人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析

1、實驗一 人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【實驗?zāi)康摹? 熟悉人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。2 熟悉人類染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析?！緦嶒炘怼咳旧w是在顯微鏡下可見細(xì)胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此，必須獲得染色體標(biāo)本才能進(jìn)行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時細(xì)胞

2、進(jìn)入增殖旺盛期，此時加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋帶，表明每條染色體的特征?！緦嶒炗闷贰?采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機、托盤天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號筆、玻片架、火柴、10ml注射器。2RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（1

3、0mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。32.5胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉?！緦嶒灢襟E】一外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與分析1. 采血及接種培養(yǎng)1.1 在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤至管壁。1.2 常規(guī)消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉(zhuǎn)動注射器使血液與肝素混勻。1.3 在超凈工作臺中，預(yù)先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號針頭），

4、水平搖動混勻。1.4 置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程中每天水平搖動培養(yǎng)物12次，使血液均勻懸浮，再繼續(xù)培養(yǎng)。1.5 終止培養(yǎng)前24小時，加入秋水仙素，使終濃度達(dá)到0.2g/ml。輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時。2制片2.1 收集細(xì)胞時，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）。2.3 棄上清液，加入37預(yù)溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后，置37恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸

5、管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。2.5 棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后，室溫下固定20分鐘。2.6 1000 rpm離心 8分鐘。2.7 棄上清液，重復(fù)固定一次。2.8 棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細(xì)胞制成懸液。2.9 吸取少量細(xì)胞懸液，滴23滴于冰水浸泡過的載玻片上，吹散，氣干。2.10 將標(biāo)本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。2.11 顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。二人外周血淋巴細(xì)胞染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析1. G顯帶染色體標(biāo)本制備1.1 常規(guī)制片后，將標(biāo)本置70烤箱中干烤2小時，自然冷卻

6、。1.2 取2.5胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理鹽水，用 1N HCl或1N NaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（PH6.87.2），置 37OC預(yù)溫。1.3 將玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理2545秒鐘，不斷輕輕搖動玻片，使胰酶作用均勻。隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時間逐漸延長。1.4 取出染色體玻片標(biāo)本，置于37預(yù)溫的生理鹽水中，然后用蒸餾水沖洗玻片（或輕甩，除去多余的胰酶）。1.5 將玻片標(biāo)本放入37預(yù)溫的Giemsa染液中，染色510分鐘。1.6 自來水沖洗，氣干。1.7 顯微鏡觀察?！緦嶒灲Y(jié)果與分析】一. 常規(guī)染色體核型分析1根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲

7、粒的位置，將染色體分為七組。A組染色體：包括13號染色體。長度最長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。B組染色體：包括45號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。C組染色體：包括612號和X染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。D組染色體：包括1315號染色體，具有近端著絲粒和隨體。E組染色體：包括1618號染色體，16號染色體著絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著絲粒約在 1/4處。F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，為近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。

8、2繪圖：繪出在顯微鏡下觀察到的染色體。二G顯帶染色體標(biāo)本分析G帶顯示的正常人顯帶核型特征（見附圖1.1、1.2、1.3）A組染色體：包括13號染色體。長度最長，1號和3號染色體為中央著絲粒，2號染色體為亞中央著絲粒染色體。1號染色體短臂：在320條帶左右的分裂相上，近側(cè)段有兩條深帶，第2條深帶稍寬；在處理好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段可顯出34條淺染的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的第1深帶為2區(qū)1帶，第2深帶為3區(qū)1帶。長臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色深淺不一，其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，中段兩條深帶稍靠近，其中第2條染色較濃。此臂分為四個區(qū)，副縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為2區(qū)1帶，中段第2深帶為3區(qū)1

9、帶，遠(yuǎn)側(cè)段第1深帶為4區(qū)1帶。2號染色體短臂可見四條深帶，中段的兩條深帶較靠近。此臂分為2個區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2區(qū) 1帶。 長臂：有 7條深帶，第 3和第4深帶有時融合。此臂分為 3個區(qū)第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。3號染色體著絲粒區(qū)濃染短臂：在近側(cè)段可見一條較寬的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的一條較窄，且著色較淺，這是區(qū)別3號染色體短臂的重要特征。近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。長臂：一般在近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較寬的深帶。在顯帶好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為三條深帶。此臂分為2

10、個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。B組染色體：包括45號染色體，長度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。 4號染色體短臂：可見兩條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有一個區(qū)。長臂：可見均勻分布的四條深帶，在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶可各自再分為兩條較寬的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)段第1和第2深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號染色體短臂：可見兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬而且色濃，短臂只有一個區(qū)。長臂：近側(cè)段有兩條深帶，染色較淺，有時不明顯；中段可見三條深帶，染色較深，有時融合成一條寬的深帶；遠(yuǎn)側(cè)段可見二條深帶，近末端的一條著色較濃。此臂可分為3個區(qū)，中段第 2深帶

11、為 2區(qū)1帶，中段深帶與遠(yuǎn)側(cè)段深帶之間的寬闊的淺帶為 3區(qū) 1帶。C組染色體：包括612號和X染色體，中等長度，亞中央著絲粒染色體。 6號染色體短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，其中近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條深帶，近側(cè)深帶緊貼著絲粒；在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶又可分為兩條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見五條深帶，其中近側(cè)的一條緊貼著絲粒，遠(yuǎn)側(cè)段末端的一條深帶著色較淺。此臂分為2個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。7號染色體著絲粒濃染。短臂：有三條深帶，中段深帶著色較淡，有時不明顯；遠(yuǎn)側(cè)深帶著色濃寬，狀如”瓶蓋”。此臂分為2個區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)段的淺帶為2區(qū)1帶。

12、長臂：有三條明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末端的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)二帶，中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號染色體短臂：有兩條深帶，中段有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區(qū)分的主要特征。此臂分為2個區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見三條分界不明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶著色較濃。此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。9號染色體著絲粒濃染。短臂：近側(cè)段和中段各有一條帶，在顯帶較好的標(biāo)本上，中段可見兩條窄的深帶，此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長臂：可見明顯的兩條深帶，副縊痕一般不著色，在有些標(biāo)本上顯現(xiàn)出特有狹長的頸部區(qū)。此臂分為 3個區(qū)，近側(cè)的一條

13、深帶為2區(qū) 1帶，遠(yuǎn)出的一條深帶為3區(qū)二帶。10號染色體著絲粒濃染。短臂：近出段和中段各有一條深帶，在有些標(biāo)本的中段可見兩條深帶，但與8號染色體短行比較，其深帶的分界不夠清晰。此臀只有一個區(qū)。長臂：可見明顯的三條帶，近側(cè)的深帶較明顯，遠(yuǎn)側(cè)的兩條深帶較靠近，這是與8號染色體相鑒別的主要特征。此管分為2個區(qū)，近側(cè)段的一條深帶為2區(qū)1帶。11號染色體短臂：近中段可見兩條靠的很近的較窄的深帶在顯帶較差的標(biāo)本上，只能看見一條寬帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒遠(yuǎn)側(cè)段可見一條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是一條寬闊的淺帶，這是與12號染色體相鑒別的一個明顯特征；在顯帶較好的標(biāo)

14、本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，一般極難辨認(rèn)，但它是一個分區(qū)的界標(biāo)，在有些標(biāo)本上近末端處還可見一條窄的淡色的深帶。此臂分為2個區(qū)，上述遠(yuǎn)側(cè)兩條深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。12號染色體短臂：中段可見一條深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒；中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體相比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個主要特征；在顯帶好的標(biāo)本上，中段較寬的深帶可分為三條深帶，其正中的一條著色較濃；在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的近端還可見12條染色較淡的深帶。此行分為2個區(qū)，中段正中的深帶為2區(qū)1帶。X染

15、色體其長度介于7號和8號染色體之間。短臂：中段有一條明顯的深帶，如竹節(jié)狀。在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可見一條窄的、著色淡的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長臂：可見45條深帶，近中部的一條深帶最明顯。此臂分為2個區(qū)，近中段的深帶2區(qū)1帶。D組染色體：包括1315號染色體，具有近端著絲粒和隨體。13號染色體著絲粒濃染。長臂：可見4條深帶，第1和第4帶較窄，染色較淡。第2和第3深帶較寬，染色較濃，此臂分為3個區(qū)，第2深帶為2區(qū)1帶，第3深帶為3區(qū)1帶。14號染色體著絲粒濃染。長臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶，在處理好的標(biāo)本上，中段尚可見一條較淺的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)深帶為2區(qū)1帶，

16、遠(yuǎn)側(cè)深帶為3區(qū)1帶。15號染色體著絲粒濃染。長臂：中段有一條明顯的深帶，染色較濃，有的標(biāo)本上，近側(cè)段可見l2條淡染的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。E組染色體：包括 1618號染色體，16號染色體著絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著絲粒約在 1/4處。16號染色體短臂：中段有一條深帶，較好的標(biāo)本上可見兩條深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：中段和遠(yuǎn)側(cè)各有一條深帶，有時遠(yuǎn)側(cè)段的一條不明顯，副縊痕著色濃。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。 17號染色體短臂：有一條深帶，緊貼著絲粒。此臂只有1個區(qū)。長臂：遠(yuǎn)側(cè)段可見一條深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個區(qū)，這條明顯而

17、寬的淺帶為2區(qū)1帶。 18號染色體短臂：有一條窄的深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶。此臂分為2個區(qū)，兩深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著絲粒。19號染色體著絲粒及周圍為深帶，其余為淺帶。短臂和長臂均只有1個區(qū)。 20號染色體著絲粒區(qū)濃染。短臂：有一條明顯的深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：在中段和遠(yuǎn)側(cè)段可見12條染色較淺的深帶，有時全為淺帶。此管只有1個區(qū)。G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，具近端著絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。21號染色體著絲粒區(qū)著色淺。與22號染色體相比較，其長度比22號短。其長

18、臂近側(cè)有一明顯而寬的深帶。此臂分為2個區(qū)，其深帶為2區(qū)1帶。22號染色體著絲粒區(qū)染色濃。與21號染色體相比較，其長度比21號長；在長臂上可見兩條深帶，近側(cè)的一條著色較濃而且緊貼著絲粒，近中段的一條著色淺，在有的標(biāo)本上不顯現(xiàn)。此臂只有1個區(qū)。 Y染色體長度變化較大，有時整個長臂被染色成深帶。在染色較好的標(biāo)本上，可見兩條深帶。此臂只有1個區(qū)。圖1.1 G顯帶染色體核型圖1.2 G顯帶染色體核型分析圖1.3 正常男性G顯帶染色體模式圖【注意的問題】1采血時不要加入太多的肝素，因為肝素含量過多時往往抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。2培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液逐漸變黃色，說明pH發(fā)生了較大變化，將不利于細(xì)胞生長，此時可加入適

19、量滅菌的1.4% NaHCO3溶液調(diào)整，或再加入23ml培養(yǎng)液的辦法來校正。3培養(yǎng)失敗的原因，一般有下述幾種：培養(yǎng)瓶及器材洗滌不符合要求；配制溶液的雙蒸水不符合要求；PHA和培養(yǎng)液的質(zhì)量有問題，或培養(yǎng)液pH不符合要求；無菌操作不符合要求，發(fā)生污染；淋巴細(xì)胞對PHA反應(yīng)降低，致分裂相太少。4標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因：秋水仙素的處理不當(dāng)，如秋水仙素的濃度不夠或處理時間不足，結(jié)果分裂相太少；如濃度過高或處理時間過長，則使染色體過于縮短，難于進(jìn)行分析；低滲處理不當(dāng)，低滲處理時間過長時，細(xì)胞膜往往過早破裂，染色體丟失；如果低滲處理不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行計數(shù)分析；離心速度不合適，收集細(xì)胞時離心的速度太

20、低易丟失細(xì)胞，如果低滲后離心速度過高，往往使分裂相過早破裂，完整的分裂相減少；標(biāo)本固定不充分，如固定液不新鮮，或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，結(jié)果染色體模糊，或殘留胞漿痕跡，使背景不清；玻片去污不徹底，冷凍不夠，使細(xì)胞懸液不能均勻附著以致細(xì)胞大量丟失，或染色體分散不佳。5制備G顯帶染色體標(biāo)本時，要嚴(yán)格控制胰酶消化時間，時間不足顯不出帶紋，時間過長，使染色體不規(guī)則或形成空泡狀。附 錄一、試劑及配制：1、 RPMI1640培養(yǎng)液RPMI1640 10.4g肝素 80mgPHA 182mg胎牛血清 100ml抗菌素 8萬單位NaHCO3 2g雙蒸水定容至1000ml。抽濾除菌，分裝，-200C保存待用。2

21、、 低滲液（0.075Mol KCl）KCl 2.794 g三蒸水 500ml3、 固定液甲醇（AR）：冰醋酸（AR）=3：1 現(xiàn)用現(xiàn)配。4、 Giemsa染液貯存液 Giemsa 5g純甘油（AR） 330ml甲醇 （AR） 33ml先將Giemsa粉劑溶于少量的甘油中，在研缽中充分研磨至無顆粒粘糊狀，再將全部甘油加入，然后移至燒杯中，在5560OC溫箱中放置2小時，冷卻后加入甲醇，充分?jǐn)嚢杈鶆颍谑覝胤胖?3周后過濾除去絮狀物，儲存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。使用液磷酸緩沖液甲、乙各2.5ml，加45ml雙蒸水，加Giemsa原液2.5ml。5、 2.5%胰蛋白酶原液 胰蛋白酶

22、粉劑 2.5g 生理鹽水 100ml 6、 秋水仙素（10mg/ml，使用液100g/ml） 秋水仙素 1g 生理鹽水 100ml 抽濾，4OC棕色瓶保存。7、 肝素（2500U/ml，使用濃度50U/ml）肝素鈉 312.5 mg生理鹽水 100ml 高壓滅菌。8、 Hanks液（g/L）NaCl 8.00KCl 0.40CaCl2 0.14MgSO47H2O 0.20Na2HPO4 0.06KH2PO4 0.06NaHCO3 0.35葡萄糖 1.00酚紅 0.02二、記錄和檢查回報表表1 染色體病病例檢查分析記錄送檢材料： 檢查目的： 送檢時間：編 號： 送 檢 者： 院 科 醫(yī)生患者姓名

23、： 性 別： 年 齡：臨床檢查摘要于臨床初步診斷：家系資料： 表2 染色體檢查記錄（記錄內(nèi)容：顯微鏡號、標(biāo)本號、座標(biāo)、核型與異常特點）123456789101112131415 161718192021222324252627282930313233343537373839404142434445464748485051525354555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100表3 染色體畸變分析記錄玻片號性別號座 標(biāo)核 型畸變?nèi)旧w特點照片編號討 論：分

24、析結(jié)果： 分析者： 年 月 日表4 核型分析 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 11 12 X C 13 14 15 16 17 18 D E 19 20 21 22 Y F G表5核型分析檢查回報單姓 名性 別年 齡送檢材料送檢目的時 間編 號送檢者院 科 醫(yī)生臨 床 初步 診 斷細(xì) 胞 遺傳 學(xué) 檢查 結(jié) 果（1）X染色質(zhì)檢查 Y染色質(zhì)檢查（2）核型分析（3）皮膚文理特征（4）家系分析診 斷 檢查者 簽字 年 月 日實驗二X和Y染色質(zhì)標(biāo)本的制作與觀察X and Y Chromatin Preparation and Observation【實驗?zāi)康摹渴煜染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的

25、形態(tài)特征及其檢查方法【實驗原理】正常女性核型為46，XX。在間期細(xì)胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)，這是女性細(xì)胞中一條X染色體隨機Lyon化失活形成的。這種失活保證了雌雄兩性細(xì)胞中都只有一條有活性的染色體，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。稱為X染色體的劑量補償（參考Lyon假說）。正常男性核型為46，XY。在男性間期細(xì)胞核中，可見位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.250.3m。是Y染色體長臂特異性著色而形成。人的性別是由X和Y染色體決定的。需要對人的性別進(jìn)行鑒定時，除進(jìn)行染色體核型分析和臨床生殖器官的檢查外，還可

26、以通過細(xì)胞學(xué)方法，如檢查期間體細(xì)胞（口腔上皮，皮膚，羊水和血細(xì)胞等）的核內(nèi)染色質(zhì)X和Y染色質(zhì)來鑒定?！緦嶒炗闷贰匡@微鏡、熒光顯微鏡、乙醇(無水乙醇,95,70、50)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1結(jié)晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦鏡紙、蓋玻片、載片、15ml刻度離心管、牙簽、吸水紙、小鑷子、碘酒、酒精棉球、采血針、3醋酸溶液、pH66.5緩沖液、0.5鹽酸阿的平染液。（注：硫堇染液(工作液)，干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后過濾備用；醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉·3H2O 9.7g，巴比妥鈉14.7g，溶于500mL蒸餾水中；0.1 molL鹽酸；按：

27、=40：28：32比例配成混合液，調(diào)pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。） 【實驗步驟】一、X染色質(zhì)的制備和觀察（一）取材1. 讓受檢者用水漱洗口腔數(shù)次，以盡量除去口腔內(nèi)細(xì)菌或其它雜物。2.用牙簽鈍頭部或木質(zhì)器具刮取口內(nèi)側(cè)面的口腔粘膜上皮，棄去第一次刮到的細(xì)胞。3. 同一部位連續(xù)刮取數(shù)次，將刮取物涮入裝有生理鹽水的離心管內(nèi)。（二）標(biāo)本的制作1. 將細(xì)胞懸液的離心管進(jìn)行離心（1 500 rpm）10分鐘，去上清液，留下細(xì)胞團(tuán)。2. 加入新配制的固定液（3份甲醇1份冰醋酸）8mL，混勻呈懸液。固定30分鐘。3. 離心（同上），去上清液，留下細(xì)胞團(tuán)。4. 加入數(shù)滴（根據(jù)細(xì)胞多少而

28、增減）固定液，充分混勻呈懸液。5. 滴一滴懸液至預(yù)先置冰盒中的干凈載玻片上，晾干。每份樣本制片34張。（三）染色Klinger硫堇染色法1. 將玻片標(biāo)本置入1mol/L HCl中，37條件下水解20分鐘。2. 用蒸餾水充分沖洗、晾干。3. 硫堇染液中染色約15分鐘。4. 蒸餾水沖洗、晾干。硫堇染色的優(yōu)點是只有細(xì)胞核清晰著色，胞漿不著色，因此細(xì)胞核背景清晰，利于對位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認(rèn)。結(jié)晶紫的染色法1. 固定后的玻片標(biāo)本經(jīng)過70、50酒精及蒸餾水（更換兩次蒸餾水）各5分鐘。2. 置入1結(jié)晶紫溶液中染色58分鐘。大量制片時可用0.5結(jié)晶紫染液，染色1015分鐘左右。3. 95酒精中分化（快

29、速地在酒精中沾58次）。4. 繼續(xù)在無水乙醇中分化，間歇地用顯微鏡檢查，直至標(biāo)本中核結(jié)構(gòu)的微細(xì)部分都很清楚為止（一般約1分鐘）。5. 置入二甲苯中。更換2次二甲苯，每次3分鐘，以使標(biāo)本透明。6. 樹膠封片。（四）觀察1.先在低倍鏡(10倍鏡)下觀察，可見視野中有許多單個或成堆的口腔上皮細(xì)胞。選擇清楚而分散的細(xì)胞，移至視野中央，再換高倍鏡仔細(xì)觀察?？谇簧掀ぜ?xì)胞為多邊形的扁平狀，細(xì)胞中央有一被染成深蘭色的圓形或橢圓形的細(xì)胞核。核周圍均質(zhì)部分為細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞的外表為一很難與細(xì)胞質(zhì)相區(qū)別的薄膜即細(xì)胞膜。2. 40倍或油鏡下檢查100個“可計數(shù)細(xì)胞”，并計數(shù)具有X染色質(zhì)的細(xì)胞數(shù)。二、Y染色質(zhì)的制片與觀察（

30、一）制作標(biāo)本1. 采血與涂片：男同學(xué)用碘酒，酒精棉球常規(guī)消毒食指或耳垂后，用采血針點刺食指或尖或耳垂，擠出23滴血于一干凈的底玻片中央，用牙簽將血滴涂成較厚的一層血膜，直徑約1.5cm，晾干。2. 固定：加3的醋酸溶液數(shù)滴于血膜上，靜置15分鐘，其間可換液一次，使紅細(xì)胞溶解。3. 用pH66.5磷酸緩沖液沖洗血膜，晾干。4. 染色：加0.5鹽酸阿的平溶液數(shù)滴于血膜上，放置暗處靜置染色15分鐘。（若使用口服阿的平片劑，則用100mg溶于10ml雙蒸水中，染色時間為25分鐘）。5. 再用磷酸緩沖液沖洗黃色溶液。6. 加蓋玻片，在有緩沖液的情況下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。（二）觀察Y染色質(zhì) 先在低倍鏡

31、下觀察，可見許多白細(xì)胞（多為淋巴細(xì)胞）核染成黃色。換高倍鏡，可見位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.250.3m。最后可用油鏡再仔細(xì)觀察。Y染色質(zhì)在男性白細(xì)胞的出現(xiàn)率可達(dá)6070。注意需要計數(shù)的細(xì)胞必須是核膜完整無缺，核質(zhì)染色均勻，清晰可見，核周圍無細(xì)菌和其它污染物質(zhì)的干擾?！緦嶒灲Y(jié)果與分析】觀察并計算X染色質(zhì)的陽性率。X染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是：1. 位于核膜內(nèi)緣。2. 核內(nèi)唯一的濃染、輪廓清楚的小體，直徑約為11.5m,一般呈平凸形、圓形、扁平形或三角形。(注：配制的pH66.5的磷酸緩沖液要用黑紙或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一個月。)實驗三 姊妹染色單

32、體交換實驗Sister Chromosome Exchange （SCE）【實驗?zāi)康摹渴煜ぶ苽銼CE標(biāo)本的原理和基本程序?！緦嶒炘怼挎⒚萌旧珕误w交換（Sister chromatial exchange,SCE）是染色體同源座位上復(fù)制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類特殊的同源重組，主要在DNA合成期形成，可能與DNA雙鏈的斷裂與復(fù)制有關(guān)，SCE的發(fā)生的頻率可反映細(xì)胞在S期的受損程度。如果一個個體的SCE率明顯增高，可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響，或是受到遺傳缺陷的內(nèi)在制約因素所致。在細(xì)胞分裂時，每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNA組成。5

33、-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy-uridine，BrdU）是脫氧胸腺嘧啶核苷的類似物，在DNA鏈的復(fù)制過程中，可替代胸腺嘧啶。當(dāng)細(xì)胞生存環(huán)境中存在BrdU時，BrdU取代脫氧胸苷摻入到復(fù)制的DNA中。經(jīng)兩個復(fù)制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNA的雙鏈均有BrdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BrdU摻入。利用特殊的分化染色技術(shù)對染色體標(biāo)本進(jìn)行處理，可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrdU的單體深染。當(dāng)姊妹染色體間存在同源片段交換時，可根據(jù)每條單體夾雜著深淺不一的著色片段加以區(qū)分。由于姐妹染色單體的DNA序列相同，SCE并不改變遺傳物質(zhì)組成，但SCE

34、是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的，因此，SCE顯示方法通常用來檢測染色體斷裂頻率，用來研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應(yīng)?！緦嶒炗闷贰?. 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、冰箱、離心機、顯微鏡、采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、膠塞、乳頭吸管、試管架、載玻片、托盤天平、干燥烤箱、染色缸、電吹風(fēng)、30W紫外燈。2. 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清、秋水仙素（100g/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200g/mL）、低滲液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸?！緦嶒灢襟E】1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。2. 37培養(yǎng)

35、24小時后，加BrdU溶液（終濃度為8g/mL）混勻。3. 用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。4. 收獲前加入秋水仙素（終濃度為0.2g/mL），繼續(xù)培養(yǎng)1小時。5. 常規(guī)法制片。將玻片標(biāo)本室溫放置23天。6. 分化染色前一天，將標(biāo)本置37過夜。7. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片放在牙簽上，加適量2×SSC溶液（以不超過標(biāo)本為度）。在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍大的擦鏡紙，使紙邊浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液滲至玻片標(biāo)本上，保持標(biāo)本濕潤。8. 將平皿置55水浴面上，用30W紫外燈垂直照射標(biāo)本30分鐘，照射距離10cm。9. 照射后輕輕取掉擦鏡紙，立即用蒸餾

36、水沖洗標(biāo)本。10. Giemsa染色510分鐘；蒸餾水沖洗標(biāo)本，氣干。11. 鏡檢，計數(shù)。每個末端交換記為1次SCE，中部交換記為2次SCE。【實驗結(jié)果與分析】觀察30個細(xì)胞的分裂相，記錄每個細(xì)胞的SCE總數(shù)，計算SCE頻率。n個中期分裂相SCE之和SCE頻率= n個細(xì)胞中國人正常SCE頻率為5.7±0.4。實驗四銀染核仁形成區(qū)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合AgNO3 Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome【實驗?zāi)康摹渴煜ゃy染的原理和方法?！緦嶒炘怼咳祟惤酥z粒染色體的副縊痕與核仁形成有關(guān)，故稱

37、為核仁形成區(qū)（NOR）。當(dāng)位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因（rDNA）具有轉(zhuǎn)錄活性時，應(yīng)用銀染技術(shù)可使NOR特異性著色（褐黑色）。進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。人類核糖體RNA基因位于5對近端著絲點染色體短臂的次猛痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中， 不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10。應(yīng)用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA基因的活動。此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，應(yīng)用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此，應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）與近端著絲粒

38、染色體隨體聯(lián)合（Ag-AA）技術(shù)，可以分析有活性的rRNA基因的動態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細(xì)胞?！緦嶒炗闷贰?. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子；2. 預(yù)制染色體玻片標(biāo)本、0.1甲酸、AgNO3（50）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl?！緦嶒灢襟E】1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標(biāo)本在室溫下放置23天。2. 將標(biāo)本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘，蒸餾水沖洗2-3次，甩干。3將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1甲酸溶液中，混勻后立即滴45（5ml）滴至玻片標(biāo)本上。4. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將

39、玻片標(biāo)本放在牙簽上。5. 在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙，用鑷子掀動紙片數(shù)次，使染液均勻分散在標(biāo)本上。6. 將平皿置于60水浴箱中處理3-5分鐘，直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應(yīng)。7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙，以1：20 Giemsa染液復(fù)染3分鐘。水洗，氣干。8. 鏡下觀察?！緦嶒灲Y(jié)果與分析】1. Ag-NOR的計數(shù)：選擇銀染著色清晰的分裂相，計數(shù)6個D組（13、14、和15號染色體）和4個G組（21和22號染色體）近端著絲粒染色體，不論單側(cè)或雙側(cè)的銀染點都計數(shù)為一個有銀染的染色體。2. Ag-AA計數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的，均計數(shù)為Ag-AA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，記為

40、1個Ag-AA；涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的，記為2個Ag-AA；3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時，記為3個Ag-AA；依此類推。N個核型中含NOR染色體數(shù)之和NOR均值= N個核型（注：避免AgNO3 溶液污染皮膚，否則將其染成褐黑色，很難洗掉。）實驗五核酸提取The Extraction of Nucleic Acid【實驗?zāi)康摹?掌握核酸提取的基本原理和基本方法2掌握檢測核酸濃度及純度的原理及方法【實驗原理】DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的

41、工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實驗。在DNA提取過程中應(yīng)做到：1、根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提，在單價陽離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。作DNA或RNA定量時，應(yīng)在260nm和280nm兩個波長下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計算樣品中的核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50g/ml雙鏈DNA，40g/ml單鏈DNA或RNA及大約20g/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)

42、在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0，如果樣品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值，此時無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量?！緦嶒炗闷贰?臺式離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計；一次性塑料手套。2微量加樣器（1000l,200l，20l）；Tip頭（1000l,200l，20l）。Tip頭盒（1000l,200l，20l）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。3DNA提取的相關(guān)試劑：1） 蛋白酶K（10mg/ml）,-20保存。2） TE（

43、pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）,15磅高壓滅菌后室溫保存。3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加熱68助溶，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加蒸餾水定容至100ml，室溫保存。4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。5）飽和氯化鈉，70%乙醇，氯仿6）飽和酚【實驗步驟】飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA1取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；2室溫離心，10000rpm ，1分鐘；3棄上清，加

44、入0.4ml TE(pH 8.0)， 混勻，懸浮細(xì)胞；4加入10mg/ml蛋白酶K 5l（終濃度100g/ml）,10% SDS 25l(終濃度0.5%)，混勻；537水浴消化過夜，或50消化4小時；6加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4靜置10分鐘；710000rpm離心10分鐘，取上清于另一新管中；8加入等體積氯仿，混勻，10000rpm離心10分鐘；9取上清于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；10加入2倍體積無水乙醇輕輕混合，10000rpm離心1分鐘；11棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；1210000rpm離心1分鐘，棄上清，自然干燥DN

45、A約5分鐘；13加入200-250l TE，-20保存；14檢測濃度及純度。酚氯仿抽提法提取外周血DNA1外周血反復(fù)凍溶破壞紅細(xì)胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混勻后，10000rpm 離心10分鐘；2棄上清，加入180l TE(pH 8.0)，20l 10% SDS,10mg/ml蛋白酶K 5l（終濃度100g/ml）混勻；337水浴消化過夜，或50消化4小時；4加入等體積的飽和酚并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；5吸取上清液于另一新管中，重復(fù)上一步驟一次；6吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；7吸取上清液于另一新管中，加

46、入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后，加入2倍體積無水乙醇并輕輕混合，可見絮狀乳白色DNA團(tuán)塊，10000rpm離心10分鐘；8棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；9. 10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TE液，-20保存；10檢測濃度及純度組織總RNA的提取 1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min，擊碎后回收入2ml無菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿,樣品體積不應(yīng)超過TRIZOL試劑體積的10%；2.將組織勻漿液在15-30放置5min,促使核蛋白復(fù)合物完全解離,按1ml TRIZO

47、L,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30放置2-3min,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30放置10min,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心10min；4.棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過7500g,離心5min；5.室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55-60溫浴10min).6.紫外分光光

48、度計檢測RNA濃度和純度；7.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，每孔上樣25g，65V，2.5h，以檢測RNA的質(zhì)量?！緦嶒灲Y(jié)果分析】1. 計算已提取的DNA的濃度和純度【思考題】1DNA提取還有哪些方法？2RNA提取中關(guān)鍵問題是什么？實驗六 DNA重組技術(shù)Recombinant DNA【實驗?zāi)康摹?掌握DNA重組技術(shù)的基本原理和基本方法2熟悉質(zhì)粒DNA的小量制備及酶切鑒定方法【實驗原理】1DNA重組技術(shù) 重組DNA(Recombinant DNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個步驟：1） 重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA

49、或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設(shè)計一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。2） 將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。3） 克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，

50、得到大量含重組DNA的細(xì)菌。4） 收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。圖2.1 TA克隆原理示意圖圖2.2 克隆選擇增殖原理示意圖2質(zhì)粒DNA的小量制備常見的質(zhì)粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH 12.012.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過離心，將

51、可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。3質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物體內(nèi)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能特性分為：、型。型切點不固定，型其切割位點在識別位點之外，只有型其特異性切點位置可以控制和預(yù)測，可以產(chǎn)生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為型限制酶。這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DNA雙鏈，形成一定長度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對重組的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用已知相對分子量的線狀DNA（DNA分子量標(biāo)志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對照，可以對重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的DNA分子進(jìn)行初步鑒定?！緦嶒炗闷贰?PCR擴(kuò)增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；超凈工作臺；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速離心