成為功能專一的分化細(xì)胞；另一個保持干細(xì)胞的特征。3. 不對稱分裂發(fā)生緣由：系列基因調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)不均等安排。4無脊椎動物通過不對稱分裂維持自穩(wěn)定性。如：果蠅的Insc基因是感官前體細(xì)胞的不對稱分裂的調(diào)控基因之一，通過三個途徑進行調(diào)控：不對稱安排質(zhì)膜上的細(xì)胞定向打算因子。不對稱安排細(xì)胞內(nèi)的mRNA。打算細(xì)胞分裂時紡錘體的取向。5哺乳動物的種群不對稱分裂。(1)種群不對稱分裂：哺乳動物有幾種不同的干細(xì)胞群，分裂后產(chǎn)生不同細(xì)胞。(2)哺乳動物種群不對稱分裂的意義：使機體對干細(xì)胞的調(diào)控更機敏，以適應(yīng)機體的生理變化。要求機體對干細(xì)

5、胞分裂的調(diào)控更精確，以保持干細(xì)胞數(shù)目恒定。如：正常腸腺有250個細(xì)胞組成，假如額外多一個干細(xì)胞，則可能多產(chǎn)生64128個子代細(xì)胞。 (3)哺乳動物種群不對稱分裂的調(diào)控。哺乳動物通過多層次多角度調(diào)控，保持自穩(wěn)定性。正調(diào)控：促進與細(xì)胞增殖、生存有關(guān)的基因表達(dá)。負(fù)調(diào)控：促進與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因表達(dá)。如轉(zhuǎn)基因小鼠長期造血干細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2后，使長期造血干細(xì)胞的數(shù)目顯著增加。說明細(xì)胞凋亡也是干細(xì)胞的調(diào)控方式。 三、干細(xì)胞的分化特征 （一）干細(xì)胞的分化潛能 依據(jù)其分化潛能大小，干細(xì)胞可分為三類。1全能性干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)：具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞(ES)具有很強的分化力量，可無限增殖

6、并分化為全身200多種細(xì)胞類型，及機體的各種組織、器官。 (圖 全能干細(xì)胞)2多能性干細(xì)胞：多能干細(xì)胞具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的力量。如骨髓多能造血干細(xì)胞，它可分化出至少十二種血細(xì)胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細(xì)胞。 (圖 多能干細(xì)胞)3專能性干細(xì)胞(成體干細(xì)胞)：專能干細(xì)胞(也稱單能、偏能干細(xì)胞)，這類干細(xì)胞只能向一種類型或親密相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。如上皮組織基底層的干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)。(圖，表皮干細(xì)胞)(二)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和去分化 1干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化：一種組織類型的干細(xì)胞在適當(dāng)條件下分化為另一種組織類型的細(xì)胞的過程稱干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。試驗：

7、C57BL/6J成年小鼠 造血干細(xì)胞 WBB6F/J-KitW/KitW-V鼠(亞致死劑量同位素照射) 在鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中檢測到Y(jié)染色體.即鼠的造血干細(xì)胞移植到鼠中分化為腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。2干細(xì)胞去分化：一種干細(xì)胞向其前體細(xì)胞的逆向轉(zhuǎn)化稱干細(xì)胞去分化。試驗：成體鼠造血干細(xì)胞 鼠卵泡的內(nèi)細(xì)胞團 表達(dá)胎鼠的珠蛋白基因參與胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育。 3. 干細(xì)胞的可塑性(1)干細(xì)胞的橫向分化：在干細(xì)胞移植時，供體干細(xì)胞在受體中通常分化為與其組織來源全都的細(xì)胞。但有時供體干細(xì)胞會分化出與其組織來源不全都的其它細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱干細(xì)胞橫向分化(trans-differentiation)。干細(xì)胞橫向分化表明成體

8、干細(xì)胞被移植入受體中具有很強的可塑性。為干細(xì)胞治療供應(yīng)了可能。(2)試驗：小鼠肌肉干細(xì)胞體外培育5天少量骨髓間質(zhì)細(xì)胞 接受致死量輻射的小鼠中 各種血細(xì)胞系。(3)橫向分化的調(diào)控機制：與干細(xì)胞的微環(huán)境有關(guān)。干細(xì)胞進入新的微環(huán)境后，對分化信號的反應(yīng)受到四周正在進行分化細(xì)胞的影響，從而對新的微環(huán)境中的調(diào)整信號做出反應(yīng)。四、干細(xì)胞增殖與分化的微環(huán)境 干細(xì)胞巢(stem cell nich)：干細(xì)胞在組織中的居所。干細(xì)胞生存的微環(huán)境：指干細(xì)胞巢中把握干細(xì)胞增殖與分化的外部信號。如：這些物質(zhì)可以介導(dǎo)干細(xì)胞-干細(xì)胞的相互作用，以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的作用，影響干細(xì)胞的增殖和分化。（一）分泌因子 分泌因子是由細(xì)

9、胞自分泌或旁分泌的生長因子，有的分泌因子對維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活具有調(diào)整作用。如轉(zhuǎn)化生長因子-和Wnt家族的成員，在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用。 1轉(zhuǎn)化生長因子TGF(transforming growth factor)是TGF超家族的成員之一，具有調(diào)整細(xì)胞生長和分化的作用。由于TGF能使正常成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，即在EGF同時存在時，轉(zhuǎn)變成纖維細(xì)胞貼壁生長特性而獲得在瓊脂中生長的力量，并失去密度依靠的抑制作用，故命名。TGF的作用：TGF-對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)整作用。一般對間充質(zhì)起源的細(xì)胞起刺激作用，而對上皮或神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞起抑制作用。 如TG

10、F-家族成員Dpp可維持果蠅雌性生殖干細(xì)胞的增殖。2Wnt家族的分泌信號分子(1)Wnt基因：Wnt基因最初是在小鼠乳腺癌克隆出來的原癌基因，因病毒基因在其旁邊插入可激活該基因，稱為Int基因，后發(fā)覺其與果蠅的無翅基因(Wingless,wg)高度同源，故合稱為Wnt基因。(2)Wnt信號分子： 是Wnt基因編碼的長度為350400個氨基酸的分泌型糖蛋白。它與細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)有聯(lián)系，在小范圍內(nèi)(幾個細(xì)胞直徑)起信使的作用。 (3)Wnt信號途徑：是由Wnt參與的將信號由細(xì)胞表面?zhèn)髦良?xì)胞核內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑。主要包括Wnt信號蛋白，跨膜受體(Frizzled)，輔受體LRP(低密度脂蛋白受體有

11、關(guān)的跨膜蛋白)、Dishevelled、糖原合成酶激酶3(GSK3)、APC、Axin、-連環(huán)蛋白及T細(xì)胞因子/淋巴結(jié)增加因子(TCF/LEF)家族轉(zhuǎn)錄調(diào)整因子等。(4)Wnt信號途徑的作用：在生物的正常發(fā)育中起重要作用，是組織發(fā)育、分化所必需的關(guān)鍵信號通路。(5)Wnt信號途徑的作用機理：通過TCF/LEF和-cat對C-myc的表達(dá)進行調(diào)控，即Wnt通路的靶基由于c-myc。TCF/LEF是Wnt信號通路的中間介質(zhì)，可與-連環(huán)蛋白(-catenin，-cat)結(jié)合成復(fù)合物，將-catenin由胞漿核內(nèi)。-cat是Wnt信號通路中最重要的信號分子。-cat具有兩種功能：細(xì)胞粘附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其

12、C-端參入信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，N-端參入細(xì)胞粘附。正常狀況下，APC、GSK-3、Axin等調(diào)整下，胞漿內(nèi)-catenin處于平衡狀態(tài)；當(dāng)Wnt因子與其受體結(jié)合，Wnt信號傳導(dǎo)使GSK3被抑制，使-catenin不能正常水解而積累，過量的-catenin與Lef/Tcf結(jié)合并入核，與DNA結(jié)合蛋白Tcf3結(jié)合，激活c-myc、cyclinD1等基因轉(zhuǎn)錄，促進細(xì)胞增殖分化。如Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子家族對上皮干細(xì)胞的分化：Tcf/Lef與-Catenin形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后，促使角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)并分化為毛囊。（二）受體介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用 假如蠅的Notch基因產(chǎn)物Notch受體。 Notch的配體為

13、Delta基因產(chǎn)物，兩者均為細(xì)胞表面跨膜蛋白。兩者結(jié)合后在果蠅剛毛器的發(fā)育中起調(diào)整作用的蛋白質(zhì)。 (圖，果蠅剛毛)Notch受體果蠅的每個剛毛器由一個神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育成，而神經(jīng)前體細(xì)胞又是從含多個神經(jīng)原細(xì)胞的細(xì)胞群分化出來的，這種有選擇地發(fā)育過程，依靠于Notch和Delta的基因調(diào)整。Notch與其配體Delta結(jié)合后，通過細(xì)胞間相互作用，向細(xì)胞核傳遞抑制信號，對相鄰細(xì)胞側(cè)向抑制，只使某個神經(jīng)原細(xì)胞獲得較強的競爭力量，被選擇發(fā)育為神經(jīng)前體細(xì)胞。即當(dāng)Notch與其配體結(jié)合時，干細(xì)胞進行非分化性增殖；當(dāng)Notch活性被抑制時，干細(xì)胞進入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞。(三) 胞間基質(zhì)和整合素1.胞間基

14、質(zhì)：即細(xì)胞外基質(zhì)，指分布于細(xì)胞外空間，由細(xì)胞分泌蛋白和多糖構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。2.作用：細(xì)胞外基質(zhì)可以將細(xì)胞粘連在一起，同時還供應(yīng)一個細(xì)胞外網(wǎng)架維持組織結(jié)構(gòu)，通過結(jié)合與傳遞信號分子對細(xì)胞存活、增殖、分化、遷移等具有重要影響。3.細(xì)胞外基質(zhì)的種類：(1) 膠原膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要框架結(jié)構(gòu)。目前發(fā)覺的膠原至少19種。每種膠原的結(jié)構(gòu)特性均與其特定功能相適應(yīng)?？尚纬赡z原纖維(、型)、三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(型)的片層膠原。膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分之一，并與細(xì)胞基質(zhì)中的其它成分一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一體。為干細(xì)胞生存及生命活動供應(yīng)微環(huán)境。(2) 層粘連蛋白(laminin，LN)層粘連蛋白是基膜的主要功能成分。

15、也是胚胎發(fā)育中消滅最早的細(xì)胞基質(zhì)成分。在成體，它存在于上皮下和內(nèi)皮下緊靠細(xì)胞的基底，以及肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞四周等。層粘連蛋白的功能：作為基膜的主要結(jié)構(gòu)成分，促進基膜組裝，介導(dǎo)細(xì)胞粘著膠原進而鋪展，促進生長增殖；誘導(dǎo)細(xì)胞分化，是個體發(fā)生中消滅最早的細(xì)胞基質(zhì)。如成肌細(xì)胞分化為肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞分化為腎細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。(3)纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)纖粘連蛋白分血漿FN和細(xì)胞FN。血漿FN存在于血漿及各種體液中；細(xì)胞FN存在于細(xì)胞外基質(zhì)(包括某些基膜)及細(xì)胞表面。細(xì)胞FN為多聚體，有20種以上。是同一基因的編碼產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄后由于RNA拼接不同形成多種異型分子，拼接方式依細(xì)胞類型及發(fā)育狀態(tài)

16、而定，從而使細(xì)胞產(chǎn)生適合組織需要的FN形式。即細(xì)胞通過把握FN RNA的拼接方式，使其與不同細(xì)胞結(jié)合及產(chǎn)生特異效應(yīng)。FN的功能：主要是介導(dǎo)細(xì)胞粘著，以此調(diào)整細(xì)胞外形和細(xì)胞骨架的組裝，促進細(xì)胞鋪展、遷移，并可通過遷移途徑打算細(xì)胞的分化方向。如沿富含F(xiàn)N途徑遷移的神經(jīng)脊細(xì)胞最終分化為腎上素能神經(jīng)元，形成神經(jīng)節(jié)。4.整合素(1)是一種通過識別并結(jié)合相鄰細(xì)胞的粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用的受體蛋白質(zhì)。屬于細(xì)胞粘連分子。(2)整合素對干細(xì)胞的作用：是促進干細(xì)胞的非分化增殖。(3) 作用機理：作為細(xì)胞外基質(zhì)的受體，與配體結(jié)合后，啟動胞內(nèi)信號傳遞的連鎖反應(yīng)，最終影

17、響基因表達(dá)，為促進干細(xì)胞的非分化增殖供應(yīng)微環(huán)境。將干細(xì)胞置于組織中的正確位置，使干細(xì)胞維持非分化性增殖。整合素是由和兩個亞單位形成異二聚體。已發(fā)覺有16種和9種亞單位，可組合成20余種整合素。與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合的整合素主要以1與9種亞單位分別構(gòu)成的異二聚體。如當(dāng)1丟失功能時，上皮干細(xì)胞脫離微環(huán)境制約，分化成角質(zhì)細(xì)胞。即細(xì)胞外基質(zhì)通過調(diào)整1整合素的表達(dá)和激活，影響干細(xì)胞的分布和分化方向。(4)整合素對干細(xì)胞的影響作用過程：需2步：一是整合素活化；二是活化的整合素作用于干細(xì)胞。整合素活化：整合素通常不與配體結(jié)合，需要經(jīng)過活化?；罨蛩厥峭獠啃盘柕拇碳?，活化過程為胞內(nèi)信號外傳過程。整合素對細(xì)胞的作

18、用：作用過程為胞外信號內(nèi)傳：整合素活化后與配體(如纖粘連蛋白)結(jié)合 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。如粘著斑蛋白與骨架系統(tǒng)的組裝，激酶磷酸化等，使細(xì)胞發(fā)生分泌、增殖、分化、遷移等。 活化的整合素又可失活，使粘附的細(xì)胞彼此脫離。即整合素通過與細(xì)胞外基質(zhì)的弱結(jié)合，使細(xì)胞在不脫離粘附的狀況下依據(jù)微環(huán)境，通過可逆性的結(jié)合與解離進行細(xì)胞遷移。其次節(jié) 胚胎干細(xì)胞 1胚胎干細(xì)胞：從囊胚期(受精后57天)胚胎分別到的干細(xì)胞稱胚胎干細(xì)胞。2胚胎干細(xì)胞的特性：為全能性干細(xì)胞。有如下特性：3胚胎干細(xì)胞的爭辯價值：是發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)爭辯的抱負(fù)模型和有效工具。(圖，胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用) 一、人胚胎干細(xì)胞的獲得要爭辯胚胎干細(xì)胞，首先要獲

19、得胚胎干 細(xì)胞。(一)獲得途徑：主要有：1從早期胚胎獲得美國Thompson爭辯小組是從囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團中獲得胚胎干細(xì)胞 ：體外受精卵 囊胚期 去除滋養(yǎng)層內(nèi)細(xì)胞團 得5株干細(xì)胞系 32代(8個月)保持未分化狀態(tài) 。2從原始生殖細(xì)胞獲得gearhart小組：流產(chǎn)胎兒性腺嵴 原始生殖細(xì)胞 獲得5個多能干細(xì)胞系 7個月不分化 。(圖，干細(xì)胞獲得)思路：原始生殖細(xì)胞是未分化細(xì)胞。 3體細(xì)胞移植分化細(xì)胞核(乳腺、皮膚細(xì)胞) 去核卵細(xì)胞雜合細(xì)胞 發(fā)育成囊胚 胚胎干細(xì)胞 成體(如多利羊)。 (圖，體細(xì)胞獲得干細(xì)胞) 二、胚胎干細(xì)胞的主要特征 （一）形態(tài)和生化特征 1.形態(tài)：細(xì)胞體積小，核大，1多個核仁。

20、離體培育可產(chǎn)生密集的多細(xì)胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干細(xì)胞物理特性：如干細(xì)胞對Hoechst33324和Rhodamine 123染料不著色。 4. 干細(xì)胞表面免疫原性：一般表達(dá)胚胎早期的表面抗原，而且有種屬差異。如小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá)胚胎階段性特異抗原-1(SSEA-1)，不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干細(xì)胞表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。(二)干細(xì)胞的分別與純化1. 借助細(xì)胞的生化特征及物理特性，接受熒光細(xì)胞分別器從單細(xì)胞懸液中即可分別純化干細(xì)胞。2. 干細(xì)胞的理化特征與其分化調(diào)控有關(guān)，如上皮干細(xì)胞高表達(dá)1整合素，介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附，抑制干細(xì)胞分化。(三)干細(xì)胞

21、的體外培育由于干細(xì)胞數(shù)目少，應(yīng)用時需先在體外進行非分化性增殖，再進行誘導(dǎo)分化。不同組織來源的干細(xì)胞的培育條件不盡相同。1· 培育條件：需要很多生長因子和間質(zhì)細(xì)胞的共培育。如Brustle等在體外培育了鼠的ES細(xì)胞。分別ES細(xì)胞 培育 培育 生長增殖 保持分化潛能。 停止供應(yīng)生長因子，ES細(xì)胞分化為寡樹突細(xì)胞或星狀細(xì)胞。2· 分化誘導(dǎo)在應(yīng)用前還需依據(jù)靶組織類型對培育干細(xì)胞進行定向分化誘導(dǎo)。分化誘導(dǎo)需了解：干細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的信號調(diào)整；干細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境。（四）胚胎干細(xì)胞的分化潛能 胚胎干細(xì)胞是全能(多能)性干細(xì)胞，具有分化為各種組織細(xì)胞的潛能。試驗1：移植試驗人胚胎干細(xì)胞 小鼠體

22、內(nèi) 畸胎瘤(良性)有三個胚層產(chǎn)生的組織：三、胚胎干細(xì)胞爭辯的倫理挑戰(zhàn) 胚胎干細(xì)胞爭辯在倫理、道德和宗教方面遇到很大的障礙。避孕、流產(chǎn)和體外授精在西方國家引起很大爭議。 (一)存在的問題 1. 胚胎干細(xì)胞的來源是否符合法律與道德？2.胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用是否會引起倫理及法律問題？3.該項爭辯是否會導(dǎo)致人流泛濫？或?qū)е箩t(yī)生刻意造成胚胎流產(chǎn)？4.如何看待克隆人的爭辯？ （二）反對人的觀點 1.認(rèn)為胚胎干細(xì)胞爭辯破壞人類生命，其觀念基于人類生命起始于早期胚胎。2.天主教派極力反對胚胎干細(xì)胞爭辯，認(rèn)為用人類胚胎干細(xì)胞進行爭辯是一種“邪惡”。 (三)支持者的觀點 科學(xué)界和病人組織猛烈呼吁政府支持這項爭辯。20

23、01年4月，James Watson博士(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)創(chuàng)造人、冷泉港試驗室主任)提倡發(fā)起了由80位諾貝爾獎獲得者參與的簽名運動，呼吁政府支持干細(xì)胞爭辯。 (四)西方政府的態(tài)度 1美國總統(tǒng)布什(1)當(dāng)選總統(tǒng)前反對，當(dāng)選后出于政治目的，同意政府有限支持。2001年8月9日，布什作出打算，美國政府資助對2001年8月9日前得到的人體胚胎干細(xì)胞爭辯，但不支持從新的胚胎中獵取干細(xì)胞的爭辯。(2)同時，布什提出成立一個由科學(xué)家、醫(yī)生、倫理學(xué)家、律師、神學(xué)家等組成的總統(tǒng)生物倫理專家委員會，指導(dǎo)干細(xì)胞的爭辯和管理。由芝加哥高校生物倫理學(xué)教授Leon Kass擔(dān)當(dāng)主席。2美國國立衛(wèi)生爭辯院(NIH)(1)美

24、國國立衛(wèi)生爭辯院是美國聯(lián)邦政府支持干細(xì)胞爭辯的主要機構(gòu)。(2)NIH的年度經(jīng)費為204億美元，2000年投入干細(xì)胞爭辯2.26億美元，其中用于人體成年干細(xì)胞爭辯為1.41億美元。(3)依據(jù)布什的打算，NIH對現(xiàn)存人體胚胎干細(xì)胞系進行登記，認(rèn)定世界上有64個人體胚胎干細(xì)胞系符合聯(lián)邦政府資助的標(biāo)準(zhǔn)。(4)64個人體胚胎干細(xì)胞系分布在6個國家的10個機構(gòu)中：瑞典24個，美國20個，印度10個，澳大利亞6個，以色列4個。NIH試圖用這些人體胚胎干細(xì)胞系完成有關(guān)人體胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)爭辯工作。3其他國家的態(tài)度(1)德國禁止利用人體胚胎干細(xì)胞進行爭辯。(2)澳大利亞開頭仿效美國的作法，有限支持人體胚胎干細(xì)胞

25、的爭辯。(3)法國、英國、日本允許利用多余的胚胎和SCNT技術(shù)制造的胚胎進行干細(xì)胞爭辯。第三節(jié) 精原干細(xì)胞 精原干細(xì)胞來自原始生殖細(xì)胞。胚胎外胚層 原始生殖細(xì)胞 雙側(cè)生殖腺嵴 生精索( 曲細(xì)精管) 生精母細(xì)胞(精原干細(xì)胞的前體細(xì)胞) 成體精原干細(xì)胞 一、精原細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞的再生 1精原細(xì)胞的形態(tài)特征：精原細(xì)胞緊貼于曲細(xì)精管的基膜，圓形或卵圓形，12m，核大，除核糖體外其它細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。 2精原細(xì)胞的增殖與類型：精原細(xì)胞分為A型和B型。A型：常染色質(zhì)豐富，核仁常靠近核膜，依據(jù)在曲細(xì)精管局部的排列特征，又分為Asingle、Apaired和Aaligned三種類型。B型：分化型精原細(xì)胞。 其中

26、Apr型即是進入精子分化的第一步。A1型標(biāo)志精原細(xì)胞開頭定向分化。B型標(biāo)志精子開頭形成。 二、精原細(xì)胞的分化及其把握 1分化Aal型精原細(xì)胞 A1型 精子A1型精原細(xì)胞是精子形成的不行逆的調(diào)控點。機體對這一調(diào)控點有相當(dāng)嚴(yán)格的把握。 2分化把握 (1)精原細(xì)胞分化抑制的影響因素：動物模型爭辯表明，精子發(fā)生存在可逆性抑制，使A1型精原細(xì)胞不分化而增殖。其影響因素如sertoli細(xì)胞的中毒、輻射損傷、維生素缺乏甚至睪丸溫度上升等。(1) 細(xì)胞毒性藥物致分化抑制sertoli細(xì)胞毒性藥物2，5-己二酮 小鼠A1型精原細(xì)胞不能分化。用促性腺激素釋放激素的感動劑治療后，藥物導(dǎo)致的分化抑制得以緩解。說明激素

27、水平可以調(diào)整生殖細(xì)胞的分化。 (2) Kit受體的作用Kit受體：即干細(xì)胞生長因子受體。屬于生長因子受體類的原癌基因產(chǎn)物。作用：原始生殖細(xì)胞表達(dá)Kit受體，sertoli細(xì)胞分泌干細(xì)胞因子(SCF)。SCF通過與Kit受體結(jié)合促進細(xì)胞增殖。干細(xì)胞因子：有兩種形式在已二酮(hexanedione)導(dǎo)致精子發(fā)生衰退的大鼠中，sertoli細(xì)胞表達(dá)可溶性因子，經(jīng)激素治療后，膜包被型數(shù)量增加。表明Kit-SCF在精原細(xì)胞分化中的作用。 (3) VitA的作用VitA缺乏精細(xì)胞退化，補充VitA或維甲酸分化重新開頭推想：A型精原細(xì)胞中有維甲酸的核內(nèi)受體，因此維甲酸對A型精原細(xì)胞有作用，但這種作用依靠se

28、rtoli細(xì)胞。 三、精原細(xì)胞的凋亡 精子發(fā)生過程中通過細(xì)胞凋亡調(diào)整分化型精原細(xì)胞的密度。分化型精原細(xì)胞在曲細(xì)精管不同部位差別很大，但原始生殖母細(xì)胞密度變化很小，是由于分化型的精原細(xì)胞在不同部位選擇性地凋亡。精子發(fā)生過程中的凋亡相關(guān)基因 （一）Bcl-2家族 1. bcl-2基因bcl-2基因：是1985年發(fā)覺的一個原癌基因，與Ced基因有23%同源性。Bcl-2蛋白：bcl-2基因編碼26kd的膜蛋白，存在于線粒體、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。生理功能主要是阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，對細(xì)胞增殖率和分化不產(chǎn)生影響。2. Bcl-2 家族(1)Bcl-2 家族：Bcl-2家族包括Bcl-2結(jié)合蛋白和Bc

29、l-2同源蛋白，它們在結(jié)構(gòu)上有同源性，共同具有2個保守區(qū)域：即Bcl-2同源區(qū)BH1和BH2區(qū)段，功能相關(guān)，即誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡。這些蛋白包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bad、Bad-1以及線蟲的CED-9等。(2) Bcl-2 家族在細(xì)胞內(nèi)存在形式：由于它們的同源結(jié)構(gòu)，可以形成同源二聚體或異源二聚體。如：同源二聚體Bcl-2-Bcl-2；異源二聚體Bcl-2-Bax。 (3)Bcl-2蛋白家族主要成員及生理功能：Bcl-2：抑制細(xì)胞凋亡Bax ：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡bcl-x：通過mRNA不同剪切形成兩種蛋白，Bcl-xl和Bcl-xs。3. Bcl-2抑制凋亡的機制Bcl-2

30、抑制凋亡作用是通過與促凋亡基因Bax形成異源二聚體來實現(xiàn)。(1)Bcl-2、Bax和Bcl-X的凋亡把握系統(tǒng)：Bax同源二聚體Bax-Bax，誘導(dǎo)凋亡；Bcl-2與Bax形成Bcl-2-Bax異源二聚體，結(jié)構(gòu)比Bax-Bax同源二聚體更穩(wěn)定，可“中和” Bax-Bax二聚體誘導(dǎo)凋亡的作用。即細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax的表達(dá)水平調(diào)整細(xì)胞生存或凋亡。當(dāng)Bcl-xs存在時，優(yōu)先與Bcl-2形成異源Bcl-xs-Bcl-2二聚體，而使游離的Bax得以形成同源二聚體，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。此時Bcl-2表達(dá)并不抑制細(xì)胞凋亡。(2)Bcl-2家族蛋白抑制凋亡的分子機理： Bcl-2家族蛋白形成異源二聚體，是依靠其同

31、源結(jié)構(gòu)域BH1和BH2。當(dāng)Bcl-2中BH1和BH2區(qū)域的特定氨基酸被轉(zhuǎn)換后，不能與Bax形成二聚體，而自身形成同源二聚體Bcl-2-Bcl-2，其抑制凋亡的功能丟失。(3)精原細(xì)胞中的Bcl-2家族精原細(xì)胞不存在Bcl-2，但在Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠中，局部高密度誘導(dǎo)的精原細(xì)胞凋亡消逝。說明雖然Bcl-2蛋白本身并不參與，但其家族成員把握著精子發(fā)生過程。即Bax和Bcl-X的表達(dá)和作用平衡把握精原細(xì)胞的密度相關(guān)性調(diào)亡。 睪丸中表達(dá)Bcl-X基因有兩種變異體Bcl-Xs和Bcl-Xl，前者促凋亡，后者抑凋亡。Bax基因是把握精原細(xì)胞凋亡的重要因素。剔除Bax基因小鼠無生育力量，其睪丸組化特征與B

32、cl-2和Bcl-Xl轉(zhuǎn)基因小鼠相像，都表現(xiàn)出精細(xì)胞的聚集。（二）P53蛋白 1P53蛋白是由p53基因編碼的由393個aa構(gòu)成的核磷蛋白。在很多組織中有表達(dá)，特殊是在胸腺、脾、睪丸和卵巢中表達(dá)量很高。p53基因位于17q13。 2p53蛋白的生物學(xué)功能 (1)p53蛋白與細(xì)胞中DNA損傷：DNA損傷嚴(yán)峻p53蛋白表達(dá)水平急劇增加細(xì)胞停止在G1期，等待細(xì)胞對DNA進行修復(fù)。即p53通過監(jiān)視DNA的忠實性和穩(wěn)定性而調(diào)整細(xì)胞增殖，防止腫瘤發(fā)生。(2)p53蛋白與細(xì)胞周期的把握：野生型p53可以阻擋細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞成瘤力量。p53是一個轉(zhuǎn)錄因子類的蛋白，可以促進細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá)。如GADO-4

33、5，mdm-2和p21基因。p53蛋白抑制細(xì)胞分裂的功能很可能與促進p21基因表達(dá)有關(guān)，由于p21蛋白是細(xì)胞周期促進因子CDK的抑制劑。p21蛋白可通過與CDK結(jié)合而抑制CDK的激酶活性，從而使細(xì)胞停止在G1期。即p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過促進p21基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞周期。(3)P53蛋白與癌蛋白的作用：P53蛋白可被癌基因產(chǎn)物結(jié)合而失活。(4)P53蛋白對細(xì)胞凋亡的作用：P53蛋白水平增加可使有些類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機制之一就是當(dāng)細(xì)胞中DNA損傷太嚴(yán)峻時，細(xì)胞自身難以修復(fù)，選擇凋亡以保證器官功能正常。 3P53蛋白與精原細(xì)胞凋亡 (1)p53缺陷型小鼠睪丸中A1型精原細(xì)胞比野生型小鼠多50%

34、。p53缺陷導(dǎo)致A1型精原細(xì)胞多的2種緣由：一是正常p53蛋白參與不分化精原細(xì)胞的周期調(diào)整，二是正常p53蛋白可誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡。 (2)p53缺陷型小鼠細(xì)線期精母細(xì)胞的數(shù)量與野生型小鼠相近，說明p53缺陷型小鼠仍能精確把握精原細(xì)胞分化水平。 第四節(jié) 成體干細(xì)胞 成體組織或器官中，很多細(xì)胞仍具有自我更新及分化產(chǎn)生不同組織細(xì)胞的力量，如血液細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、受損的肝組織細(xì)胞等。這些細(xì)胞即是成體干細(xì)胞. 一、造血干細(xì)胞 造血干細(xì)胞是第一種被生疏的組織特異性細(xì)胞。1961年Till和McCulloch首次通過小鼠脾集落形成試驗證明造血干細(xì)胞在成體內(nèi)的存在。1形態(tài)：一般認(rèn)為造血干細(xì)胞的形態(tài)類似小淋巴細(xì)胞

35、。2細(xì)胞表面標(biāo)志：表面標(biāo)志比較多，臨床上應(yīng)用最多的是CD34。還可與KDR (kinase insert domain recepter)協(xié)作鑒定造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞。試驗：Zieglar用致死劑量照射小鼠后進行細(xì)胞移植試驗。3造血干細(xì)胞的胚胎發(fā)生中胚層細(xì)胞 造血環(huán)境(大動脈、性腺脊、中期腎區(qū)) 胎肝 髓系及淋巴系的前體細(xì)胞 骨髓 4造血干細(xì)胞的調(diào)控(1)維持造血干細(xì)胞的數(shù)目恒定：干細(xì)胞因子(2)影響干細(xì)胞的移行、數(shù)目維持、分化：成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1，F(xiàn)GF-1)、SDF-1、細(xì)胞外基質(zhì)。 二、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC) 1間充質(zhì)干細(xì)胞的位置

36、 間充質(zhì)干細(xì)胞附著于骨髓竇的內(nèi)腔面，形成 一種包埋于竇狀網(wǎng)絡(luò)中的三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。(圖，間充質(zhì)干細(xì)胞) 2MSC的分別與表面標(biāo)志(1)分別：骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上的細(xì)胞，貼壁生長的細(xì)胞中9598%為MSC。依據(jù)細(xì)胞表面抗原獲得MSC。(2)MSC的特異性表面標(biāo)志通過流式細(xì)胞儀分析，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。 3間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為多種間充質(zhì)組織。如骨、關(guān)節(jié)、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基質(zhì)等。來源不同或在不同條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞可分化相應(yīng)組織細(xì)胞。如骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞

37、可分化脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。在含有1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、地塞米松、吲哚美辛的培育基中，95%間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。在含TGF-3的無血清培育基中，間充質(zhì)細(xì)胞會分化為軟骨細(xì)胞。由于間充質(zhì)細(xì)胞在體外可以相對簡潔地誘導(dǎo)出骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，可在骨損傷、先天性骨畸形有治療中有廣泛應(yīng)用。三、神經(jīng)干細(xì)胞 傳統(tǒng)觀點：神經(jīng)細(xì)胞無再生力量。新發(fā)覺：中樞神經(jīng)系統(tǒng)中部分細(xì)胞仍具有自我更新及分化產(chǎn)生成熟腦細(xì)胞的力量，這些細(xì)胞被稱為神經(jīng)干細(xì)胞。 1神經(jīng)干細(xì)胞的存在部位哺乳動物中腦側(cè)室的室管膜下區(qū)包括室管膜的細(xì)胞中存在有增殖力量的干細(xì)胞。成體的下腦室區(qū)、嗅球及海馬區(qū)是神經(jīng)干細(xì)胞存在的部位。1992年Ry

38、nolds和Weiss首先從成體小鼠腦旁側(cè)室膜下的神經(jīng)組織中分別并培育了神經(jīng)干細(xì)胞。Svendsen等用同樣的方法從人的胚胎中分別出神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞持續(xù)分裂每周傳代一次，可維持一年以上。2神經(jīng)干細(xì)胞的生化特性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)巢素蛋白，全部的神經(jīng)干細(xì)胞都巢素蛋白陽性。 巢素蛋白的表達(dá)始于神經(jīng)胚形成期，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞遷移基本完成后，合成開頭下降，神經(jīng)細(xì)胞完成分化，巢素蛋白表達(dá)停止。3神經(jīng)干細(xì)胞的維持與分化(1)促進細(xì)胞增殖的因素：表皮生長因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)，對干細(xì)胞的存活、增殖和分化起重要作用。EGF的主要作用是維持神經(jīng)干細(xì)胞生存； FGF-2主要是以對細(xì)胞分化起

39、作用。(2)促進神經(jīng)干細(xì)胞分化的因素：小牛血清。用小牛血清替代EGF培育神經(jīng)干細(xì)胞，細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突狀細(xì)胞和神經(jīng)元；巢素蛋白漸漸削減，消滅神經(jīng)元特有的微管結(jié)合蛋白2及膠質(zhì)細(xì)胞的特征性神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白。 四、表皮干細(xì)胞1表皮干細(xì)胞的存在部位 (1)表皮干細(xì)胞位于表皮基底層。屬于專能干細(xì)胞。能周期性的進入分化程序，最終分化為角質(zhì)細(xì)胞。(2)表皮增殖單位：位于基底層的干細(xì)胞和分布在它四周的由它分裂形成的子細(xì)胞，共9個，組成一個柱狀細(xì)胞群，稱為一個表皮增殖單位。(3)表皮干細(xì)胞的分化：表皮增殖單位邊緣的子細(xì)胞脫離基底膜后向上遷移經(jīng)過棘細(xì)胞層和顆粒層細(xì)胞，最終形成角質(zhì)化無核細(xì)胞。這層細(xì)

40、胞不斷脫落，由新生的細(xì)胞不斷補充。人體不同部位的皮膚更新速度約24周。在細(xì)胞遷移過程中，角質(zhì)化伴隨著分化過程。2毛囊干細(xì)胞 毛囊組成：由外根鞘、內(nèi)根鞘和發(fā)干組成。毛囊球：包括間充質(zhì)細(xì)胞(團)構(gòu)成的毛乳頭和基質(zhì)細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞：產(chǎn)生內(nèi)根鞘和發(fā)干的活躍分裂細(xì)胞稱為基質(zhì)細(xì)胞。是存在于毛囊球中的一群可分裂的上皮細(xì)胞。毛乳頭中的間充質(zhì)細(xì)胞即是毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞需在毛囊的膨脹部位進行增殖。當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞失去增殖力量時，毛囊退化，拉動毛乳頭細(xì)胞團進入膨脹部位，毛乳頭細(xì)胞團接受信號刺激后，膨脹部位的干細(xì)胞增殖產(chǎn)生新的毛囊。毛囊中的干細(xì)胞同樣可以產(chǎn)生表皮，尤其在外傷或燒傷后能重建表皮毛發(fā)。3表皮干細(xì)胞的生化標(biāo)志 (1)表達(dá)角蛋白5(keratin 5，K5)和K14分子：同角細(xì)胞相同。產(chǎn)生的角蛋白在成熟皮膚細(xì)胞中形成中間網(wǎng)絡(luò)，使表皮細(xì)胞形成一個整體，并具有韌性。表達(dá)整合素：與型膠原和纖維粘合素粘附。以這種方式與基底膜相連。當(dāng)這種粘附力下降時，干細(xì)胞易從干細(xì)胞巢脫落，向表皮分化。干細(xì)胞高表達(dá)整合素和粘附素，在維持干細(xì)胞增殖和存活的信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。毛囊干細(xì)胞的增殖潛能格外大，體外一單獨的毛囊干細(xì)胞在合適的條件下產(chǎn)生的子細(xì)胞數(shù)多達(dá)1.7×1038，大大超過了掩蓋整個成