SNP開發(fā)驗證的研究方法和技術(shù)路線

1、SNP開發(fā)/驗證的研究方法和技術(shù)路線1分子標(biāo)記：分子標(biāo)記，我想這部分是我們分子標(biāo)記組最核心的任務(wù)。現(xiàn)在，我們沒有任何可用的標(biāo)記檢測我們的定位材料。即使想要驗證已經(jīng)定位的QTLs，我們也需要相對應(yīng)的區(qū)間內(nèi)的分子標(biāo)記，尤其是SNP標(biāo)記。1.1 全基因組SNPAffymetrix芯片：一套完整的全基因組的SNP芯片，相對于Douglas體系，其操作簡單，高通量?？梢灾苯訉Χㄎ蝗后w進行初定位的掃描或是對育種材料的背景進行分析。在國家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用來對玉米材料進行高通量檢測，基因型檢測結(jié)果通常可以用來QTLs初定位，育種材料的群體劃分與純度鑒定以及低密度的關(guān)聯(lián)分析

2、等。在此，我建議我們應(yīng)該開發(fā)一套番茄基因型檢測的芯片。目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720條探針。而Affymetrix公司目前并沒有相應(yīng)的產(chǎn)品。但是通過跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的結(jié)果進行開發(fā)。番茄目前測序結(jié)果顯示其全基因組大小為760Mb，而玉米為2,500Mb，但是他們包括的基因數(shù)目30,000個，整體情況相近。另外，番茄作為自交植物，其LD的衰減值應(yīng)該更大，有效的歷史重組會更少，遺傳多樣性低。因此，綜合考慮，我建議我們可以開發(fā)3k芯片，應(yīng)該可以滿足大多數(shù)研究材料、育種材料的基因型檢測需求。雖然目前下一代測序技術(shù)

3、蓬勃發(fā)展，但是對于用于基因型檢測來講，其數(shù)據(jù)分析與成本相對于芯片都要更復(fù)雜和更高。總之，我們番茄處于剛剛發(fā)展階段，我認(rèn)為就基因型檢測方面，芯片有其很高的應(yīng)用價值。即使像玉米，這樣測序技術(shù)發(fā)展很多年的材料，芯片技術(shù)也在應(yīng)用。1.2全基因組SNPDouglas：當(dāng)用Affymetrix芯片檢測鑒定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）對于優(yōu)良的QTLs或是基因，我們可以直接選擇覆蓋整個區(qū)間的分子標(biāo)記運行Douglas系統(tǒng)進行分子標(biāo)記輔助育種，2）對于需要進一步驗證的QTLs，我們也可以利用Douglas系統(tǒng)只檢測材料覆蓋定位區(qū)間的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法進行全

4、基因檢測（圖1.1）。3）對于一些高信息量，均勻分布在全基因的SNP分子標(biāo)記，可以用來構(gòu)建番茄的指紋圖譜。因此，一套完整能夠與Affymetrix芯片相對應(yīng)的SNP標(biāo)記是必不可少的。圖1.1 QTL區(qū)間上的SNP標(biāo)記分布圖注：藍(lán)色為深入片段，棕色為背景染色體。1.3 Douglas系統(tǒng)下SNP標(biāo)記的開發(fā)通過建立穩(wěn)定、可靠的番茄DNA提取流程與優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，篩選具有一致性、穩(wěn)定性與多態(tài)性SNP分子標(biāo)記引物，從而構(gòu)建番茄全基因組SNP分子標(biāo)記。全基因組的SNP分子標(biāo)記，可以用于番茄QTL定位群體的檢測，分子標(biāo)記輔助育種的選擇以及全基因組選擇的群體基因型的檢測。同時，從中挑選高質(zhì)量，高信息量的

5、分子標(biāo)記用于構(gòu)建一套完成的番茄指紋圖譜，檢測品種一致性。1.3.1 供試材料：22份材料的DNA用作特異性引物篩選，2份水作為NTC（None Template Control），共計24份模板作為SNP引物的初期篩選。以上實驗在Q6儀器上進行。對于篩選獲得的一致性引物，在利用94株番茄自交系與2份水作為模板，進一步在Douglas儀器上驗證。1.3.2 DNA提取：1. 取10mg 植物組織，加入研磨介質(zhì)和400l 裂解液，研磨5min，3000g離心5min。2. 加入裂解液1/3 體積的提取液，旋渦振蕩混勻，冰浴（或置于-20冰箱中）5min，于4，3200g 離心10min，吸取上清3

6、00400l 加入到樣品板中。3. 按照下表在各96 孔板中加入試劑：板號板型板名成分樣品及試劑體積1Microtiter deep well 96plate樣品板（Lysis）樣品反應(yīng)液無水乙醇300400l400l2Microtiter deep well 96plate洗滌板I（W1）PW磁珠800l30l3Microtiter deep well 96plate洗滌板II（W2）80%乙醇磁套800l4KingFisher 96 KF plate洗脫板（Elution）TE1.050100l4. 將各96 孔板按儀器提示順序放入儀器中，運行程序。5. 程序運行結(jié)束后，將DNA 溶液轉(zhuǎn)移

7、PCR 板中并測量濃度（100ng/l），進行后續(xù)實驗或于-20保存待用。1.3.3 分子標(biāo)記命名：分子標(biāo)記全部采用統(tǒng)一的命名規(guī)則，這樣有利于結(jié)果的修改與維護。例如：名稱IDSNP位點正向引物反向引物模板序列SolBeckman-00001-V1Sol00001A/G引物合成：由上海生工公司負(fù)責(zé)引物合成。1.3.4 SNP分子標(biāo)記的開發(fā)：最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片檢測410份自交系與16份番茄品種的基因型。本研究在此基礎(chǔ)上，利用Illumina開發(fā)的7,720條探針序列，選擇其中丟失頻率小于10%，等位基因頻率大于10%的探針序列，獲得3,500條探針序列，作為SNP引物開

8、發(fā)的模板序列（），每條序列的長度為100bp，SNP 上下游各50bp。初期，我們可以從3500條探針中，選取120探針序列作為模板發(fā)展引物，這120條序列要求分布在12條染色體上而且在每條染色體上盡量保證均勻分布。如果實驗成功，我們可以逐步地將剩余的探針序列發(fā)展成為SNP引物。1.3.5正向引物設(shè)計：由于我們需要使用KASP基因分型檢測試劑盒，本試劑盒對正向引物已經(jīng)確定為SNP位點上游20bp（包括SNP位點），同時需要人工加上FAM或是HEX序列（圖1.2）。因此，我們需要單獨設(shè)計反向引物。圖1.2 正向引物設(shè)計反向引物設(shè)計：利用Primer3.0軟件對模板序列進行引物選擇，引物參數(shù)設(shè)定如

9、下：1 引物長度為1825bp；2 GC含量為4060%；3 TM值5862C。如果其上述模板序列不足以滿足引物開發(fā)的需要：我們可以利用剩余4,200條探針，繼續(xù)開發(fā)新的引物。另外，我們還可以利用PCR產(chǎn)物測序的方式獲得gap中序列，尋找新的SNP位點。 PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系需要保證均一化，這樣可以滿足將來在Douglas系統(tǒng)下進行SNP檢測。初期我們會在Q6儀器上進行預(yù)實驗，摸索一致后，再在Douglas系統(tǒng)中進行。Primer Mix反應(yīng)體系：名稱體積（l）FAM-Primer12HEX-Primer12Reverse-Primer30ddH2O46Total100P

10、CR反應(yīng)體系：名稱體積（l）Reaction Mix2.5Primer Mix0.7ddH2O0.8DNA1Total5 PCR反應(yīng)程序：我們的PCR產(chǎn)物應(yīng)該都為100bp，因此我們可以采用統(tǒng)一設(shè)定，保證均一化。采用兩步法進行PCR反應(yīng)，前期篩選引物我們設(shè)計3個復(fù)性梯度：60C、57C以及55C，以便找到最合適的復(fù)性溫度。首先，利用60C的復(fù)性溫度進行篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性460C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個循環(huán)625C 1:30min反應(yīng)完收集熒光如果SNP引物在60C復(fù)性溫度時擴增結(jié)果正常，則保留該引

11、物在60C復(fù)性進行PCR反應(yīng)。如果得到引物擴增效果不好，則降低復(fù)性溫度，利用57C進行復(fù)性。57 C復(fù)性溫度PCR反應(yīng)程序篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性457C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個循環(huán)625C 1:30min反應(yīng)完收集熒光如果SNP引物在57C復(fù)性溫度時擴增結(jié)果正常，則保留該引物在57C復(fù)性進行PCR反應(yīng)。如果得到引物擴增效果不好，則降低復(fù)性溫度，利用55C進行復(fù)性。最終，如果55C復(fù)性溫度時，反應(yīng)結(jié)果不好，則該SNP引物剔除去掉。55C復(fù)性溫度PCR反應(yīng)程序篩選：步驟參數(shù)意義125C 1:30min反應(yīng)

12、前收集熒光294C 10min預(yù)變性394C 15s變性455C 1min復(fù)性，延伸53-4重復(fù)40個循環(huán)625C 1:30min反應(yīng)完收集熒光 SNP分子標(biāo)記準(zhǔn)確性驗證：對于已在21份模板DNA擴增穩(wěn)定的SNP引物，需要進一步在大群體中驗證其穩(wěn)定性、一致性、多態(tài)性。選擇84份番茄自交系或品種的DNA，通過相同的PCR方法，驗證新開發(fā)的SNP分子標(biāo)記。目標(biāo)要求：番茄全基因組SNP標(biāo)記：在番茄的全基因上，我們獲得1200對特異的SNP引物（平均100對/染色體）覆蓋番茄的全基因組。已獲得在12份模板DNA能夠穩(wěn)定擴增的SNP分子標(biāo)記，全部保留。2分子標(biāo)記輔助育種：2.1 ILs群體：如果利用現(xiàn)在

13、群體不再進一步構(gòu)建亞群體，ILs群體（L pennellii漸滲系群體）76個自交系，整個群體數(shù)目較小，不利于定位及QTLs驗證（圖2.1）。但是對于這些材料的滲入片段都已經(jīng)注視清楚，因此我們可以直接比較深入系與M82自交系的表型差異，如果存在顯著性差異，則可以定義為有深入片段引起的表型差異。當(dāng)鑒定結(jié)果與已定位的QTLs信息一致時，我們就認(rèn)為此QTL在區(qū)間內(nèi)。同時我們要檢索此QTL定位時的位置，以此為基礎(chǔ)發(fā)展SNP標(biāo)記，用于以后分子標(biāo)記輔助育種。對于每個QTL的區(qū)間，需要發(fā)展48個SNP標(biāo)記覆蓋其定位區(qū)間（圖1.1），其中，區(qū)間外兩段各一個標(biāo)記，內(nèi)部26個SNP標(biāo)記。這樣可以保證目標(biāo)QTL被完

14、整的應(yīng)用。SNP標(biāo)記的開發(fā)，此時的SNP標(biāo)記只需要在ILs群體的兩個親本中有多態(tài)性就可以應(yīng)用。引物設(shè)計同全基因組SNP引物設(shè)計相同。性狀驗證：對于確定的QTLs，我們需要開發(fā)對應(yīng)的SNP標(biāo)記，利用這些標(biāo)記重新驗證定位結(jié)果：圖2.1 深入系材料的基因型2.2 IBLs群體：IBLs群體本身就是分離群體，因此可以直接用作定位（圖2.2）。如果該群體基因型已經(jīng)被鑒定，我們可以直接利用鑒定的基因型結(jié)合我們自己調(diào)查的表型，獲得QTL初定位的結(jié)果。同時，利用Affymetrix芯片進行全基因組的SNP檢測，然后與表型數(shù)據(jù)相結(jié)合進行分析。然后，需要查看定位的QTL區(qū)間內(nèi)是否存在3 Douglas系統(tǒng)下SNP

15、標(biāo)記，如果滿足分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用，可以直接應(yīng)用。如果QTL區(qū)間內(nèi)的沒有或是過少的SNP標(biāo)記，則需要重新開發(fā)SNP標(biāo)記（標(biāo)記開發(fā)同上）。圖2.2 IBLs群體構(gòu)建2.3性狀調(diào)查：從我的觀點出發(fā)，對于分子育種比較有價值研究的QTL，應(yīng)為育種家需求的性狀所對應(yīng)的QTL。我認(rèn)為我們需要跟番茄育種家合作并討論育種需求與育種目標(biāo)。鑒于目前ILs群體定位情況（表1，表2），我認(rèn)為我們可以從中選擇一些我們能夠鑒定測量的性狀進行研究，例如：糖分，可溶性固形物的含量，果實形狀與大小等?？傊覀円軌驕y量這些性狀。同時，對于需要研究性狀，我們需要對其進行界定，比如果實大小，我們需要測量成熟后幾天的果實，作為統(tǒng)一

16、的判定。以保證性狀測量的準(zhǔn)確性。為了能夠獲得準(zhǔn)確的田間試驗數(shù)據(jù)，應(yīng)該采用良好的田間試驗設(shè)計。在此，建議：現(xiàn)有的兩個群體材料都為永久性群體，一般可以采用隨機區(qū)組或是裂區(qū)設(shè)計，每個系23個重復(fù)，鑒定表型。因此我認(rèn)為我們應(yīng)該進行田間實驗設(shè)計，保證表型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。3 SNP指紋圖譜構(gòu)建：通過已經(jīng)獲得的全基因SNP分子標(biāo)記，進一步可以從中挑選出穩(wěn)定、一致的48對SNP分子標(biāo)記構(gòu)建番茄的指紋圖譜。挑選參數(shù)為：3.1 等位基因頻率（Allele Frequency）在一個二倍體的某特定基因座上某一個等位基因占該基因座上等位基因總數(shù)的比率，是群體遺傳結(jié)構(gòu)的一個最基本的尺度，該基因座上所有等位基因的頻率之和為1，對于SNP分子標(biāo)記，一般只包括兩種等位基因。因此，其等位基因頻率在0.5時為最適宜值。3.2 多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：多態(tài)信息量(Polytnorphism Information Content，PIC)由Botstein等在1980年提出，用來評價一個多態(tài)性基因座使用價值的一個量化概念。PIC由該基因座的等位基因數(shù)、等位基因頻率分布兩個因素決定。標(biāo)記