中國藥典微生物限檢查方法驗證方案

1、人工牛黃甲硝唑膠囊微生物限度檢查方法驗證方案起草部門：QC組簽名：日期：審核部門：QC組簽名：日期：部門：質(zhì)量部簽名：日期：批準質(zhì)量負責人簽名：日期：質(zhì)量部頒發(fā)本文件根據(jù)需要應分發(fā)于以下部門：01 質(zhì)量部下表用于記錄修訂/變更主要內(nèi)容及歷史。文件編號修訂原因修訂日期TS-VP-4201-00按GMP（2010年修訂版）要求新制定目 錄1. 概述2. 驗證目的和范圍3. 組織及職責4. 驗證進度計劃表5. 驗證所需要的儀器設備及相關(guān)文件的確認6. 驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認7.驗證項目和驗證方法7.1試驗菌株7.2需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證的菌液制備7.3需氧菌總

2、數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法7.4需氧菌總數(shù)檢查方法驗證離心沉淀-薄膜過濾法7.5控制菌檢查方法驗證離心沉淀-薄膜過濾法8.偏差與漏項控制9.驗證報告會審1. 概述我公司生產(chǎn)品種人工牛黃甲硝唑膠囊，產(chǎn)品微生物限度檢查項目為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、以及大腸埃希菌檢查和沙門菌檢查。參照中國藥典2015版四部附錄1105：微生物計數(shù)法，以及1106：控制菌檢查法的規(guī)定，本公司對該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法予以驗證。通過驗證以確認所采用的微生物限度檢查方法適用。人工牛黃甲硝唑膠囊處方中含有甲硝唑、人工牛黃以及常用輔料成分，文獻資料介紹甲硝唑?qū)毦幸志匦裕瑢γ咕徒湍妇鸁o

3、抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通過離心沉淀-薄膜過濾法去除其對微生物生長的影響。本驗證方案通過試驗菌株的回收率測試，首先確認常規(guī)傾注平皿法是否適用于本品的微生物限度檢查；如常規(guī)傾注平皿法不適用，則進一步驗證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的微生物限度檢查。本驗證方案根據(jù)樣品特性制定微生物限度檢查方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。2. 驗證目的和范圍驗證該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法的適用性，對其有效性進行評價，保證檢驗結(jié)果的可靠性。本驗證方案采用3批按GMP要求組織生產(chǎn)的人工牛黃甲硝唑膠囊，進行微生物限度檢查方法的驗證。3.組織及職責

4、3.1驗證方案和驗證報告的起草、審核、批準驗證方案由質(zhì)量部QC組負責起草，由質(zhì)量部審核，最終由質(zhì)量負責人批準。驗證方案實施完成后，由QC組負責匯總微生物限度檢查法驗證的結(jié)果、撰寫報告，由質(zhì)量部審核，最終由質(zhì)量負責人批準報告。3.2驗證方案的培訓驗證方案在經(jīng)質(zhì)量負責人批準后，由QC組組長對本次驗證實施的相關(guān)人員組織培訓工作，并將該次的培訓記錄歸檔。3.3驗證方案實施過程中的變更和偏差驗證方案實施過程中如有變更和偏差，質(zhì)量負責人應當組織進行評估并采取相應的控制措施。3.4 驗證工作小組成員表姓名部門及職務職 責黃漢新質(zhì)量負責人/質(zhì)量受權(quán)人負責驗證方案及報告的批準胡建新質(zhì)量部QA組長審核驗證方案、審

5、核驗證報告并協(xié)調(diào)工作曾鳳敏質(zhì)量部QC組長負責驗證方案審核、實施、匯總報告及培訓工作劉紅華質(zhì)量部QC負責驗證方案起草、具體實施、報告工作4. 驗證進度計劃表 本次微生物限度檢查方法驗證的計劃安排時間是2015年12月至2016年1月。5. 驗證所需要的儀器設備及相關(guān)文件的確認5.1.主要檢驗儀器設備確認表序號儀器設備名稱型 號編號校準單位校準日期有效期至1電子天平2生化培養(yǎng)箱3生化培養(yǎng)箱4生化培養(yǎng)箱5立式壓力蒸汽滅菌鍋6生物潔凈安全柜檢查人/日期： 復核人/日期：5.2.驗證所需文件的確認表文件名稱文件編碼是否有效版本文件保存處人工牛黃甲硝唑膠囊內(nèi)控質(zhì)量標準是 否質(zhì)量部人工牛黃甲硝唑膠囊檢驗操作

6、規(guī)程是 否質(zhì)量部取樣操作規(guī)程是 否質(zhì)量部微生物限度檢查操作規(guī)程是 否質(zhì)量部微生物實驗室清潔消毒操作規(guī)程是 否質(zhì)量部培養(yǎng)基的管理制度是 否質(zhì)量部檢定菌的保存、傳代、使用、銷毀規(guī)程是 否質(zhì)量部LDZX-30FBS立式壓力壓蒸汽滅菌器操作規(guī)程是 否質(zhì)量部SPX-150B生化培養(yǎng)箱操作規(guī)程是 否質(zhì)量部BHC-1300IIA/B3生物潔凈安全柜操作規(guī)程是 否質(zhì)量部JJ200電子天平操作規(guī)程是 否質(zhì)量部檢查人/日期： 復核人/日期：6. 驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認6.1.試驗菌種檢查表序號菌種名稱代碼凍干菌種批號來源1金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003中國食品藥品檢定研究院2銅綠假單胞菌

7、CMCC（B）10104中國食品藥品檢定研究院3枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501中國食品藥品檢定研究院4白色念珠菌CMCC（F）98001中國食品藥品檢定研究院5黑曲霉CMCC（F）98003中國食品藥品檢定研究院6大腸埃希菌CMCC（B）44102中國食品藥品檢定研究院7乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094中國食品藥品檢定研究院檢查人/日期： 復核人/日期：6.2試驗所需的培養(yǎng)基檢查序號名稱生產(chǎn)廠家是否通過培養(yǎng)基適用性試驗批號01胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否02胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否03沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否04沙氏葡

8、萄糖瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否05麥康凱液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否06麥康凱瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否07RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否08木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否09三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司是 否檢查人/日期： 復核人/日期：6.3. 檢驗樣品確認表序號品名生產(chǎn)廠家批號規(guī)格是否按GMP要求生產(chǎn)1人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.2g人工牛黃5mg是 否2人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.2g人工牛黃5mg是 否3人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.

9、2g人工牛黃5mg是 否檢查人/日期： 復核人/日期：7.驗證項目和驗證方法7.1試驗菌株人工牛黃甲硝唑膠囊需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證所用的菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌檢查方法驗證所用的菌株為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌。試驗菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.2 需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證的菌液制備分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉

10、溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌懸液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng)23天，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，制成50100cfu/ml的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，2025培養(yǎng)57天，直到獲得豐富的孢子。加入35ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸至無菌試管中，取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7

11、，制成50100cfu/m的孢子懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 ,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。7.3. 需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法.供試液的制備 取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液。.試驗組取1：10的供試液1ml和7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球

12、菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。另取1：10的供試液1ml和7.2項下制備的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過45的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置2025培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。7.3.3.供試品對照組取1：10的供試液1ml注入平皿中，立即傾注不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。另取1：10的供試液1ml注入平皿中，立即傾注不超過45的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置2025

13、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。7.3.4.菌液對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。另取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項下制備的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過45的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備2個平皿。置2025培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。7.3.5. 常規(guī)傾

14、注平皿法方法驗證的接受標準試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值(即試驗菌的回收率)應在0 .52 范圍內(nèi)。7.3.6. 常規(guī)傾注平皿法方法驗證的結(jié)果7.3.6.1. 常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)2：

15、 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)3： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值

16、12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：7.3.6.2. 常規(guī)傾注平皿法測定霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)2： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率1

17、2均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)3： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：7.3.7. 常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗證小結(jié)按照驗證方案的要求進行試驗，若各試驗菌株的回收率在0.52范圍內(nèi)，則可確認常規(guī)傾注平皿法適用于本品的需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)檢查。如常規(guī)傾注平皿法適用于霉菌與酵母菌總數(shù)檢查，但不適用于需氧菌總數(shù)檢查，則下

18、面進一步驗證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。7.4. 需氧菌總數(shù)檢查離心沉淀-薄膜過濾法7.4.1.供試液的制備 取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml，經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液得供試液。7.4.2.試驗組取供試液1 ml，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次），然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入7.2項下制備的50100c

19、fu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。7.4.3.供試品對照組取供試液1 ml，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次），平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035倒置培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。7.4.4.菌液對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300 ml，200ml通過薄膜（孔徑0.45m

20、混合纖維素膜）后，在余下的100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中加入7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。7.4.5.稀釋劑對照組依照7.2項下菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液，將各菌液稀釋至含菌50100cfu/ml，然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1 ml，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，

21、以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次），每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。. 離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗證的接受標準試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值(即試驗菌的回收率)應在0 .52 范圍內(nèi)，同時稀釋劑對照組與菌液對照組菌落數(shù)的比值應也在0 .52 范圍內(nèi)。.離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗證的結(jié)果試驗次數(shù)1： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號：

22、培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對照組試驗組各菌株回收率稀釋劑對照組各菌株回收率12均值112均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)2： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對照組試驗組各菌株回收率稀釋劑對照組

23、各菌株回收率12均值112均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)3： 人工牛黃甲硝唑膠囊批號: ；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號 ；培養(yǎng)溫度： ；培養(yǎng)時長：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對照組試驗組各菌株回收率稀釋劑對照組各菌株回收率12均值112均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期： 復核人/日期：7.4.8. 離心沉淀-薄膜過濾測定需氧菌總數(shù)方法驗證小結(jié)按照驗證方案的要求進行

24、試驗，若試驗組各試驗菌株的回收率在0.52范圍內(nèi)，稀釋劑對照組各試驗菌株的的回收率也在0.52范圍內(nèi)，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗證過的供試液制備方法及計數(shù)方法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)。7.5.控制菌檢查方法驗證離心沉淀-薄膜過濾法若在7.3需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法的試驗中，證實了人工牛黃甲硝唑膠囊有抑菌性，不能使用常規(guī)傾注平皿法進行需氧菌總數(shù)檢查，則為了確保控制菌檢查的可靠性，采用可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法進行控制菌檢查，按照以下方案進行方法學驗證。7.5.1試驗菌株人工牛黃甲硝唑膠囊質(zhì)量標準中

25、規(guī)定檢查的控制菌為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌，所以選擇這兩種菌株進行控制菌檢查的方法學驗證。試驗菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.5.2 控制菌檢查方法驗證的菌液制備分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7,制成50100cfu/ml的菌懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。大腸埃希菌檢

26、查方法驗證供試液的制備 取供試品10g，加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，振搖，制成1：10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml，經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘，取上清液得供試液。7.5.3.2.試驗組取供試液10ml，加至100 ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次），然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入7.5.2項下制備的50100cfu的大腸埃希菌，過濾。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中

27、,4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。7.5.3.3陽性對照組照7.5.2項下菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液，將大腸埃希菌液稀釋至含菌50100cfu/ml，然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1 ml，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。取上述增

28、菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。7.5.3.4陰性對照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液300 ml，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。陰性對照應無菌生長。7.5.3.5離心沉淀-薄膜過濾法測定大腸埃希菌方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號: 大腸埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號） 過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨

29、液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板 配制批號 培養(yǎng)箱型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 培養(yǎng)時間開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)2：人工牛黃甲硝唑膠囊批號: 大腸埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號） 過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板 配制批號 培養(yǎng)箱型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 培養(yǎng)時間開始 月 日 時結(jié)束 月

30、日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期： 復核人/日期：試驗次數(shù)3：人工牛黃甲硝唑膠囊批號: 大腸埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號） 過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板 配制批號 培養(yǎng)箱型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 型號 編號 溫度 培養(yǎng)時間開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時開始 月 日 時結(jié)束 月 日 時試驗組陽性對照組陰性對照組試驗人/日期： 復核人/日期：大腸埃希菌檢查方法驗證結(jié)果小結(jié)按照驗證方案的要

31、求進行試驗，若試驗組與陽性對照組均檢出典型大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的大腸埃希菌檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗證過的供試液制備方法及大腸埃希菌檢查方法進行檢查。7.5.4沙門菌檢查方法驗證7.5.4.1供試液的制備取樣品10g加0.9%無菌氯化鈉溶液至100 ml制成1:10的供試液。取全部供試液經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘，取全部上清液為供試液。.2.試驗組取全部供試液，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次）。然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入

32、7.5.2項下制備的50100cfu的乙型副傷寒沙門菌，過濾。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,3035培養(yǎng)1824小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時。7.5.4.3陽性對照組照7.

33、5.2項下菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液，將乙型副傷寒沙門菌液稀釋至含菌50100cfu/ml，然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1 ml，加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,3035培養(yǎng)1824小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1848

34、小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時。.4陰性對照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液300 ml，全量通過薄膜（孔徑0.45m混合纖維素膜）后，取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。陰性對照應無菌生長。7.5.4.5離心沉淀-薄膜過濾法測定乙型副傷寒沙門菌方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1：人工牛黃甲硝唑膠囊批號: 乙型副傷寒沙門菌對照菌來源 批號（菌種編號） 過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 配制批號 RV沙門增菌液體培養(yǎng)基配制