蛋白提取實(shí)驗(yàn)步驟

1、蛋白提取試驗(yàn)步驟：1、細(xì)胞總蛋白提取A、對(duì)于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞，每106細(xì)胞加250 ul  RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。假如需要提高蛋白濃度，可以適當(dāng)削減細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。B、對(duì)于貼壁細(xì)胞:a、用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。最終一次徹底吸干殘留液。b、加入適當(dāng)體積的 RIPA（使用前數(shù)分內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培育板、瓶?jī)?nèi)3-5分鐘。期間反復(fù)晃動(dòng)培育板、瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。c、用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。C、冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。D、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。2

2、、組織蛋白提?。篈、組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上徹底勻漿。假如需要提高蛋白濃度，可以適量削減該試劑體積。B、將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。C、12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。留意事項(xiàng)1、組織盡可能新穎，若不能準(zhǔn)時(shí)提蛋白，組織標(biāo)本應(yīng)保存在-80冰箱，并避開反復(fù)凍融。2、全程必需在冰上進(jìn)行，避開蛋白降解。3、蛋白酶抑制劑在水溶液中不穩(wěn)定，需在RIPA使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑。4、裂解過(guò)程中如有溶液粘稠現(xiàn)象可用移液器（

3、200l）反復(fù)吹打，或再加入適量裂解液以保證充分裂解。5、總蛋白溶液不穩(wěn)定（蛋白酶照舊有活性）可在-80短時(shí)間保存，建議馬上加入蛋白上樣緩沖液變性后與-20保存，避開反復(fù)精品佳作，安心下載，放心使用凍融。遇到失意難過(guò)事，多想有一個(gè)懂你的人來(lái)教導(dǎo)迷津，因他懂你，會(huì)以我心，換你心，站在你的位置上思慮，為你排優(yōu)解難。一個(gè)人，來(lái)這世間，必需懂得一些人情事理，才能不斷成長(zhǎng)。就像躬耕于隴畝的農(nóng)人，必需懂得土地與種子的情懷，才能有所收獲。一個(gè)女子，一生所求，莫過(guò)于找到一個(gè)懂她的人，執(zhí)手白頭，相伴終老。即使蘆花暖鞋，菊花枕頭，也覺(jué)暖和；即使粗食布衣，陋室簡(jiǎn)靜，也覺(jué)舒適，一句“懂你”,叫人無(wú)怨無(wú)悔，愿以自己的一生來(lái)交付。懂得是彼此的觀賞，是靈魂的輕喚，是惺惺相惜，是愛，是暖，是彼此的溶化；是走一段很遠(yuǎn)的路，驀然回首卻發(fā)覺(jué)，我照舊在你的視線里；是回眸相視一笑的無(wú)言；是一條偏僻幽靜的小路，不顯山，不露水，路邊長(zhǎng)滿你寵愛的花草，靜默無(wú)語(yǔ)卻馨香盈懷，而路的終點(diǎn)，便是通達(dá)你心靈的小屋瑟瑟嚴(yán)冬，窗外雪飄，絮絮自語(yǔ)說(shuō)了這多，你可懂我了嗎？若你知曉，無(wú)需說(shuō)話，只報(bào)一聲心靈的輕嘆，那，便是我的花開春暖。你相不信任，人生有一種念想，不求奢華不求結(jié)果，不求你在我身邊，只