流式細胞儀工作原理及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用_圖文

1、ISS N1672-4305 CN12-1352/N 實驗室科學(xué)LABORAT ORYSC IENCE第13卷第3期2010年6月Vol113No13Jun12010流式細胞儀工作原理及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用韓旭東,張皓楠,孟燕妮,劉彥強(天津中醫(yī)藥大學(xué)資產(chǎn)設(shè)備處,天津300193摘要:作為準確檢測中醫(yī)藥作用機制的儀器,流式細胞儀為其提供了可靠的檢測手段。該文系統(tǒng)地介紹了流式細胞儀在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:流式細胞儀;中醫(yī)藥;中藥復(fù)方Working p rincip le of flow cytometer and itsapp lication in traditional Chine

2、se medicine researchHAN Xu-dong,ZHAN G Hao-nan,M EN G Yan-ni,L I U Yan-qiang(D epart m ent of A sset and Equipm ent,Tian jin University of Traditional Chinese M edicine,Tianjin 300193,ChinaAbstract:The flow cytom eter supp lies reliab le detection m eans to accurately deter m ine the functional m ec

3、hanis m of traditional Chinese m edicine.The article system atically introduces the app lication of flow cytom eter in the traditional Chinese m edicine research.Key words:flow cytom eter;traditional Ch inese m edicine;Chinese m edicine for m ula中醫(yī)藥是中國古代人民長期同疾病抗爭的經(jīng)驗和理論知識的總結(jié),為中華民族的繁衍生息發(fā)揮了不可替代的作用。為了更好

4、地發(fā)揮中醫(yī)藥的醫(yī)療效果,迫切需要精密準確的檢測技術(shù)和方法對中醫(yī)藥的作用機制和機理進行研究。流式細胞儀(Flow Cytom eter,FC M以熒光顯微鏡與血球計數(shù)原理為基礎(chǔ),利用熒光染料技術(shù)、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計算機技術(shù),從同一個單細胞中同時測得多種參數(shù),為從細胞和分子生物學(xué)水平認識中醫(yī)藥提供了可靠的檢測手段。1流式細胞儀的工作原理1.1流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細胞儀主要由流動室和液流系統(tǒng)、激光源和光學(xué)系統(tǒng)、光電管(P M T和檢測系統(tǒng)、計算機和分析系統(tǒng)四部分組成,如圖1所示。流動室和液流系統(tǒng):流動室有樣品管、鞘液管和噴嘴等,是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品,單個細胞懸液在液流系統(tǒng)的液流壓

5、力下從樣品管射出,鞘液由鞘液管從四周流向噴孔,包圍在樣品外周后從噴嘴射出 。圖1流式細胞儀結(jié)構(gòu)示意圖激光源和光學(xué)系統(tǒng):激光源是氬離子氣體激光管,發(fā)射488m波長激光,激發(fā)經(jīng)熒光染色的細胞發(fā)出熒光信號,強弱與激光強度和照射時間相關(guān)。光學(xué)系統(tǒng)由透鏡、小孔、濾光片等組成,分為流動室前和流動室后兩組。流動室前光學(xué)系統(tǒng)將激光束聚焦成橫截面較小的橢圓形,以使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。流動室后的光學(xué)系統(tǒng)將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。光電管和檢測系統(tǒng):光電管為光電倍增管韓旭東,等:流式細胞儀工作原理及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用(P M T,將熒光染色細胞的熒光通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號傳輸?shù)綑z測

6、系統(tǒng)放大器。放大器有兩類,一類放大器輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系,適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號。另一類是對數(shù)放大器,輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系,在免疫學(xué)測量中常用。計算機和分析系統(tǒng):經(jīng)放大后的電信號被送往計算機多道分析器,多道道數(shù)和電信號的脈沖高度相對應(yīng),也和光信號強弱相關(guān),對應(yīng)道數(shù)縱坐標代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。由多道分析器出來的信號,再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件進行計算機存貯,可脫機進行數(shù)據(jù)處理和分析。1.2流式細胞儀的工作原理使用流式細胞儀進行檢測時,將待測細胞放入樣品管中,細胞在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。由于鞘液壓力與

7、樣品流壓力不同,在二者的壓力差異達到一定程度時,鞘液裹挾著樣品流中細胞排成單列逐個經(jīng)過激光聚焦區(qū)。如果將細胞中需要研究部分標上熒光染料,這些染料在細胞通過激光檢測區(qū)時受激光發(fā)出特定波長的熒光照射,通過一定波長選擇通透性的濾色片,可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開來,送到不同的光電倍增管中,經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換、放大,數(shù)字化處理,在計算機上直觀統(tǒng)計染上各種熒光染料細胞的各自百分率。選擇不同單克隆抗體及熒光染料,可利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多種不同特征。如果對具有某種特征的細胞有興趣,還可利用流式的分選功能將其分選出來,以便進一步培養(yǎng)、研究。2流式細胞儀在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用2.1研究細胞

8、與中醫(yī)證型的關(guān)系采用流式細胞儀分別測定慢性阻塞性肺疾病(CO PD肺氣虛證患者、肺陰虛證患者和健康體檢者的外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+數(shù)值1。與健康體檢者比較,肺氣虛證和肺陰虛證組CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;肺陰虛證組CD3+降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,肺氣虛證組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肺陰虛證組與肺氣虛證組比較,CD4+/CD8+降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;CD3+、CD4+降低,CD8+升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明CO PD肺氣虛證與肺陰虛證患者均存在細胞免疫功能低下,其中肺陰虛證患者細胞免疫功能受抑更為明顯。對符合氣陰兩虛、血瘀內(nèi)阻

9、型難治性血小板減少性紫癜(R ITP患者和健康對照人群外周血采用流式細胞儀進行免疫學(xué)指標檢測。結(jié)果顯示R ITP患者體內(nèi)CD3+CD25+T、CD3+HLA2DR+T、CD45RA+PRO+T、T、N KT、Th細胞亞群均發(fā)生了異常變化,差異具有顯著性。表明氣陰兩虛、血瘀內(nèi)阻證型的R ITP患者的免疫功能出現(xiàn)紊亂2。通過收集缺血性心力衰竭患者臨床資料,按照中醫(yī)證候分為氣虛、陰虛、陽虛、血瘀、痰阻、水飲6個證候要素和心肺氣虛、氣陰兩虛、心腎陽虛、氣虛血瘀、陽虛水泛、痰飲阻肺6個證候分型。采用流式細胞儀檢測外周血干細胞(PB SC數(shù)量,得出陽虛證PB SC數(shù)量最少,與氣虛、陰虛、痰濁和血瘀證比較,

10、差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與水飲證比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各中醫(yī)證候分型組PB SC數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明缺血性心力衰竭患者的中醫(yī)證候與PB SC 有相關(guān)性,呈現(xiàn)陽虛證候患者PB SC數(shù)量減少的特點3。2.2測定單味中藥有效成分的作用效果使用黑龍江省五常地區(qū)人工種植的一年生塊莖白附子,洗凈去皮,切成薄片于室溫(2030晾干,粉碎。95%乙醇溶液回流提取兩次,合并濾液,選乙酸乙酯萃取為濃縮物。將對數(shù)生長期的人胃癌的SGC-7901細胞以5105mL-1接種于50mL培養(yǎng)瓶中,加入白附子提取物使各瓶質(zhì)量濃度分別為0、0.72、7.2m gL-1,24h后收集細胞。測試結(jié)果與對照組比較顯示4,隨著藥物濃度

11、的增加,G/G1期和S期細胞所占比例減少,G2/M期細胞所占比例增多,表明白附子提取物使胃癌SGC-7901細胞阻滯于G2/M期;凋亡率隨著藥物濃度的增加而顯著升高。用陜西省西安藥品檢驗所提供的大黃素標準品(純度98%,進行大黃素體外抑制人樹突狀細胞(DC分化及成熟作用的研究。實驗分為不成熟樹突狀細胞組6例,大黃素刺激組(大黃素組8例,未經(jīng)大黃素刺激組(對照組6例。選取100g/mL的大黃素為最佳作用濃度,使用流式細胞進行樹突狀細胞表面分子表達及細胞因子分泌分析。結(jié)果顯示:大黃素組CD80、CD86、CD83的表達顯著低于對照組, CD14顯著高于對照組。表明體外大黃素的刺激可抑制人DC的分化

12、及成熟5。建立同型半胱氨酸誘導(dǎo)的人主動脈血管內(nèi)皮細胞損傷模型為對照組,同時將損傷模型與不同濃度葛根素(10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L共同培養(yǎng)48h為葛根素組,流式細胞儀測定DNA含量并分951 析細胞周期6。得出葛根素組G0/G1期細胞數(shù)明顯減少,S 期細胞數(shù)明顯增多,且存在劑量依賴性,與同型半胱氨酸組相比差異顯著,表明葛根素具有拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用。2.3測定中藥復(fù)方的作用效果在研究復(fù)方苦參方劑對大腸癌LoVo 細胞體外增殖凋亡的影響中7,復(fù)方苦參由苦參、黃芪、丹參、甘草、半枝蓮等中藥組成,經(jīng)煎煮法制成水溶液,每毫升含生藥2g 。收集經(jīng)藥物

13、作用48h 的大腸癌LoVo 細胞,在流式細胞儀分析DNA 含量及細胞周期。測試結(jié)果為LoVo 細胞可檢測亞G l 峰,凋亡率與對照組相比有明顯升高,細胞周期分析發(fā)現(xiàn)S 期細胞比例明顯增高,呈現(xiàn)出S 期阻滯現(xiàn)象。表明復(fù)方苦參方劑具有一定的抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。研究左歸丸(由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、菟絲子、川牛膝和龜膠組成、右歸丸(由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當歸、肉桂和附子組成對EA E 大鼠淋巴細胞亞群和N K 細胞的影響時,實驗設(shè)對照組、模型組、激素組、左歸丸組、右歸丸組。經(jīng)流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群及NK 細胞水平顯示8:造模后第15d

14、,左歸丸組CD4+細胞顯著升高,與正常組、激素組比較有顯著差異,與模型組比較差異不明顯;模型組CD4+/CD8+比值高于正常組差異不明顯;左歸丸組CD4+/CD8+比值顯著高于正常組。造模后第27d,各實驗組CD4+細胞與正常組無明顯變化;激素組CD8+細胞明顯低于正常組;右歸丸組CD8+細胞明顯高于激素組;模型組CD4+/CD8+比值明顯高于正常組;左歸丸組CD4+/CD8+比值明顯低于模型組。研究參知健腦片對淀粉樣蛋白對人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH2SY5Y 凋亡的保護作用,參知健腦片由人參、知母、芍藥等組成,作用于SH2SY5Y 模型,用具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的A PP17肽為對照藥物。分組給藥

15、并培養(yǎng)24h,流式細胞儀定量分析表明9,參知健腦片作用后,SH2SY5Y 細胞凋亡峰和凋亡率明顯降低,細胞內(nèi)活性氧水平也明顯降低,顯示參知健腦片能抑制SH2SY5Y 細胞凋亡,其保護作用可能與參知健腦片可降低細胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。流式細胞儀是眾多不同學(xué)科的最新研究成果和結(jié)晶,具有測量速度快速、靈敏度高、分辨率高、操作簡便等特點,做為一門先進的檢測方法和技術(shù)已經(jīng)日臻成熟,在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,并隨各領(lǐng)域研究的深入,取得了許多非常有意義的結(jié)果10。同樣在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域引入流式細胞檢測方法和技術(shù),并結(jié)合自身特點進行有針對性的探索,將為中醫(yī)藥的發(fā)展做出積極的貢獻。參考文獻(Ref

16、erences :1李澤庚,張四春,彭波,等.慢性阻塞性肺疾病肺氣虛證與肺陰虛證患者細胞免疫功能的比較J .北京中醫(yī)藥,2009,28(1:16-17.2楊曉紅,唐旭東,許勇鋼,等.氣陰兩虛、血瘀內(nèi)阻型難治性血小板減少性紫癜患者免疫功能狀態(tài)分析J .中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(3:202-204.3周育平,胡元會,吳華芹,等.缺血性心力衰竭中醫(yī)證候與外周血干細胞的相關(guān)性研究J .中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(9:798-801.4李艷鳳,唐麗萍,馬超,等.白附子提取物抑制人胃癌SGC -7901細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機制研究J .中國藥學(xué)雜志,2009,44(16:1237-1240.5林勝璋,荊河,楊瀟.大黃素體外抑制人樹突狀細胞分化及成熟作用的研究J .中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29(9:806-809.6沈曉君,何航.葛根素對HCY 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡及GRP78表達的影響J .中藥藥理與臨床,2009,25(4:12-15.7徐月,秦劍,周遠大,等.復(fù)方苦參方劑對大腸癌LoVo 細胞體外增殖凋亡的影響J .第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(15:1391-1393.8葉明