探討兔脂肪源性干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用

1、探討兔脂肪源性干細(xì)胞在顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用    摘要： 目的: 探討脂肪源性干細(xì)胞作為骨組織工程的種子細(xì)胞在修復(fù)兔顱骨缺損中的應(yīng)用前景. 方法: 提取兔脂肪源性干細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)并檢測(cè)，將成骨誘導(dǎo)前后的脂肪源性干細(xì)胞種植到自制松質(zhì)骨支架上，將細(xì)胞支架復(fù)合物和單純支架材料分別移植至兔顱骨缺損部位. 結(jié)果: 與未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架、單純支架以及空白處理對(duì)比，成骨誘導(dǎo)后的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合支架修復(fù)骨缺損面積最大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）. 結(jié)論: 脂肪源性干細(xì)胞可作為骨組織工程的種子細(xì)胞，其成骨誘導(dǎo)后與自制松質(zhì)骨復(fù)合植入體內(nèi)，能顯著促

2、進(jìn)骨缺損的修復(fù). 關(guān)鍵詞：  脂肪源性干細(xì)胞；異種松質(zhì)骨；支架材料；骨代用品；生物醫(yī)學(xué)工程；成骨誘導(dǎo)；種子細(xì)胞     0引言    如何獲得充足的種子細(xì)胞是長(zhǎng)期以來限制組織工程研究的瓶頸，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞盡管已被廣泛應(yīng)用于組織工程研究，但由于其干細(xì)胞含量過低、骨髓抽取量有限以及對(duì)患者造成的創(chuàng)傷等，使其廣泛應(yīng)用到受限. 2001年Zuk等1從脂肪組織中成功提取了干細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)其向骨、軟骨、脂肪、心肌等多個(gè)方向誘導(dǎo)分化. 我們將成骨誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs

3、）與異種松質(zhì)骨支架復(fù)合，移植至兔顱骨缺損部位，以探討成骨誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的應(yīng)用前景.    1材料和方法    1.1材料新西蘭大白兔12只，4 mo齡，體質(zhì)量2.02.2 kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Dolbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗壞血酸，HanksWay ANOVA檢驗(yàn). P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果    2.1細(xì)胞培養(yǎng)原代脂肪源性干細(xì)胞呈梭形，在甘油磷酸鈉，地塞米松，抗壞血

4、酸的誘導(dǎo)下，能向成骨方向分化（圖 1A）. 誘導(dǎo)2 wk后茜素紅染色陽性，提示有鈣結(jié)節(jié)形成(圖1B). ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)6 d后，支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組與對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1），支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組的ALP活性明顯高于單純支架組.表1不同時(shí)期對(duì)照組和成骨誘導(dǎo)組堿性磷酸酶含量  2.2電鏡觀察電鏡觀察結(jié)果顯示，成品松質(zhì)骨表面粗糙凸凹不平，ADSCs及成骨誘導(dǎo)后的ADSCs均能粘附在其表面并伸入裂隙中生長(zhǎng)，呈現(xiàn)梭形，表面有突起偽足（圖2）. &nb    sp; 

5、 2.3術(shù)后大體觀察手術(shù)植入后大體觀察，家兔手術(shù)區(qū)域無紅腫、滲出，無異物排出，給予抗感染治療，家兔飲食、活動(dòng)良好.    2.4定量分析術(shù)后14 wk取材，X線攝片顯示缺損部位有不同量的骨組織形成. 對(duì)照組、單純支架組和支架+ADSCs組骨缺損部位成骨面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）. 支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組的成骨面積大于其余3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，表2），其余各組間成骨面積無顯著性差異.表2兔顱骨缺損修復(fù)的定量分析    2.5組織學(xué)分析HE染色可見各組均有不同程度的新骨形成，尤以支架+成骨誘導(dǎo)A

6、DSCs組新骨形成最為顯著. 支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組，支架+ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成均以支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組最為顯著（圖3）.    3討論    ADSCs是一種新的干細(xì)胞，能夠向骨、軟骨、心肌細(xì)胞等多個(gè)方向分化1. ADSCs可經(jīng)抽脂術(shù)獲得，安全性較高，不良反應(yīng)少，患者容易接受， ASCs在體外增殖和誘導(dǎo)時(shí)對(duì)血清的要求較低2-5.    在抗壞血酸、地塞米松、磷酸甘油鈉的誘導(dǎo)下，ADSCs的ALP的表達(dá)增多，誘導(dǎo)2 wk后，茜

7、素紅染色陽性，提示有鈣結(jié)節(jié)的形成，而非誘導(dǎo)組茜素紅染色為陰性，提示ADSCs向成骨方向的分化. 2003年Lee 等6將ADSCs應(yīng)用于體內(nèi)成骨研究，將成骨誘導(dǎo)后的ADSCs復(fù)合多孔PLA材料埋植于大鼠皮下，8 wk后有骨組織生成. 將成骨誘導(dǎo)的ADSCs與可吸收材料相復(fù)合，有望用于修復(fù)骨缺損. Alejandro等3將成骨誘導(dǎo)后的ADSCs用于修復(fù)大鼠腭骨缺損，12 wk后，在缺損部位發(fā)現(xiàn)了新生的骨組織. Stefan等7將ADSCs與自體松質(zhì)骨顆粒和纖維蛋白膠相混合，成功用于修復(fù)一7歲女孩大面積顱骨缺損，盡管還不能確定這其中ADSCs起了多大的作用，但這一臨床病例確實(shí)令關(guān)注ADSCs的人們

8、大受鼓舞.    異種骨來源廣泛，沒有傳播疾病的潛在危險(xiǎn)性，且因骨組織結(jié)構(gòu)在不同種屬動(dòng)物間存在高度同源性，其骨小梁、小梁間隙、空隙率、骨內(nèi)管腔系統(tǒng)及骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)有利于組織細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)，并為細(xì)胞外基質(zhì)的分泌提供寬大的內(nèi)部空間及表面積，加之其無機(jī)成分主要是羥基磷灰石， 與人骨成分相同， 因此，異種骨結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后易被宿主組織細(xì)胞接近而發(fā)生爬行替代及生物降解，應(yīng)當(dāng)是較理想的載體材料8-10.    我們將自制脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨用于骨組織工程的支架材料，將其與ADSCs相復(fù)合，用于修復(fù)骨缺損. 結(jié)果表明，脫鈣、去抗原后的異種松

9、質(zhì)骨具有良好的生物相容性，成骨誘導(dǎo)前后的ADSCs均能在其表面良好生長(zhǎng)，植入體內(nèi)后，能夠被逐步吸收. 脫鈣、去抗原后的異種松質(zhì)骨可用作骨組織工程的支架.    我們所用細(xì)胞為自體細(xì)胞，最大程度減小了因機(jī)體免疫力的不同而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響. 植入體內(nèi)12 wk后，取材X線攝片結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后的ADSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨支架后能夠更好地修復(fù)骨缺損，而未誘導(dǎo)的支架+ADSCs、單純支架、對(duì)照組3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. HE染色結(jié)果顯示支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組，支架+ADSCs組和單純支架組均可見支架材料不同程度被吸收，沿支架有新骨形成，支架吸收、新骨形成，但均以支

10、架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組最為顯著. 成骨誘導(dǎo)后的ADSCs促進(jìn)了骨缺損的修復(fù).【參考文獻(xiàn)】  1 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell 2 based therapiesJ. J Tissue Eng, 2001, 7(2):211-228.2 Jason R, Dudas BA, Kacey G, et al. The osteogenic potential of adiposederived stem cells fo

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