單克隆抗體和基因工程抗體的制備

1、第四章第四章 單克隆抗體與基因單克隆抗體與基因 工程抗體的制備技術工程抗體的制備技術 李聞文李聞文 2013 ,10 中南大中南大學學湘雅湘雅醫(yī)學醫(yī)學院院檢驗檢驗系系 臨臨床微生物床微生物學學免疫免疫學教研學教研室室目的要求目的要求1. 掌握雜交瘤技術的基本原理掌握雜交瘤技術的基本原理2. 熟悉單克隆抗體的制備技術熟悉單克隆抗體的制備技術3. 熟悉基因工程抗體技術熟悉基因工程抗體技術 大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，簇（表位，epitope）。一個抗原決定）。一個抗原決定簇刺激一個簇刺激一個B細胞克隆產生一種特異細胞克隆產生一種特異性抗體，一種抗原刺激機體

2、產生多種性抗體，一種抗原刺激機體產生多種抗體稱為多克隆抗體（抗體稱為多克隆抗體（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一個）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的只識別一種抗原表位的B細胞克隆產細胞克隆產生的同源抗體稱為單克隆抗體生的同源抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)。概概 述述 單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結合部位完全相同，生物活性專一，特異性結合部位完全相同，生物活性專一，特異性強，純度高，效價高，易于實驗標準化及大強，純度高，效價高，易于實驗標準化及大量制備，是研究抗體的一重大突破

3、。應用比量制備，是研究抗體的一重大突破。應用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植及自身免疫病等。及自身免疫病等。 第一節(jié)第一節(jié) 雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術的基本原理 基本原理是融合的兩種細胞保持基本原理是融合的兩種細胞保持自身的特性，產生具有原來兩個細自身的特性，產生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞稱為雜交胞基因信息的單個核細胞稱為雜交細胞。包括細胞。包括B細胞、細胞、T細胞，前者產細胞，前者產生生Ig，后者產生，后者產生CK。 一、B 淋巴細胞雜交瘤技術 細胞是經抗原免疫的小鼠脾細胞和細胞是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。小鼠骨髓瘤細

4、胞。B B細胞能產生抗體，細胞能產生抗體，但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細胞但不能在體外長期生長，而骨髓瘤細胞不產生抗體但在體外能長期生長，二者不產生抗體但在體外能長期生長，二者融合，各保持其本性，既產生抗體又長融合，各保持其本性，既產生抗體又長期生長。期生長。 其原理分為幾個步驟其原理分為幾個步驟 目的是制備抗原特異的目的是制備抗原特異的 McAbMcAb，所，所以融合的細胞必須經抗原免疫的以融合的細胞必須經抗原免疫的B B細胞，細胞，通常取脾，另一是在體外長期生長又通常取脾，另一是在體外長期生長又不產生抗體，所以選腫瘤細胞即多發(fā)不產生抗體，所以選腫瘤細胞即多發(fā)性骨髓瘤細胞，具備以下特點：性

5、骨髓瘤細胞，具備以下特點： （一）細胞的選擇與融合 1. 1. 穩(wěn)定、易培養(yǎng)穩(wěn)定、易培養(yǎng) 2. 2. 自身不分泌自身不分泌IgIg或或CKCK 3. 3. 融合率高融合率高 4. 4. 是是HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株 目前常用的目前常用的BALB/cBALB/c小鼠小鼠B B細胞瘤株有細胞瘤株有P3-P3-X63-Ag8.653CX63-Ag8.653C（P3.653P3.653）、）、Sp2Sp2/ /0 0等。為等。為HATHAT敏感株，易培養(yǎng)敏感株，易培養(yǎng), , 融合率高，最常選用融合率高，最常選用聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)使細胞膜輕度損傷，細胞容使細胞膜輕度損傷，細胞容

6、易融合。易融合。 （二）選擇培養(yǎng)基的應用（二）選擇培養(yǎng)基的應用 細胞融合是一個隨機的物理過程。融合后可細胞融合是一個隨機的物理過程。融合后可能出現(xiàn)以下情況能出現(xiàn)以下情況: : 1 1）脾細胞與瘤細胞）脾細胞與瘤細胞 2 2）瘤細胞與瘤細胞）瘤細胞與瘤細胞 3 3）脾細胞與脾細胞）脾細胞與脾細胞 4 4）未融合的脾細胞）未融合的脾細胞 5 5）未融合的瘤細胞）未融合的瘤細胞 6 6）多聚體形式。）多聚體形式。 3 3）、）、4 4）、）、6 6）在體外易死去，不需篩選。）在體外易死去，不需篩選。細胞的細胞的 DNA 合成一般有兩條途徑合成一般有兩條途徑 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物一是糖和氨

7、基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，進一步合成合成核苷酸，進一步合成 DNA，葉酸是，葉酸是重要輔酶。重要輔酶。 一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶嘧啶存在下，經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶（hypoxanthine guanine hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRTphospheribosyl transferase,HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶（胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine thymidine kinase,TKkinase,TK）的催化作用）的催

8、化作用合成合成 DNA。 氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當氨基蝶氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當氨基蝶呤存在時，能阻斷第一條途徑。細胞融合呤存在時，能阻斷第一條途徑。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成分，次黃嘌的選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成分，次黃嘌呤呤(hypoxanthine,H)(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopoterin,A)(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)(thymidine,T)，三者取前綴縮寫為，三者取前綴縮寫為 HAT HAT 培養(yǎng)基，其融合細胞所用的瘤細胞是經毒培養(yǎng)基，其融合細胞所用的瘤細胞是經毒性培養(yǎng)基

9、選擇出來的性培養(yǎng)基選擇出來的 HGPRT HGPRT 陰性細胞株。陰性細胞株。 所以，前面提到的所以，前面提到的 2）瘤細胞與瘤細）瘤細胞與瘤細胞及胞及 5) 未融合的瘤細胞不能生長，只有未融合的瘤細胞不能生長，只有 1）脾細胞與瘤細胞才能生長，因為脾細胞為脾細胞與瘤細胞才能生長，因為脾細胞為 HGPRT 陽性，通過補償途徑代替氨基蝶呤陽性，通過補償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。阻斷的主要途徑。 （三）有限稀釋與抗原特異性選擇（三）有限稀釋與抗原特異性選擇 在免疫動物時，一種抗原往往有多個表在免疫動物時，一種抗原往往有多個表位位 ，一個，一個B B細胞克隆接受一個表位，故在細胞克隆接受一個表

10、位，故在免疫動物時是眾多免疫動物時是眾多 B B 細胞克隆的抗體的分細胞克隆的抗體的分泌，而針對目的抗原的泌，而針對目的抗原的B B細胞只占很少部分細胞只占很少部分，在細胞融合后，有相當一部分是無關的，在細胞融合后，有相當一部分是無關的細胞融合體，即融合細胞分泌的不是目的細胞融合體，即融合細胞分泌的不是目的抗體，要進行篩選，分二步稀釋?？贵w，要進行篩選，分二步稀釋。 計數(shù)，每個孔只放一個細胞，實際是計數(shù)，每個孔只放一個細胞，實際是0至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細胞至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細胞株重復一次，盡量使抗體更純，將陽性細株重復一次，盡量使抗體更純，將陽性細胞進行增殖，部分凍存

11、，部分進行體外培胞進行增殖，部分凍存，部分進行體外培養(yǎng)或動物接種。養(yǎng)或動物接種。 另外還有其他雜交瘤技術，如人另外還有其他雜交瘤技術，如人- -人人 B B 淋巴細胞雜交瘤和鼠淋巴細胞雜交瘤和鼠- -人人 B B 淋巴細胞雜淋巴細胞雜交瘤，人骨髓瘤細胞系體外建株比較困難，交瘤，人骨髓瘤細胞系體外建株比較困難，生長不穩(wěn)定，有的分泌生長不穩(wěn)定，有的分泌 IgEIgE，有的分泌，有的分泌 Ig Ig 的的、鏈。鏈。B B細胞取外周血淋巴細胞、細胞取外周血淋巴細胞、脾細胞、淋巴結細胞、病灶浸潤性淋巴細脾細胞、淋巴結細胞、病灶浸潤性淋巴細胞。從理論上講很好，但實際比較困難，胞。從理論上講很好，但實際比較

12、困難，在于缺乏好的親體骨髓瘤細胞株，較難獲在于缺乏好的親體骨髓瘤細胞株，較難獲得抗原特異性得抗原特異性B B淋巴細胞；人雜交瘤細胞淋巴細胞；人雜交瘤細胞不能在小鼠或其他動物體內生長。不能在小鼠或其他動物體內生長。 小鼠骨髓瘤與人的小鼠骨髓瘤與人的B細胞雜交瘤，該技細胞雜交瘤，該技術優(yōu)點是易獲得小鼠骨髓瘤細胞，融合率術優(yōu)點是易獲得小鼠骨髓瘤細胞，融合率較高，但最大的缺點是不同種雜交后不穩(wěn)較高，但最大的缺點是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。染色體。二、二、T 細胞雜交瘤細胞雜交瘤 自自 B B 細胞雜交瘤技術后，細胞雜交瘤技術后，T

13、T 淋巴細胞淋巴細胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究入地研究T T細胞的各種功能，雖然有一些小細胞的各種功能，雖然有一些小鼠鼠T T細胞雜交瘤成功的報道，但結果不滿意，細胞雜交瘤成功的報道，但結果不滿意，該細胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，該細胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，一種一種T T細胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，細胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，到目前仍無突破性進展。到目前仍無突破性進展。 T T 淋巴細胞雜交瘤分為小鼠及人，淋巴細胞雜交瘤分為小鼠及人，由于由于 T T 細胞功能的多樣化，制備出的細胞功能的多樣化，制備出的 T T

14、細胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋細胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應性等。其基本過程是將激子，自身反應性等。其基本過程是將激活的活的T T細胞與酶缺陷型細胞與酶缺陷型T T淋巴細胞瘤細胞淋巴細胞瘤細胞融合，可表達特異性融合，可表達特異性 TCR TCR 或其他功能或其他功能的雜交瘤的雜交瘤T T細胞，與細胞，與 B B 細胞相以，但細細胞相以，但細胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡介主要步驟定，簡介主要步驟 。1. 1. 淋巴瘤細胞系的選擇淋巴瘤細胞系的選擇1 1）體外無限制快速

15、生長）體外無限制快速生長2 2）融合率高）融合率高3 3）不分泌淋巴因子和殺傷功能）不分泌淋巴因子和殺傷功能4 4）缺乏某一特異性表面抗原或受體）缺乏某一特異性表面抗原或受體5 5）HGPRT HGPRT 酶缺陷型酶缺陷型 2.2.特異性特異性T T細胞的制備與純化主要有細胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導激活的可溶性抗原誘導激活的 T T 細胞、同種反細胞、同種反應性應性T T 細胞、人的特異性細胞、人的特異性 T T 細胞。細胞。 3.T 3.T 細胞雜交瘤的篩選細胞雜交瘤的篩選 通常在含有通常在含有HATHAT選擇培養(yǎng)基上，選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產生淋巴因子的用特異性抗體篩選產生

16、淋巴因子的雜交瘤細胞，用抗雜交瘤細胞，用抗 CD3-TCR CD3-TCR 抗體抗體篩選陽性細胞。篩選陽性細胞。 三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)三、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng) 雜交瘤細胞形成的初期很不穩(wěn)定，雜交瘤細胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細胞有鼠的二倍體細胞有4040對染色體，雜交后對染色體，雜交后8080對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。 將陽性細胞進行單細胞培養(yǎng)，反復將陽性細胞進行單細胞培養(yǎng)，反復23次，確保為一單細胞陽性雜交瘤細胞應及次，確保為一單細胞陽性雜交瘤細胞應及時凍存，以防止

17、細胞染色體丟失，發(fā)生變時凍存，以防止細胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（異或污染，凍存于液氮（-196）,凍存時凍存時加小牛血清至加小牛血清至20%, 加幾滴加幾滴10%二甲亞砜。二甲亞砜。 雜交瘤細胞培養(yǎng)可用液體、半固體、雜交瘤細胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動物腹腔。接種動物腹腔。第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體的制備技術單克隆抗體的制備技術 McAb McAb 單一、特異、純化，利用雜交單一、特異、純化，利用雜交瘤技術制備瘤技術制備McAbMcAb的基本原理是三個原則：的基本原理是三個原則： 1 1）一種單克隆產生一種抗體）一種單克隆產生一種抗體 2 2）雜交瘤細胞保持雙親細胞特性）雜交瘤

18、細胞保持雙親細胞特性 3 3）篩選培養(yǎng)基）篩選培養(yǎng)基 一、單克隆抗體的產生一、單克隆抗體的產生 1. 1. 動物體內生長動物體內生長 雜交瘤細胞注射同系小鼠腹腔，先雜交瘤細胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，增多，1 12 2周后無菌方法抽取腹水，離周后無菌方法抽取腹水，離心取上清。心取上清。 2. 2. 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據培較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據培養(yǎng)時間、細胞生長情況收取上清液。另有養(yǎng)時間、細胞生長情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內增加細胞的培高密度培養(yǎng)，在單位體積內增加細胞的培養(yǎng)數(shù)量

19、。養(yǎng)數(shù)量。 二、單克隆抗體的純化二、單克隆抗體的純化 腹水或細胞上清液，均含有脂蛋白、脂腹水或細胞上清液，均含有脂蛋白、脂質及細胞碎片等雜質，用濾紙去掉脂質和大質及細胞碎片等雜質，用濾紙去掉脂質和大顆粒，離心去除細胞碎片和蛋白聚合物。顆粒，離心去除細胞碎片和蛋白聚合物。 目前純化方法有十幾種，一般采用鹽目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常用用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯(lián)。稱為聯(lián)。稱為 Sepharose 柱，抗體

20、結合上去，然柱，抗體結合上去，然后洗脫。后洗脫。 三、單克隆抗體的性質鑒定三、單克隆抗體的性質鑒定 鑒定的方法很多，用已知抗原測鑒定的方法很多，用已知抗原測定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應試驗都可以作，如陽性，再定量，試驗都可以作，如陽性，再定量，確定工作濃度。確定工作濃度。 第三節(jié)第三節(jié) 基因工程抗體技術基因工程抗體技術 雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預防和蛋白質提純應用中非常廣泛，預防和蛋白質提純應用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應用基因工程技術減少小鼠源成分，應用基因工程技術減少小鼠源成分

21、，保留原有的抗體特異性。保留原有的抗體特異性。一、人源化抗體一、人源化抗體 人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆及體的基因克隆及 DNA DNA 重組技術改造，重組技術改造，重新表達的抗體。其大部分氨基酸序列重新表達的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。了鼠異源性。 （一）人（一）人-鼠嵌合抗體鼠嵌合抗體 通過基因工程技術將人通過基因工程技術將人 IgG C IgG C 區(qū)與區(qū)與鼠鼠IgG V IgG V 區(qū)連接，導入細胞內

22、表達制備的抗區(qū)連接，導入細胞內表達制備的抗體稱為嵌合抗體，因體稱為嵌合抗體，因 IgG IgG 的抗原性在的抗原性在 C C 區(qū)，區(qū)，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，在介導在介導 CDC CDC 及及 ADCC ADCC 亦明顯增強。亦明顯增強。 1.1.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆 用探針從該雜交瘤細胞的基因組文用探針從該雜交瘤細胞的基因組文庫中調取。用庫中調取。用 PCR PCR 方法從該細胞的方法從該細胞的 RNA RNA 中擴增中擴增 V VH H 及及 V VL L 基因?；颉?2. 2. 表達載體的構建表達載

23、體的構建 人人- -鼠嵌合抗體的表達載體基因依可變區(qū)鼠嵌合抗體的表達載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達方式不同而分為兩類，從基因基因克隆的表達方式不同而分為兩類，從基因文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉錄調控文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉錄調控組件及內含子剪接信號，因此載體只需要包括組件及內含子剪接信號，因此載體只需要包括細胞內增殖所必須的抗生素抗性基因和質粒復細胞內增殖所必須的抗生素抗性基因和質粒復制的起始序列以及在真核細胞進行選擇的顯性制的起始序列以及在真核細胞進行選擇的顯性標記基因。標記基因。 將載體將載體 DNA DNA 導入真核細胞稱為轉染。導入真核細胞稱為轉染。導入的導入的 DNA

24、 DNA 整合至細胞基因組整合至細胞基因組 DNA DNA 中中得到轉染子，要得到穩(wěn)定的轉染子需利得到轉染子，要得到穩(wěn)定的轉染子需利用真核細胞的顯性選擇標記基因，這些用真核細胞的顯性選擇標記基因，這些標記基因使細胞獲得對某些細胞毒物質標記基因使細胞獲得對某些細胞毒物質的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應的細胞毒的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應的細胞毒物質可殺死轉染不成功的細胞，達到選物質可殺死轉染不成功的細胞，達到選擇的目的。擇的目的。 3.3.表達表達 用哺乳動物細胞或大腸桿菌表達量較少，用哺乳動物細胞或大腸桿菌表達量較少，而應用二氫葉酸還原酶（而應用二氫葉酸還原酶（dhfrdhfr）擴增系統(tǒng)使抗）擴增系統(tǒng)

25、使抗體表達增強。體表達增強。dhfr dhfr 是正常核酸代謝必須的酶，是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉鼠卵細胞（缺乏該酶的中華倉鼠卵細胞（ CHOCHO）需在有）需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用 DNA DNA 合成，合成，因此因此, dhfr , dhfr 作作 CHO CHO 的顯性選擇標記基因，在的顯性選擇標記基因，在無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導入入 dhfr dhfr 基因，細胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來基因，細胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來擴增導入的目的基因。擴增導入的目的基因。 ( ( 二二

26、) ) 改 形 抗 體 （改 形 抗 體 （ r e s h a p e d r e s h a p e d antibody,RABantibody,RAB） 應用基因工程技術在嵌合抗體基礎應用基因工程技術在嵌合抗體基礎上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗CDRCDR以外的骨架序列，重新構成既有鼠源單以外的骨架序列，重新構成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對人無免疫原性。抗體，該抗體對人無免疫原性。 （三）抗體的表面修飾（三）抗體的表面修飾 人和鼠人和鼠 IgVIgV區(qū)來自不同的種屬，輕鏈不同型區(qū)來自不同的

27、種屬，輕鏈不同型別 ， 互 補 性 決 定 區(qū)別 ， 互 補 性 決 定 區(qū) ( c o m p l e m e n t a r i t y ( c o m p l e m e n t a r i t y determining region,CDR) determining region,CDR) 的長度可不一致，的長度可不一致，但暴露于表面的但暴露于表面的AAAA殘基的位置數(shù)量都很保守，殘基的位置數(shù)量都很保守，通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將的異源性，將FvFv的表面人源化，消除其免疫原的表面人源化，消除其免疫原性而不影響性而不影

28、響 FvFv 的整體空間構象。的整體空間構象。 （四）雙特異性抗體（四）雙特異性抗體 雙特異性抗體（雙特異性抗體（bispecific bispecific antibody,BsAbantibody,BsAb）又稱雙功能抗體。兩個抗）又稱雙功能抗體。兩個抗原結合部位具有不同的特異性，可以同時原結合部位具有不同的特異性，可以同時與兩種不同特異性抗原發(fā)生結合。與兩種不同特異性抗原發(fā)生結合。 1.1.化學交聯(lián)化學交聯(lián)BsAbBsAb 分別分離純化兩種抗原的單抗，先使分別分離純化兩種抗原的單抗，先使IgIg解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體或其片

29、段交聯(lián)起來抗原特異性的單價抗體或其片段交聯(lián)起來。該方法易致抗體失活，其產物也難以保。該方法易致抗體失活，其產物也難以保證均質性。證均質性。 2.2.細胞工程細胞工程BsAbBsAb 將二種雜交瘤細胞進行融合產生雜交將二種雜交瘤細胞進行融合產生雜交瘤，核酸隨機組合多種多樣。瘤，核酸隨機組合多種多樣。 3.3.基因工程基因工程BsAbBsAb 用抗體分子片段如用抗體分子片段如ScFvScFv或或FabFab等，經基等，經基因操作修飾后，或體外組裝成為因操作修飾后，或體外組裝成為BsAbBsAb，或，或直接導入受體細胞表達分泌直接導入受體細胞表達分泌BsAbBsAb。 在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、

30、藥在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導細胞剎傷效應起重要作用。物剎傷、介導細胞剎傷效應起重要作用。 二、小分子抗體二、小分子抗體 具有結合抗原功能的分子片段稱為小具有結合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點：分子抗體。其優(yōu)點：1 1）可在原核細胞表）可在原核細胞表達，生產成本低達，生產成本低; 2; 2）易于穿透血管或組）易于穿透血管或組織到靶細胞部位，有利于疾病的治療；織到靶細胞部位，有利于疾病的治療；3 3）不含不含F(xiàn)c Fc 段，副作用小；段，副作用?。? 4）半衰期短，有）半衰期短，有利于毒素中和及清除。利于毒素中和及清除。 小分子抗體包括：抗原結合片段小分子抗體包括：抗原

31、結合片段（fragment of antigen binding,Fabfragment of antigen binding,Fab），），可變區(qū)片段（可變區(qū)片段（fragment of variable fragment of variable region,Fvregion,Fv）, ,單鏈抗體（單鏈抗體（single chain single chain Fv,ScFvFv,ScFv），單區(qū)抗體。另有），單區(qū)抗體。另有V VH H和和V VL。 1. Fab 由一條完整的由一條完整的 L L 鏈和約為鏈和約為1/21/2的的 H H 鏈組成，是完整抗體的鏈組成，是完整抗體的 1/31/

32、3，只有一個，只有一個Ag Ag 結合位點，它是將結合位點，它是將 McAb McAb 重鏈重鏈V V區(qū)和區(qū)和 C CH H1 1 區(qū)區(qū)cDNA cDNA 與完整輕鏈與完整輕鏈 cDNA cDNA 連接，在連接，在細胞啟動子的控制下分泌表達。細胞啟動子的控制下分泌表達。 2. Fv2. Fv和單鏈抗體（和單鏈抗體（ScFvScFv） Fv Fv 由由 V VH H 和和 V VL L 構成，非共價鍵結合，為完構成，非共價鍵結合，為完整抗體的整抗體的1/61/6，單一抗原結合位點，單一抗原結合位點，V VH H和和V VL L連接連接有三種方法：有三種方法：1 1）用戊二醛處理，使之交聯(lián)；）用戊

33、二醛處理，使之交聯(lián)；2 2）引入半胱氨酸殘基，使引入半胱氨酸殘基，使V VH H和和V VL L之間形成二硫鍵；之間形成二硫鍵；3 3）把）把V VH H和和V VL L用一段適當?shù)墓押塑账岱肿舆B接起用一段適當?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來，表達成一個單鏈，稱為來，表達成一個單鏈，稱為ScFvScFv。 3. 3. 單區(qū)抗體及最小識別單位單區(qū)抗體及最小識別單位 根據抗體分子的結構，一般將根據抗體分子的結構，一般將 FvFv 稱為抗稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結合抗原，體的最小單位，但有些更小亞單位仍結合抗原，如單獨重鏈如單獨重鏈 V VH H 仍可保留相當程度抗原結合能力，仍可保留相當程度抗

34、原結合能力，其作用比其作用比 V VL L 大，稱為單區(qū)抗體（大，稱為單區(qū)抗體（single single domain antibodydomain antibody），其親和力低于完整的），其親和力低于完整的 FvFv，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應用受到限制，但分子吸附，水溶性減低，其應用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前景的抗體部分。景的抗體部分。 將抗體分子片段與其他蛋白融合，將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，可得到有多樣

35、性生物功能的融合蛋白，有幾種構建方式：有幾種構建方式： 1 1）將）將 Fab Fab 或或 ScFvScFv與其他生物活與其他生物活性蛋白融合，建成生物導彈。性蛋白融合，建成生物導彈。 三、抗體融合蛋白三、抗體融合蛋白 2）在融合時可根據某些恒定區(qū)，可使）在融合時可根據某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學效應功能聯(lián)某些生物活性與抗體的生物學效應功能聯(lián)結在一起。結在一起。 3）將）將 ScFv 與某些細胞膜蛋白融合，形與某些細胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細胞結合抗原成嵌合受體，使細胞結合抗原 。 （一）含（一）含F(xiàn)vFv片段的抗體融合蛋白片段的抗體融合蛋白 將將 FvFv 與某些毒素、

36、酶及細胞因與某些毒素、酶及細胞因子等的基因連接，能編碼子等的基因連接，能編碼 FvFv 與毒素、與毒素、酶及細胞因子復合物，即生物導彈，酶及細胞因子復合物，即生物導彈，主要在于抗腫瘤。主要在于抗腫瘤。 （二）嵌合受體（二）嵌合受體 將將ScFv ScFv 與某些細胞膜蛋白分子融合，形與某些細胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達于細胞表面。其抗體部成的融合蛋白可表達于細胞表面。其抗體部分與相應抗原特異性結合。如將抗體的可變分與相應抗原特異性結合。如將抗體的可變區(qū)基因與區(qū)基因與TCRTCR的的鏈和鏈和鏈恒定區(qū)融合，將融鏈恒定區(qū)融合，將融合基因導入合基因導入T T細胞，既表達特異性抗體，又表細胞，

37、既表達特異性抗體，又表達達TCRTCR，該，該TCRTCR不受不受MHCMHC分子限制。分子限制。 （三）含（三）含 Fc Fc 的抗體融合蛋白的抗體融合蛋白 如將如將CD4CD4分子細胞膜外部分與分子細胞膜外部分與Fc Fc 融合后用真融合后用真核細胞表達，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細胞外，核細胞表達，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細胞外，產生二種功能：產生二種功能：1 1）延長在血循環(huán)中的半衰期；）延長在血循環(huán)中的半衰期；2 2）通過功能蛋白與配體分子的作用，將通過功能蛋白與配體分子的作用，將FcFc的生物學效的生物學效應引導至特定目的，如應引導至特定目的，如CD4CD4與與FcFc融合蛋白，

38、融合蛋白，CD4CD4是是T T輔助細胞表面糖蛋白，是輔助細胞表面糖蛋白，是HIV HIV 的受體，該融合蛋白的受體，該融合蛋白能競爭結合能競爭結合 HIVHIV，可阻斷，可阻斷 HIV HIV 對對T TH H 的感染，可介的感染，可介導導 ADCCADCC及及CDCCDC，可通過胎盤。，可通過胎盤。 小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（異性抗體。（bispecific antibody,BsAbbispecific antibody,BsAb），），雙價雙價S

39、cFvScFv與抗原結合比單價敏感性高，親和力與抗原結合比單價敏感性高，親和力大，結構和功能上都更接近親本抗體。大，結構和功能上都更接近親本抗體。BsAbBsAb分分子片段可從子片段可從FabFab、FvFv 或或 ScFvScFv 組建，可在體內或組建，可在體內或體外連接。體外連接。 四、雙特異性抗體四、雙特異性抗體 在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，如帶在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的鉸鏈區(qū)的 Fab 段或帶半胱氨酸殘基尾巴的段或帶半胱氨酸殘基尾巴的 ScFv，可，可在體外通過化學交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸在體外通過化學交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來構建

40、，兩個不同抗體連接成為功能抗體。鏈也可用來構建，兩個不同抗體連接成為功能抗體。如抗體如抗體 CD3 和抗和抗 IL-2R的的Fab 在體外直接介導在體外直接介導T細細胞對表達胞對表達 IL-2的細胞有殺傷作用。的細胞有殺傷作用。 （一）雙價抗體分子的構建（一）雙價抗體分子的構建1. 體外構建體外構建 對小分子抗體基因的改造修飾，使細胞對小分子抗體基因的改造修飾，使細胞直接表達雙抗體分子，比體外組建更有效，直接表達雙抗體分子，比體外組建更有效，現(xiàn)有以下幾種方法現(xiàn)有以下幾種方法: : 2. 雙抗體分子的細胞內組建雙抗體分子的細胞內組建 （1）設計促進雙聚體形成的結構域，半胱）設計促進雙聚體形成的結

41、構域，半胱氨酸是促進雙聚體形成的結構域，使小分子氨酸是促進雙聚體形成的結構域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達過程中形成雙抗體在大腸桿菌的分泌型表達過程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（體，亮氨酸拉鏈和甲基（CH3）亦有螺旋）亦有螺旋轉轉角角螺旋結構，使之成為雙體。螺旋結構，使之成為雙體。 （2）在基因構建上直接將兩個抗體分子片）在基因構建上直接將兩個抗體分子片段融合。段融合。 （3）雙體分子）雙體分子 兩個兩個 ScFv 的的 VH 和和 VL 相相互配對，可產生雙價的雙抗體分子?；ヅ鋵Γ僧a生雙價的雙抗體分子。 能同時結合兩種不同抗原，因而可介導能同時結合兩種不同抗原，因而可介導標記物與靶抗

42、原的結合，或某些高級分子標記物與靶抗原的結合，或某些高級分子定位于靶細胞。在臨床上有以下應用：定位于靶細胞。在臨床上有以下應用： （ 二）雙特異性抗體的應用二）雙特異性抗體的應用 1. 在免疫檢測中的應用在免疫檢測中的應用 一個臂結合靶一個臂結合靶抗原，另一個臂結合酶，不需用酶標記抗體抗原，另一個臂結合酶，不需用酶標記抗體，避免在標記過程中降低酶及抗體的活性。，避免在標記過程中降低酶及抗體的活性。 2. 在腫瘤放射免疫顯像中的應用在腫瘤放射免疫顯像中的應用 一個一個臂結合腫瘤細胞，另一個臂結合半抗原螯合臂結合腫瘤細胞，另一個臂結合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。 3. 3. 雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應雙特異性抗體介導的藥物殺傷效應 治療腫瘤生