兔IL-6基因真核表達載體的構(gòu)建及其對pcDNA-VP60 DNA疫苗佐劑效應研究.docx

1、-研究論文-兔IL-6基因真核表達載體的構(gòu)建及其對pcDNA-VP60DNA疫苗佐劑效應研究張夏蘭(重慶市巴南區(qū)動物疫病預防控制中心，重慶401320)摘要：為研究兔白介t6(interleukin6.IL-6)真核表達質(zhì)粒(pcDNA.】L4)對核酸疫苗免疫效果的影響，本文構(gòu)建了真核表達質(zhì)pcDNA-IL-6,并將其與核酸疫苗pcDNA-VP60聯(lián)合免疫家兔，以pcDNA-VP60和質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)作對照.用血兼抑制試驗檢測試驗兔體內(nèi)特異性抗體水平。結(jié)果表明：真核重組質(zhì)UpcDNA-IL-6時重組質(zhì)粒pcDNA-VP60均具有免疫增強作用，從免疫后7d到70d,pcDNA-VP

2、60/pcDNA-IL6聯(lián)合免疫組杭體水平均高于pcDNA-VP60免疫組，是異具有顯著統(tǒng)計學意義。關(guān)鍵詞：兔病毒性出血癥；DNA疫苗；佐劑；白細胞介素6中圖分類號：S852.659.1文獻標志碼：A文童編號：1674-6422(2012)05-0012-04ENHANCEMENTOFEUKARYOTICEXPRESSIONPLASMIDpcDNA-IL-6ONIMMUNERESPONSEOFDNAVACCINEpcDNA-VP60AGAINSTRABBITHEMORRHAGICDISEASEVIRUSZHANGXia-Ian(ChongqingBananAnimalDiseaseContro

3、lCenter,Chongqing401320,China)Abstract:ToinvestigatetheeffectofeukaryoticexpressionplasmidpcDNA-IL-6ontheimmuneresponseofDNAvaccineagainstRabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV),eukaryoticexpressionplasmidpcDNA-VP60expressingRHDVVP60proteinwereconstructedandinoculatedintorabbitsaloneorsimultaneouslywith

4、pcDNA-IL-6.Hemagglutinationinhibition(HI)testwasusedtodetectRHDVantibodylevel.TheresultsindicatedthatpcDNA-IL-6enhancedtheimmuneresponseofpcDNA-VP60.TheHIantibodylevelinpcDNA-VP60+pcDNA-IL6groupwassignificantlyhigherthanpcDNA-VP60alonegroup(P<0.01)asdetectedfrom7to70dayspostinoculation,theantibod

5、ylevelofgrouppcDNA-VP60+pcDNA-IL6wassignificantlyhigherthangrouppcDNA-VP60andgrouppcDNA3.1(P<0.05orP<0.01)Keywords:Rabbithemorrhagicdisease(RHD);DNAvaccine;adjuvant;interleukin6(IL-6)收稿日期：2012-06-22作者簡介：張夏蘭，女，碩士，獸醫(yī)師，主要從事畜禽傳染病研究和動物疫病預防控制工作白介素6(interleukin6,IL-6)是一種多功能細胞因子，又稱為B細胞分化因子、干擾素J32及肝細胞刺

6、激因子。哺乳動物的白介素6具有廣泛的生物學活性，兒乎能影響免疫系統(tǒng)的所有細胞，在調(diào)節(jié)免疫應答、影響急性期的蛋白應答和造血功能等方面發(fā)揮重要作用，并與其他細胞因子相互協(xié)調(diào)，共同構(gòu)成復雜的細胞因子網(wǎng)絡。研究表明，IL-6具有免疫佐劑效應，能增強免疫應答，但將細胞因子重組蛋白作為免疫佐劑，其主要缺陷是半衰期短，活性易受內(nèi)環(huán)境如PH值、各種水解酶及血漿蛋白的影響"T。有資料顯示，細胞因子基因真核表達質(zhì)粒在機體內(nèi)部可產(chǎn)生與自身機體細胞因子十分相似的生物學活性'7。同時以重組質(zhì)粒表達的細胞因子，即細胞因子分子佐劑，可以克服重組蛋白的缺陷，從而在DNA疫苗這個領(lǐng)域中得到更多的重視和研究。分

7、子佐劑一次少量接種即可在機體內(nèi)長時間低量表達，而且表達產(chǎn)物接近天然構(gòu)象，是體內(nèi)存在的免疫效應因子，對機體無毒副作用。因此，本研究構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-6,并與PCDNA-VP60聯(lián)合免疫試驗兔，分析其對家兔免疫應答的影響。1材料與方法1.1試驗動物農(nóng)戶處購買的1月齡左右的兔病毒性出血癥(rabbithaemorrhagicdisease,RHD)非免疫兔30Ho1.2質(zhì)粒和菌種重組質(zhì)粒pMD18-T-IL-6和真核表達質(zhì)粒pcDNA-VP60系本人構(gòu)建并保存。1.3試劑人“O”型紅細胞由雅安市血站提供；Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；溶菌酶PEG80

8、00、NH4AC、異丙醇、NaOH、胰蛋白腺、酵母抽提物、小牛血清、葡萄糖、醋酸鈉、冰乙酸、氯仿、苯酚、無水乙醇均為分析純。1.4真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-6的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pMD18-T-IL-6轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細菌，37f培養(yǎng)12h后，抽提質(zhì)粒并純化。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶HwdDI和丘ORI雙酶切后，回收IL-6基因，與經(jīng)同樣雙酶切處理的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進行連接。連接體系如下：IL-64.5頭L、pcDNA3.10.5冬、SoltionI5.0aL,加到反應管中，混勻，16P連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細菌，37*t培養(yǎng)12h后，抽提質(zhì)粒。經(jīng)過酶切和PCR鑒定為陽

9、性的重組質(zhì)粒，送寶生物(大連)有限公司進行測序。重組質(zhì)粒命名為pcDNA-IL-6。15質(zhì)粒的大提取及純化用含Amp的LB液態(tài)培養(yǎng)基對含有pcDNA3.1(+)、pcDNA-IL-6和PCDNA-VP60質(zhì)粒的大腸桿菌JM109進行大最培養(yǎng),按照堿裂解法進行質(zhì)粒的大量抽提，并采取PEG(聚乙二醇)沉淀法對質(zhì)粒進行純化。方法均參照文獻9進行。1.6質(zhì)粒的脂質(zhì)體包被質(zhì)粒/脂質(zhì)體復合物的制備，按照文獻10方法進行。分別制備pcDNA3.1/脂質(zhì)體復合物、pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物(兩種質(zhì)粒的比例為3:10)和pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物。1.7動物分組及免疫篩選3

10、0只1月齡非免疫兔，隨機分成3組，分別通過腿部肌肉分點注射。免疫pcDNA3.1/脂質(zhì)體復合物、pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物和pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物,質(zhì)粒免疫劑最為500ng,免疫2次，兩次免疫時間間隔20d。分別于免疫后d7、14、21、28、35、70對各組試驗兔耳靜脈采血，分離血清，檢測特異性免疫抗體。免疫d70后用兔病毒性出血癥病毒(Rabbithaemorrhagicdiseasevirus,RHDV)滴度10'的活病毒進行攻毒，劑量為0.5mL/只，腿部肌肉注射。攻毒后觀察1周內(nèi)試驗兔的發(fā)病、死亡情況，計算攻毒保護率。1.8特異性抗體

11、的檢測及分析采用血凝抑制(HI)試驗(GBm496.54-2(X)8):取“V”型96孔微量反應板1塊，用微量吸液器每孔加生理鹽水2SHL,隨后取待測兔血清25nL,從第1排1孔開始,依次倍比稀釋至第1排最后1孔，棄掉2SjiLo將兔病毒性出血癥血凝抗原稀釋成4單位，每孔加4單位兔病毒性出血癥血凝抗原25|iL,放震蕩器上混勻，置濕盒內(nèi)，37X：作用10min后，每孔加1%人。型血紅細胞25jiL,再放微量震蕩器上混勻，置濕盒內(nèi)，37P作用30min后觀察結(jié)果，以能完全抑制紅細胞凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為血清的血凝抑制價。同時設陰陽性對照。應用SPSS11.0按方差分析法對同一時間段不同組別、

12、不同時間段同一組織試驗兔的血清特異性抗體含量進行統(tǒng)計學處理。2結(jié)果2.1真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-6構(gòu)建結(jié)果通過質(zhì)粒PCR、HindHI和EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果表明，1L-6基因成功克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+沖。測序結(jié)果顯示克隆到pcDNA3(+)上的基因大小為726bp,與目的基因大小一致(圖1);且插入的基因序列與目的基因片段，完全吻合，即IL-6基因按照正確的閱讀框架插入到PCDNA3.1(+)質(zhì)粒中，pcDNA-IL-6真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2特異性抗體檢測結(jié)果pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物和pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物免疫試驗兔之

13、后，均產(chǎn)生了不同程度的特異性抗體。2000750Ml123M2bp726f圖1pcDNA-IL-6雙酶切及PCR鑒定結(jié)果Fig.lIdentificationofpcDNA-IL-6digestedbyrestrictionenzymeandPCRresult1:pcDNA-IL-6雙酶切產(chǎn)物；2,3：PCR結(jié)果；Ml:DNA分子量標準(DL2000);M2:DNA分子量標準(DL15000)1:pcDNA-IL-6digestedbyrestrictionenzymeHindHIandEcoRI;2,3:PCRresult;Ml:DNAMarker(DL2000);M2:DNAMarker(

14、DL15000)各實驗組與對照組相比,均具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。其中，pcDNA-lL-6/pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物免疫組產(chǎn)生的抗體水平高于免疫pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物組。首免后特異性抗體逐步上升,免疫d28,pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物誘導抗體達到峰值水平，而pcDNA-VP60/脂質(zhì)體復合物在免疫后d3S,其抗體水平才達到峰值（表1）。2.3pcDNAIL-6的免疫佐劑效應真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-6對pcDNA-VP60的佐劑效應在二免后1周表現(xiàn)出來，免疫后第28、35、70d,pcDNA-VP60DNA+pcDNA

15、-IL-6免疫誘導產(chǎn)生的抗體水平高于pcDNA-VP60DNA免疫誘導產(chǎn)生的抗體水平（圖2）,差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。2.4攻毒試驗結(jié)果攻毒dl,對照組有實驗兔死亡，d2未注射pcDNA-IL-6真核質(zhì)粒組的實驗兔開始死亡,d4之后無實驗兔死亡（表3）。對病死兔進行制檢,其病理變化表現(xiàn)為:氣管和支氣管黏膜充血肝腫大,呈黃褐色，質(zhì)脆；脾臟腫大，呈黑紫色；腎呈暗紅色,2086420n1i-堪金岑表1特異性抗體檢測結(jié)果TabletAntibodyresponsesinducedbydifferentmethods組別（Group）Od7d14d21d28d35d70dpcDNA

16、3.10.60±0.540.80±0.440.60±0.540.60±0.540.60±0.540.60±0.540.60±0.54pcDNA-VP600.80±0.833.60±0.545.8()±0.838.00±1.009.00±1.0010.40±0.5410.40±0.54pcDNA-IL-6/pcDNA-VP600.80±0.833.80±0.838.00±1.009.40±0.5411.60±

17、0.5411.60±0.8911.80±1.09圖2pcDNA3.1,pcDNA-VP60和pcDNA-IL-6/pcDNA-VP60免疫后兔血清抗體變化曲線Fig.2HIantibodytitercurveinrabbitsimmunizedwithpcDNA3.1,pcDNA-VP60andpcDNA-IL-6/pcDNA-VP60表3攻毒保護試驗統(tǒng)計結(jié)果Table3TheresultofprotectivetestagainstRHDVinrabbits蛆別Group試驗免數(shù)（只）No.oftotalrabbits病死兔數(shù)（只）No.ofdeadrabbits保護率（

18、%）ProtectionratepcDNA3.110100pcDNA-VP6010460%pcDNA-IL-6/pcDNA-VP6（）100100%被膜下和切面有大量出血點；肺表面有大小不等的出血塊，嚴重者甚至整葉肺出血；膀胱內(nèi)有黃褐色較濃稠的尿液；淋巴結(jié)腫大。3討論中國國內(nèi)至今還沒有成熟的RHDV抗體ELISA檢測試劑盒，血凝抑制試驗是比較傳統(tǒng)的一種血清抗體檢測方法，因其操作簡單、穩(wěn)定性好，在RHDV抗體的檢測上得以廣泛應用，故本研究選擇血凝抑制試驗(GB仃1496.54-2008)作為試驗兔血清抗體檢測方法。本研究用pcDNA-IL-6與pcDNA-VP60聯(lián)合免疫實驗兔，對免疫后各實驗組

19、抗體動態(tài)變化的分析發(fā)現(xiàn)，pcDNA-IL-6在疫苗誘導免疫應答的過程中都表現(xiàn)出了明顯的佐劑效應。抗體水平變化的總體趨勢是：從免疫后7d到70d,pcDNA-IL-6+pcDNA-VP60DNA疫苗誘導產(chǎn)生的抗體滴度顯著高于pcDNA-VP60DNA疫苗，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義(PvO.Ol)o免疫后70d,pcDNA-VP60DNA+pcDNA-IL-6免疫組抗體水平?jīng)]有降低，pcDNA-VP60核酸疫苗免疫組的抗體水平明顯下降，此時前者比后者抗體水平高出4倍以上，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義(PvO.Ol)o試驗結(jié)果表明pcDNA-IL-6與疫苗聯(lián)合免疫時可促進機體產(chǎn)生快速持久的免疫應答，pc

20、DNA-IL-6對pcDNA-VP60DNA疫苗免疫具有明顯免疫佐劑效應。攻毒試驗結(jié)果表明，攻毒保護率與機體的抗體水平基本一致?？贵w水平高的實驗兔的保護率也高，相反產(chǎn)生抗體水平低的實驗組兔在受到強毒攻擊時保護率就低。說明分子佐劑pcDNA-IL-6在增強DNA疫苗的免疫力、抵抗強毒攻擊等方面發(fā)揮重要作用。參考文獻郭斯，金寧一，張應玖.等.共表達HIV-1與IL-6核酸疫苗質(zhì)粒誘導小鼠免疫原性的研究U1.中華徽生物學和免疫學雜志，2002,22(2):174.1 郭斐，陸柔劍，孫朝暉，等.非復制重組痘苗病毒中白細胞介素6的表達及其對重組病毒免疫效果的形響J.中華實驗和臨床病毒學雜志,2002.16(2):136-141.3J龍章富，高榮，孟民杰，等.脂質(zhì)體包裹豬白細胞介素6基因?qū)ωi帶絳蟲抗原基因