重組基因?qū)胧荏w細胞

1、重組基因?qū)胧荏w細胞重組基因?qū)胧荏w細胞第一節(jié)第一節(jié) 受體細胞受體細胞受體細胞受體細胞(receptor cell) 又稱為宿主細胞或寄主細胞又稱為宿主細胞或寄主細胞(host cell)等，從等，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究價值的細胞。和理論研究價值的細胞。作為基因工程的宿主細胞必須具備以下特性：作為基因工程的宿主細胞必須具備以下特性： 便于重組便于重組DNA分子的導入；分子的導入； 能使重組能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中；分子穩(wěn)定存在于細胞中； 便于重組

2、體的篩選；便于重組體的篩選； 遺傳性穩(wěn)定高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長； 安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染；物污染； 有利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累，有利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累，或促進外源基因的高效分泌表達?；虼龠M外源基因的高效分泌表達。 在遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性；在遺傳密碼的應用上無明顯偏倚性； 具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達；因的高效表達； 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應

3、用價值。關(guān)于細菌的感受態(tài)本質(zhì)與存在關(guān)于細菌的感受態(tài)本質(zhì)與存在 局部原生質(zhì)體化假說局部原生質(zhì)體化假說細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNADNA分子分子能通過質(zhì)膜進入細胞。能通過質(zhì)膜進入細胞。 酶受體假說酶受體假說感受態(tài)細胞表面形成一種能接受感受態(tài)細胞表面形成一種能接受DNADNA的的酶切位點，使酶切位點，使DNADNA分子能進入細胞。分子能進入細胞。 通常制備高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞的方法是：在冰浴中，通常制備高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞的方法是：在冰浴中，用一定濃度的用一定濃度的CaCl2CaCl2處理對

4、數(shù)生長期的細菌。處理對數(shù)生長期的細菌。 CaCl2CaCl2處理后的細菌一般處理后的細菌一般44可保存可保存48h,48h,用于轉(zhuǎn)化，大多用于轉(zhuǎn)化，大多數(shù)能在數(shù)能在1-21-2天內(nèi)具有吸收外源天內(nèi)具有吸收外源DNADNA的能力。的能力。重組體分子導入受體細胞的途徑重組體分子導入受體細胞的途徑 將外源重組體分子導入受體細胞的途包括將外源重組體分子導入受體細胞的途包括轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)導、顯微注射顯微注射、電穿孔電穿孔等多種方式。等多種方式。這些途徑將隨載體種類和受體系統(tǒng)的不同而異。這些途徑將隨載體種類和受體系統(tǒng)的不同而異。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導主要適應于細菌一類的原核細胞和轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導主要適應于細菌一

5、類的原核細胞和酵母這樣的低等真核細胞，而顯微注射和電穿酵母這樣的低等真核細胞，而顯微注射和電穿孔主要應用于高等動植物的真核細胞?？字饕獞糜诟叩葎又参锏恼婧思毎?把帶有目的基因的重組質(zhì)粒把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNADNA引入受體細胞的過程稱引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)化（為轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）。）。 將重組噬菌體將重組噬菌體DNADNA直接引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染直接引入受體細胞的過程稱為轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection）。）。 若重組噬菌體若重組噬菌體DNADNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的被包裝到噬菌體頭部成為有感染力

6、的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運載體，將頭部重組噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運載體，將頭部重組DNADNA導入受體細胞中，這一過程稱為轉(zhuǎn)導（導入受體細胞中，這一過程稱為轉(zhuǎn)導（transductiontransduction）。）。轉(zhuǎn)化反應轉(zhuǎn)化反應DNADNA分子轉(zhuǎn)化的過程如下：分子轉(zhuǎn)化的過程如下：1.1.吸附吸附完整的雙鏈完整的雙鏈DNADNA分子吸附在受體菌的表面；分子吸附在受體菌的表面；2.2.轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化雙鏈雙鏈DNADNA分子解鏈，單鏈分子解鏈，單鏈DNADNA進入受體菌，另一進入受體菌，另一鏈降解；鏈降解；3.3.自穩(wěn)自穩(wěn)外源質(zhì)粒外源質(zhì)粒DNADNA分子在細胞內(nèi)又復制成雙鏈環(huán)狀分子在細胞內(nèi)又

7、復制成雙鏈環(huán)狀DNADNA；4.4.表達表達供體基因隨同復制子同時復制，并被轉(zhuǎn)錄、翻供體基因隨同復制子同時復制，并被轉(zhuǎn)錄、翻譯。譯。 有的實驗結(jié)果表明，進行轉(zhuǎn)化的是雙鏈有的實驗結(jié)果表明，進行轉(zhuǎn)化的是雙鏈DNADNA，有的則證，有的則證明吸附在細胞表面的是雙鏈明吸附在細胞表面的是雙鏈DNA,DNA,但是以單鏈但是以單鏈DNADNA進入細進入細胞。胞。 至于質(zhì)粒至于質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)型的關(guān)系，認為只有閉環(huán)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)型的關(guān)系，認為只有閉環(huán)DNADNA與與開環(huán)開環(huán)DNADNA的轉(zhuǎn)化，才能獲得轉(zhuǎn)化子，而線性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，才能獲得轉(zhuǎn)化子，而線性質(zhì)粒DNADNA進行進行轉(zhuǎn)化不能得到轉(zhuǎn)化子，因為用超螺旋

8、閉合環(huán)狀和開環(huán)質(zhì)轉(zhuǎn)化不能得到轉(zhuǎn)化子，因為用超螺旋閉合環(huán)狀和開環(huán)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌不會受到菌體酶的破壞。粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌不會受到菌體酶的破壞。基因工程中常用的受體細胞類型：基因工程中常用的受體細胞類型： 原核生物細胞原核生物細胞 真核生物細胞真核生物細胞 真菌細胞真菌細胞 植物細胞植物細胞 動物細胞動物細胞一、原核生物細胞一、原核生物細胞優(yōu)點：優(yōu)點： 大部分原核生物細胞無纖維素組成的堅硬細胞壁，大部分原核生物細胞無纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源便于外源DNA的進入。的進入。 沒有核膜，染色體沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源外源DNA與裸露的染色體與裸露的染

9、色體DNA重組減少了麻煩。重組減少了麻煩。 原核生物多為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗原核生物多為單細胞生物，容易獲得一致性的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。復實驗快。1. 基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠基因組小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。缺點：缺點： 原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性原核生物細胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復性系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達，得到的多系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達，得到

10、的多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。 原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，原核生物細胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。1.原核細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表原核細胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定。達產(chǎn)物不穩(wěn)定。 至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌等?？莶輻U菌、藍細菌等。(一一) 大腸桿菌受體細胞大腸桿菌受體細胞 大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是

11、目前為止研究得大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，最為詳盡、應用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟也是基因工程研究和應用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。的載體受體系統(tǒng)。 優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。優(yōu)點：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。 缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，缺點：大腸桿菌細胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導致人體熱原反應?？蓪е氯梭w熱原反應。(二二)枯草桿菌受體細胞枯草桿菌受體細胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。性菌。優(yōu)點

12、：優(yōu)點： 枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將具有表達的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大具有表達的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達產(chǎn)物的提取和加工處理等，簡化了蛋白表達產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。生物活性。 枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌。安全的基因工程菌。 枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培

13、養(yǎng)。培養(yǎng)。 枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。于調(diào)控、分子遺傳學背景清楚等優(yōu)點。1. 應用：已成功的用于表達人的應用：已成功的用于表達人的干擾素、白細胞干擾素、白細胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒毒VPI抗原等。抗原等。(三三) 藍細菌（藍藻）藍細菌（藍藻） 藍藻藍藻又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素又稱藍綠藻或藍細菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) (PS ) 和光合系統(tǒng)和光合系統(tǒng) (PS )、能進行光合作用，但、

14、能進行光合作用，但它又它又具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。 藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點，具體表現(xiàn)在：物的優(yōu)點，具體表現(xiàn)在： 基因組為原核型，除了裸露的染色體基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉外，不含葉綠體綠體DNA和線粒體和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源作和外源DNA的檢測。的檢測。 細胞壁屬細胞壁屬G-，主要由肽聚糖組成，便于外源，主要由肽聚糖組

15、成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化?；?。 營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。 多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。好的條件。 藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。二

16、、絲狀真菌受體細胞二、絲狀真菌受體細胞 霉菌的基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控機理，以及蛋白霉菌的基因結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控機理，以及蛋白質(zhì)加工與分泌都具有真核生物的特征，利用其質(zhì)加工與分泌都具有真核生物的特征，利用其表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比表達高等動植物基因具有原核生物細胞無法比擬的優(yōu)點。擬的優(yōu)點。 霉菌培養(yǎng)條件簡單，可以大規(guī)模培養(yǎng)；霉菌培養(yǎng)條件簡單，可以大規(guī)模培養(yǎng)； 霉菌可以分泌表達目的基因產(chǎn)物，大大簡化霉菌可以分泌表達目的基因產(chǎn)物，大大簡化目標產(chǎn)物的分離純化過程。目標產(chǎn)物的分離純化過程。三、酵母菌細胞三、酵母菌細胞是單細胞真核微生物，外源真核基因理想的表是單細胞真核微生物，外源真核基因理想的表

17、達系統(tǒng)。達系統(tǒng)。優(yōu)點：優(yōu)點：酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作相對基因表達調(diào)控機理比較清楚，遺傳操作相對比較簡單。比較簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。1. 能使外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便能使外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。于產(chǎn)物的提取和加工。四、植物受體細胞四、植物受體細胞 優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞

18、在合適優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。 缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組胞壁，不利于攝取重組DNA分子。分子。 現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬南芥等玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬南芥等模式植物。模式植物。 五、動物受體細胞五、動物受體細胞優(yōu)點：能識別

19、和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA。真核基因的表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵母細胞的1620倍。易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點：組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。1.目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟動物和鼠、猴等實驗動物，主要用途在于大規(guī)模表達生產(chǎn)天然狀態(tài)的復雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。第二節(jié)第二節(jié) 重組重組DNA分子轉(zhuǎn)入分子轉(zhuǎn)入受體細受體細胞胞一、重組基因?qū)朐耸荏w細胞一、重組基因?qū)朐?/p>

20、受體細胞( (一一) )轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由Griffith于于1928年在肺炎雙球年在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。菌中發(fā)現(xiàn)的。 細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應遺傳性基因組中，從而獲

21、得供體菌的相應遺傳性狀的過程。狀的過程。轉(zhuǎn)化的辦法：轉(zhuǎn)化的辦法：用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法用復合劑制備感受態(tài)細胞用復合劑制備感受態(tài)細胞高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應用中，轉(zhuǎn)化受體菌細胞的是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子，而非來自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。 因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中

22、代表性的方法之一是Ca2+誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。Ca2+誘導的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法 Ca2+誘導DNA對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：在0C的CaCl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時CaCl2使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當42熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進入細胞的通道。 用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法 細菌在低溫

23、下經(jīng)細菌在低溫下經(jīng)CaClCaCl2 2溶液處理，細菌細胞膨脹成球形，溶液處理，細菌細胞膨脹成球形，提高了膜的通透性，轉(zhuǎn)化混合物中的提高了膜的通透性，轉(zhuǎn)化混合物中的DNADNA，形成抗，形成抗DNaseDNase的羧基的羧基- -鈣磷酸復合物，粘附于細胞表面上，經(jīng)鈣磷酸復合物，粘附于細胞表面上，經(jīng)4242短短時間熱沖擊處理，會使受體細菌中誘導產(chǎn)生出一種短暫時間熱沖擊處理，會使受體細菌中誘導產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài)。在此期間它們能夠攝取各種不同來源的的感受態(tài)。在此期間它們能夠攝取各種不同來源的DNADNA，如如噬菌體噬菌體DNADNA或質(zhì)粒或質(zhì)粒DNADNA等。等。 完全適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，

24、具有簡單快速、重完全適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，具有簡單快速、重復性好的優(yōu)點。每微克質(zhì)粒復性好的優(yōu)點。每微克質(zhì)粒DNADNA產(chǎn)生將近產(chǎn)生將近10107 7個轉(zhuǎn)化菌落，個轉(zhuǎn)化菌落，該效率可滿足常規(guī)克隆的需要。該法制備的感受態(tài)細胞該效率可滿足常規(guī)克隆的需要。該法制備的感受態(tài)細胞可貯存于可貯存于-70 -70 備用。備用。 該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，每g質(zhì)粒DNA可以獲得51062l07個轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。 用復合劑制備感受態(tài)細胞用復合劑制備感受態(tài)細胞 菌株暴露于組合的二價陽離子（菌株暴露于組合的二價陽離子（MnCl2Mn

25、Cl2和和CaCl2CaCl2）中更長時間，并且用氯化六氨合高鈷、）中更長時間，并且用氯化六氨合高鈷、DMSODMSO、DTTDTT（二硫蘇糖醇）等復合試劑處理細菌（二硫蘇糖醇）等復合試劑處理細菌以提高轉(zhuǎn)化效率。高于以提高轉(zhuǎn)化效率。高于5 510108 8個轉(zhuǎn)化菌落。個轉(zhuǎn)化菌落。 Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用MgCl2與CaCl2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高1001000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。 但該法要求條件高，對外界污染物極為

26、敏感，通常很少采用。 DNA分子進入大腸桿菌受體細胞的機制 一般認為只有雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒DNA分子才能轉(zhuǎn)化，而線形DNA分子不能獲得轉(zhuǎn)化子。因此，環(huán)狀DNA分子中混雜線形DNA分子，會影響環(huán)狀DNA分子的轉(zhuǎn)化效率。 也有人認為吸附在受體細胞表面上的是雙鏈DNA，但卻以單鏈DNA進入細胞，這與革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化過程相似。轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對照處理： DNA對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用無菌水代替感受態(tài)細胞，檢驗DNA溶液是否染菌。 感受態(tài)細胞對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1ml NTE緩沖液(500mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 1

27、mM EDTA, pH8.0)代替溶液，檢驗感受態(tài)細胞是否染菌。 感受態(tài)細胞有效性對照處理。在感受態(tài)細胞中加入已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細胞的質(zhì)粒DNA。 電穿孔轉(zhuǎn)化法 基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔(electroporation)形成可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。 電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每g DNA可以得到1091010轉(zhuǎn)化子。 研究表明，當電場強度和脈沖時間的組合方式導致5070細菌死亡時，轉(zhuǎn)化水平達到最高。 用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細胞處理要比感受態(tài)細胞的制備容易得多當細菌生長到對數(shù)中期

28、后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細胞懸浮液的離子強度，并用10甘油重懸細胞，使其細胞濃度為3l010個m1。分裝，在干冰上速凍后置于70貯存。這樣，每小份細胞融化后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達6個月以上。 電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(04)進行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式適用于那些難以采用Ca2+誘導轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。 非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所需的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細胞中存在另外一種融合性的接合

29、型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用。 接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接進行接合轉(zhuǎn)化而只能通過其遷移作用來完成。 首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導入受體細胞。 整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌

30、、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素 轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，有兩種表示方式： 一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示； 二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)的比率表示。 用每單位質(zhì)量的DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示，難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系。 以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)為基數(shù)來計算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液OD值測定或細菌計數(shù)，計算出用于制備感受態(tài)細胞的受體菌總數(shù)。然后計算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。 影響轉(zhuǎn)化率的因素分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率

31、較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進行轉(zhuǎn)化。 組成重組DNA分子的載體類型及其構(gòu)型。與受體細胞親和性較強的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，而處于自然雙螺旋閉環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體比開環(huán)結(jié)構(gòu)或線性結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)體外酶切、酶連操作后的載體DNA或重組DNA分子由于空間構(gòu)象難以恢復，轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。重組DNA分子的濃度和純度。在10ng100 1以下的DNA濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNA分子數(shù)成正比關(guān)系。 同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細胞，轉(zhuǎn)化率不同受體細胞的選擇對于重組DNA分子的轉(zhuǎn)化也是

32、極為重要。 前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法最高（1081010/g）；Ca2+誘導轉(zhuǎn)化法居中（107108 / g ）；而三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（104105 /g ），但它適于前兩種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。 在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細胞的預處理或感受態(tài)細胞的制備對轉(zhuǎn)化率影響最大。 如Ca2+誘導大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、CaCl2處理時間、感受態(tài)細胞的保存期以及熱激時間均是重要的影響因素。 電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對受體細胞進行冰凍甘油預處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預處理的轉(zhuǎn)化率高10100倍。 (二)重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌 將重組噬菌體DNA分子導入大腸桿菌受體細胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導操作。 轉(zhuǎn)

33、導(transduction)是指通過噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。 具有感染能力的噬菌體顆粒除含有噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。 以噬菌體顆粒感染受體細胞，首先必須對重組A噬菌體DNA分子進行體外包裝 。 體外包裝，是指在體外模擬噬菌體DNA分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒的技術(shù)。 基本原理，根據(jù)噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨地包裝噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺

34、失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝噬菌體DNA。 噬菌體DNA體外包裝的主要過程 制備包裝物。 首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌 第二，誘導溶菌生長 第三，收集和貯存包裝物。 體外包裝。 制備噬菌體DNA混合液。 第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r，細胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。 第二次包裝。進行第二次包裝，可提高包裝效率25倍，加入蛋白酶可降低包裝反應液的黏度，便于包裝反應的進行。 去除細胞屑。第二次包裝后，在反應液中加入SM溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。 經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當?shù)氖荏w菌細胞，并將重組噬菌體DN

35、A分子高效導入細胞中。 在良好的體外包裝反應條件下，每g野生型的噬菌體DNA可形成108109的pfu。對于重組的噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達到106107pfu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。(三)轉(zhuǎn)染 將重組噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染，類似于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。 完整的、未處理過的噬菌體DNA分子的轉(zhuǎn)染效率僅為105106，而處理過的重組噬菌體DNA分子的轉(zhuǎn)染效率下降到只有103104。 噬菌體的轉(zhuǎn)染在基因克隆實驗中并不常用。二、受體細胞的選擇二、受體細胞的選擇 野生型的大腸桿菌不是理想的受體細胞，因為自身具有的限制和修飾系統(tǒng)，另外

36、還可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細胞的突變菌株。通常應從以下幾個方面加以考慮：限制與修飾系統(tǒng) 這是導致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率低下的主要原因之一。 應選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導效率。 進一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。 重組系統(tǒng) 進入野生型細胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，

37、recA基因的突變使大腸桿菌細胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至10-6。 recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。 因此受體細胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型，基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。 易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導 可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細胞壁的通透性及細胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導形成感受態(tài)細胞的菌株作為受體菌細胞有明顯的選擇性差異 遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標記互補的遺傳性狀。 如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有Amp抗性標

38、記基因，則所選用的受體細胞應對這種抗生素敏感。當重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞后，載體上的標記基因賦予受體細胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。 如果受體細胞具有與外源基因表達產(chǎn)物活性互補的遺傳特征，可以直接篩選到外源基因表達的轉(zhuǎn)化細胞。 感染寄生缺陷型 從安全的角度上考慮，受體細胞不能具有感染寄生性。 第三節(jié)第三節(jié) 重組子的篩選重組子的篩選 將攝取外源將攝取外源DNA分子并能使該分子在其分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細胞統(tǒng)稱為克隆子。中穩(wěn)定維持的受體細胞統(tǒng)稱為克隆子。 把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導方法獲得的克把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（導入外源隆子叫做轉(zhuǎn)化

39、子（導入外源DNA分子后分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子 ），），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向?，F(xiàn)在這兩者有通用的趨向。 含有重組含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子稱為陽性克隆子或期望重組子 。 在重組在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導過分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導過程中，一般僅有少數(shù)受體細胞成為克隆子。程中，一般僅有少數(shù)受體細胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細胞背景中必須采用合適的方法從大量的細胞背景中篩選出期待的克隆子。篩選出期待的克隆子。

40、 經(jīng)過各種方法將外源經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導入受體分子導入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選?？寺∽拥暮Y選。 一、遺傳表型直接篩選一、遺傳表型直接篩選(一一)根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子 在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標記基因，分子中組裝了一種或兩種選擇標記基因，在受體細胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型在受體細胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)?；蜻z傳學特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。 一般的做法是將轉(zhuǎn)化處

41、理后的受體細胞接種在一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。出轉(zhuǎn)化子。 常用的選擇標記基因主要是抗性基因以及表達產(chǎn)物可以常用的選擇標記基因主要是抗性基因以及表達產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應底物顯色的基因，相應的選擇條件是可以發(fā)光或使反應底物顯色的基因，相應的選擇條件是可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。物發(fā)光的光線，或者是可以

42、使基因產(chǎn)物顯色的試劑。 選擇培養(yǎng)基是根據(jù)宿主細胞類型配置的培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基是根據(jù)宿主細胞類型配置的培養(yǎng)基，對于細對于細菌受體細胞而言，通常用菌受體細胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載入適量的某種選擇物即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體體DNA分子上攜帶的選擇標記基因所決定。分子上攜帶的選擇標記基因所決定。（1 1）抗藥性篩選）抗藥性篩選 當帶有完整抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)化無當帶有完整抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗藥性細胞后，凡轉(zhuǎn)入載體的細胞都獲得抗藥性細胞后，凡轉(zhuǎn)入載體的細胞都獲得了抗藥性，能在含有相應藥物的瓊脂平板了抗藥性，能在含

43、有相應藥物的瓊脂平板上生長成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的宿主細胞不上生長成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的宿主細胞不能生長。能生長。根據(jù)載體抗藥性標志插入失活選擇根據(jù)載體抗藥性標志插入失活選擇 含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個基因，并導致這個基因的失活，片段插入其中一個基因，并導致這個基因的失活，就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選含重組含重組DNA的菌落，這就是插入失活效應。的菌落，這就是插入失活效應。（2 2）插入失活篩選法）插入失活篩選法（3 3）插入表達篩選法）插入表達篩選法 利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。 有些載體在設(shè)計時，在篩選標記基因前面連接上一段負調(diào)控序列，當外源