異種化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的功能評(píng)價(jià)

1、異種化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的功能評(píng)價(jià)    【摘要】  目的評(píng)價(jià)異種化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損后神經(jīng)功能恢復(fù)，從而為臨床應(yīng)用去細(xì)胞異種神經(jīng)移植修復(fù)神經(jīng)缺損提供更為充分的理論依據(jù)。方法雄性Wistar大鼠15只，致左側(cè)坐骨神經(jīng)1 cm缺損，以等粗兔化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)。每2周測(cè)定坐骨神經(jīng)指數(shù)，移植后4個(gè)月動(dòng)物麻醉后暴露移植段神經(jīng)，刺激近側(cè)神經(jīng)干、于同側(cè)脛后肌群記錄運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位，之后取移植段神經(jīng)切片后行HE組織化學(xué)及NF-160免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果去細(xì)胞異種神經(jīng)移植物未被宿主排斥，大量

2、神經(jīng)纖維長(zhǎng)入移植物，神經(jīng)電生理及坐骨神經(jīng)指數(shù)顯示宿主坐骨神經(jīng)功能有部分恢復(fù)。結(jié)論去細(xì)胞異種神經(jīng)移植可以作為修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的一種有效方法?！娟P(guān)鍵詞】  外周神經(jīng)缺損； 去細(xì)胞異種神經(jīng)移植； 功能恢復(fù)    Abstract：ObjectiveTo observe the nerve regeneration and functional recovery in the adult rats.MethodTh

3、e sciatic nerves on the left side of 15 rats were exposed and 1.0 cm long segments of the nerves were removed from the midthigh level and replaced by rabbi

4、t nerve made acellular through chemical extraction.At 4 months after procedure,the nerve regeneration and function recovery were examined with HE staining,NF160 immunohistochemical staining,

5、electrophysiological tests and sciatic functional index (SFI).ResultIn the rats repaired by acellular nerves,regenerated axons reentered into the acellular xenonerve segments without excessive

6、60;sign of inflammation following implantation.As stimuling(1.5 mA,0.1 ms,1.0 Hz) to the proximal sciatic nerves,the implanted segment resulted in motor evoked potentials,which were recorded

7、 from posterior tibial muscles.SFI showed a partial recovery of locomotion of the limb with sciatic nerve defect.ConclusionSciatic nerves defect can be repaired by chemical ac

8、ellular xenogeneous nerves in rats.There was partial functional recovery,which revealed the grafting with chemical acellular xenogeneous nerves may be a promising mehod for nerve d

9、efect in clinical.    Key words：peripheral nerve defect;     acellular xenogeneous nerve transplantation;     functional recovery     周?chē)窠?jīng)的缺損在戰(zhàn)創(chuàng)傷中十分常見(jiàn)，其修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界

10、的一個(gè)棘手問(wèn)題。在臨床上，  自體神經(jīng)移植是最基本和最可靠的方法。但自體神經(jīng)移植來(lái)源有限，移植神經(jīng)多為腓腸神經(jīng)等的細(xì)小皮神經(jīng)，無(wú)法滿足較大神經(jīng)缺損和廣泛神經(jīng)缺損修復(fù)的需要，  同時(shí)，自體神經(jīng)移植不可避免的會(huì)造成二次創(chuàng)傷、供區(qū)功能障礙、感覺(jué)缺失、瘢痕形成和神經(jīng)瘤性疼痛等，故在臨床應(yīng)用上受到限制。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，對(duì)同種異體神經(jīng)進(jìn)行特定的化學(xué)萃取處理，可清除神經(jīng)中的細(xì)胞及髓鞘成分從而基本消除抗原性，同時(shí)由于保留了神經(jīng)的基管膜及板層結(jié)構(gòu)而成為神經(jīng)纖維再生的良好支架，他們相繼以化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植修復(fù)大鼠、兔及犬的坐骨神經(jīng)缺損獲得成功1 3，目

11、前已有臨床應(yīng)用的報(bào)道4。但臨床上同種異體神經(jīng)來(lái)源并不充分，因此有可能使其應(yīng)用受到限制。在前期研究中作者應(yīng)用化學(xué)萃取去細(xì)胞兔神經(jīng)分支移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，移植后未見(jiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)，大量再生纖維長(zhǎng)過(guò)移植物，同時(shí)見(jiàn)宿主雪旺細(xì)胞隨再生纖維遷移進(jìn)入移植物并形成髓鞘5 6。上述結(jié)果初步提示應(yīng)用化學(xué)去細(xì)胞異種神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)缺損的可能性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)觀察、動(dòng)態(tài)坐骨神經(jīng)指數(shù)測(cè)定及電生理檢測(cè)，  對(duì)兔化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠神經(jīng)缺損后神經(jīng)功能變化進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，進(jìn)一步探討經(jīng)化學(xué)萃取的去細(xì)胞神經(jīng)用于異種周?chē)窠?jīng)移植的可行性，為臨床應(yīng)用提供更為確實(shí)的依據(jù)。 

12、0;  1     材料與方法    1.   1     實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    雄性新西蘭大白兔1只，體重2.   5 kg；雄性Wistar大鼠15只，體重200 250 g。以上動(dòng)物由解放軍第89醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。    1.   2&#

13、160;    兔神經(jīng)取材及化學(xué)去細(xì)胞處理    1.   2.   1     兔臂叢神經(jīng)取材     846合劑(0.   15 mlkg體重)麻醉動(dòng)物，暴露雙側(cè)臂叢，剪取直徑約1.   5 mm，長(zhǎng)度超過(guò)1.   0 cm的分支，按后

14、述方法處理。    1.   2.   2     化學(xué)去細(xì)胞處理     參考Sondell等的方法2，將新鮮取材的神經(jīng)置蒸餾水中清洗，除去表面的組織碎塊及纖維膜，然后按下面的程序處理：(1)蒸溜水浸浴7 h，換水2次；(2)震蕩器中(150轉(zhuǎn)分)3.   0Triton X-100溶液消化12 h；(3)蒸餾水浸浴1 h；(

15、4)震蕩器中(150轉(zhuǎn)分)4.   0脫氧膽酸鈉溶液消化24 h。重復(fù)以上步驟1次，蒸餾水清洗后將處理好的神經(jīng)置無(wú)菌PBS液(pH 7.   2)中，4冰箱保存?zhèn)溆谩?#160;   1.   2.   3     大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型制作及神經(jīng)移植過(guò)程     0.   5戊巴比妥鈉(40

16、0;60 mg100 g體重)麻醉Wista大鼠，  自臀部肌間隙暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，自第一個(gè)肌支以上切除0.   8 cm，以1.   0 cm長(zhǎng)化學(xué)去細(xì)胞兔神經(jīng)分支移植修復(fù)，局部滴入硫酸慶大霉素注射液3 4滴，逐層關(guān)閉切口。分籠飼養(yǎng)。    1.   3     觀察指標(biāo)    1.  

17、 3.   1     大體行為學(xué)觀察     置實(shí)驗(yàn)鼠于平地，觀察手術(shù)側(cè)下肢運(yùn)動(dòng)情況。    1.   3.   2     坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(scimic functional index，SFI)測(cè)定     采用沈?qū)幗?等的改良方法

18、于術(shù)前及術(shù)后每2周測(cè)定實(shí)驗(yàn)側(cè)足(E)、正常側(cè)足(N)的足印長(zhǎng)度(PLF)、足距寬度(TSF)、中間足趾寬度(ITF)，直至術(shù)后4個(gè)月。將數(shù)據(jù)代入Bain公式，計(jì)算SFI及其恢復(fù)率。    SFI=-38.   3(EPL-NPL)NPL+109.   5(ETS-NTS)NTS+13.   3(EIT-NIT)NIT)    正常大鼠SFI為0，坐骨神經(jīng)完全離斷指標(biāo)為-100。    1

19、.   3.   3     神經(jīng)電生理觀察     術(shù)后4個(gè)月，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用0.   5戊巴比妥鈉麻醉，暴露并游離移植段神經(jīng)及對(duì)側(cè)正常坐骨神經(jīng)，行脛骨后肌群運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位測(cè)定。刺激電極置于移植段近側(cè)約2 mm處(正常側(cè)為對(duì)應(yīng)位置)，記錄電極經(jīng)皮刺入脛骨后肌群，刺激參數(shù)：0.   8 1.   5 mA 0.&#

20、160;  1 ms 1.   0 Hz。測(cè)量誘發(fā)電位潛伏期及波幅，每只動(dòng)物重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。   1.   3.   4     組織學(xué)觀察     完成電生理測(cè)定后，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取移植段神經(jīng)，石蠟包埋，縱行切片(片厚5 m)，分別行HE染色及NF-160免疫組織化學(xué)染色(常規(guī)ABC法)。 

21、0;  1.   4     統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，數(shù)據(jù)間用SPSS 10.   0軟件行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.   05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。    2     結(jié)     果   

22、 2.   1     行為學(xué)觀察    手術(shù)后大鼠術(shù)側(cè)下肢運(yùn)動(dòng)功能喪失，拖地行走，足趾并攏，針刺足底無(wú)動(dòng)作反應(yīng)。術(shù)后3周開(kāi)始，膝踝關(guān)節(jié)活動(dòng)恢復(fù)，足趾逐漸分開(kāi)并恢復(fù)足底行走，針刺足底有退縮逃避反應(yīng)。但傷側(cè)跛行明顯，協(xié)調(diào)性欠佳。    2.   2     坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index，SFI

23、)    自術(shù)后4周開(kāi)始逐漸恢復(fù)，最終恢復(fù)率超過(guò)50。    圖1     去細(xì)胞異種神經(jīng)移植后SFI變化圖    2.   3     電生理檢測(cè)    去細(xì)胞異種神經(jīng)鞘膜管移植組刺激移植段近側(cè)神經(jīng)，于脛骨后肌群可記錄到運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位，3次記錄重復(fù)性良好。與對(duì)側(cè)正常神經(jīng)比較，其潛伏期延長(zhǎng)，波幅較低(圖2，表1

24、)。表1     脛骨后肌群運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位比較    2.   4     組織學(xué)觀察    去細(xì)胞異種神經(jīng)移植組局部神經(jīng)連續(xù)性良好，移植段周?chē)p度粘連，吻合口輕度膨大。HE染色顯示，吻合口處神經(jīng)結(jié)構(gòu)連續(xù)性良好，神經(jīng)纖維再生長(zhǎng)入移植段，但排列紊亂(圖3a)，在移植段內(nèi)可見(jiàn)大量NF-160免疫反應(yīng)陽(yáng)性的新生纖維(圖3b)。    3 

25、0;   討     論    在前期實(shí)驗(yàn)中，作者應(yīng)用經(jīng)化學(xué)萃取的去細(xì)胞兔周?chē)窠?jīng)分支移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)經(jīng)化學(xué)萃取處理后的異種神經(jīng)具有良好的組織相容性，再生神經(jīng)纖維可以成功長(zhǎng)過(guò)移植物，同時(shí)宿主雪旺氏細(xì)胞可以隨再生纖維進(jìn)入移植神經(jīng)，圍繞再生纖維排列成條索狀并形成髓鞘包裹再生纖維5 6。但這些神經(jīng)再生能否獲得神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，從功能恢復(fù)的角度對(duì)化學(xué)去細(xì)胞異種神經(jīng)移植修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成年大

26、鼠坐骨神經(jīng)缺損應(yīng)用化學(xué)萃取去細(xì)胞兔臂叢神經(jīng)分支移植修復(fù)后，損傷側(cè)下肢運(yùn)動(dòng)功能自術(shù)后3周開(kāi)始逐步改善，最終恢復(fù)足底行走能力，但協(xié)調(diào)性及力量較對(duì)側(cè)差，進(jìn)一步的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)分析亦顯示了這種進(jìn)行性的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，恢復(fù)程度在術(shù)后3個(gè)月以后達(dá)到高峰，SFI最終恢復(fù)率達(dá)到57。自近側(cè)吻合口近段刺激神經(jīng)干，脛后肌群可記錄到誘發(fā)電位，表明神經(jīng)電傳導(dǎo)功能恢復(fù)，與正常側(cè)對(duì)比，潛伏期延長(zhǎng)、波幅降低。組織學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再生纖維可成功長(zhǎng)過(guò)移植物，這與以前的發(fā)現(xiàn)一致。    上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異種去細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)后，不僅能成功支持神經(jīng)再生，而且神經(jīng)電傳導(dǎo)及下肢運(yùn)動(dòng)功能部分恢復(fù)。這種恢復(fù)雖然遠(yuǎn)未達(dá)到正常，但實(shí)驗(yàn)鼠恢復(fù)了有效的負(fù)重行走能力。這進(jìn)一步提示在自體神經(jīng)應(yīng)用困難、異體神經(jīng)來(lái)源受限的情況下，臨床應(yīng)用去細(xì)胞異種神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)缺損的可行性。當(dāng)然在引入臨床應(yīng)用之前，有必要對(duì)其安全性及有效性進(jìn)行更為全面的評(píng)價(jià)，這包括：與自體神經(jīng)移植、去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植或其它神經(jīng)缺損修復(fù)方法做比較以確