基因工程原理第12章植物基因工程

1、無脊椎動物的DNA轉(zhuǎn)移 果蠅的P元件 P元件是果蠅的轉(zhuǎn)座元件，在特定的條件下，可在果蠅的生殖細(xì)胞中高度轉(zhuǎn)移 P-M雜種不育 P元件和側(cè)翼序列克隆到pBR322載體上，用于轉(zhuǎn)座1果蠅的早期胚胎發(fā)生2作為載體系統(tǒng)的P元件衍生物3植物基因工程 4Introduction 人們應(yīng)經(jīng)投入相當(dāng)?shù)呐砼嘤鞣N產(chǎn)量及營養(yǎng)價值提高的作為 玉米、小麥、水稻、其他食用植物和園藝品種 用于微生物系統(tǒng)的重組DNA技術(shù)，對植物同樣有效 植物細(xì)胞具有全能性5轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用 抗蟲、抗病毒傳染、抗除草劑、抗病原真菌和細(xì)菌、延緩衰老、環(huán)境壓力耐受、花色改變、種子中蛋白營養(yǎng)含量增加、收割后保質(zhì)期延長以及自交不親和性。 治療劑、

2、多聚體、診斷試劑，如抗體片段 口服疫苗6CellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cellPlant Genetic Engineering Process植物愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng) 愈傷組織的培養(yǎng) 外植體 平衡的植物激素8脫落酸脫落酸吲哚乙酸吲哚乙酸 生長素生長素愈傷組織愈傷組織 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基，加以攪動，細(xì)胞團(tuán)塊就會打碎，形成含有單個細(xì)胞、小的細(xì)胞叢和形體更大的細(xì)胞集合體的懸浮液9 原生質(zhì)體 將細(xì)胞的纖維素壁去除后余下的部分 由懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織或完整組

3、織獲得 原生質(zhì)體融合10可育植物的再生 外植體、愈傷組織、細(xì)胞懸浮液或原生質(zhì)體置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上使完整的可育植物再生。1112器官形成器官形成體細(xì)胞胚發(fā)生體細(xì)胞胚發(fā)生合子胚發(fā)生合子胚發(fā)生利用土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌是一種植物病原菌，可以在其正常的生命周期中，遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。 這種遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)致植物形成冠癭瘤，干擾受感染植物的正常生長。13 冠癭瘤的形成 農(nóng)桿菌可以在雙子葉植物的傷口處誘生冠癭瘤。 即使細(xì)菌被殺死后，愈傷組織仍可以體外培養(yǎng)，并保留腫瘤特性。14冠癭堿的代謝 冠癭病的重要特征 冠癭堿的類型由細(xì)菌株系決定15致瘤質(zhì)粒Ti 植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化狀態(tài)不需要農(nóng)桿菌的持續(xù)存在 “腫

4、瘤誘導(dǎo)要素” 根瘤農(nóng)桿菌的有毒菌株中含有大的質(zhì)粒 去除這些質(zhì)粒后，細(xì)菌的毒性和誘導(dǎo)冠癭堿的合成能力就會喪失， 當(dāng)有毒質(zhì)粒導(dǎo)入無毒菌株時，就會使菌株獲得以上特性 因此，這種質(zhì)粒稱作致瘤質(zhì)粒 Ti16 Ti質(zhì)粒限定了受轉(zhuǎn)化的植物組織中合成的冠癭堿的類型，也限定了細(xì)菌所利用的冠癭堿。17T-DNA轉(zhuǎn)化 植物腫瘤細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)完整的Ti質(zhì)粒，而是質(zhì)粒的一個小的特異片段，大約23kb 冠癭瘤的形成就是這一特定片段基因轉(zhuǎn)移、整合到植物細(xì)胞的基因組上，進(jìn)行表達(dá)的結(jié)果 T-DNA（轉(zhuǎn)移DNA） 這些基因不是轉(zhuǎn)化所必須的，并且可以為外源DNA取代18 T-DNA的長度在不同菌株的質(zhì)粒中是不同的，范圍大約是12

5、-24 kb T-DNA的兩側(cè)是25bp的不完全正向重復(fù)序列，稱作邊界序列 邊界序列與轉(zhuǎn)化過程有關(guān)，刪除右邊界序列使T-DNA不能轉(zhuǎn)化，左邊界序列可能是非必須的19轉(zhuǎn)化時所需的基因 對T-DNA轉(zhuǎn)化起作用的基因位于Ti質(zhì)粒上的一個獨立部分，叫做vir （毒性區(qū)域） 其中，virA和virC低水平組成型表達(dá)，并且控制其他vir基因的激活 virA是一個跨膜激酶，是受傷植物細(xì)胞釋放的某種酚類分子的受體20 酚類化合物并不吸引細(xì)菌到受損傷的植物細(xì)胞，而糖類和氨基酸則會誘導(dǎo)vir基因 VirA激活后，磷酸化VirC，VirC是其他vir基因的轉(zhuǎn)錄激活劑 vir基因的表達(dá)會合成用于形成接合纖毛的蛋白，通

6、過接合纖毛將T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞21 DNA的轉(zhuǎn)化是由virD1和virD2基因的產(chǎn)物形成的核酸內(nèi)切酶起始的 在T-DNA的25bp邊界區(qū)引入單鏈缺刻或者雙鏈斷裂 virD2蛋白保持共價的結(jié)合在加工過的T-DNA上 最終將DNA導(dǎo)入細(xì)胞核22 農(nóng)桿菌將基因?qū)胫参锘蚪M 農(nóng)桿菌還可以將DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入其他的細(xì)菌和酵母 基因從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的人類細(xì)胞也是可能的23Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 利用Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物的最簡單的辦法就是把目的基因插入到T-DNA，然后利用Ti質(zhì)粒和農(nóng)桿菌將該基因轉(zhuǎn)移和插入到易感的植物細(xì)胞的基因組中。24Ti質(zhì)粒的局限性 在培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的植物激素阻止它們再生成為成熟的植株

7、。 編碼冠癭堿的基因?qū)D(zhuǎn)基因植物沒有用處 Ti質(zhì)粒很大（200 800 kb） Ti質(zhì)粒在大腸桿菌中不能復(fù)制25卸甲Ti質(zhì)粒的衍生物用作植物載體T-DNA基因的功能 編碼生長素和冠癭堿生物合成所需要的酶26T-DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄27卸甲Ti載體 刪除T-DNA中包含的致瘤基因，將T-DNA卸甲為沒有致瘤性的載體，可以有效的使植物再生。28 利用冠癭堿產(chǎn)物篩選 引入顯性選擇標(biāo)記，通過藥物或者除草劑抗性篩選29共整合載體 卸甲Ti載體個體較大操作不便，酶切位點缺乏 “三親本交配”實現(xiàn)轉(zhuǎn)化30雙元載體 Ti質(zhì)粒的vir基因的功能是以反式方式來實現(xiàn)的 vir基因和包含轉(zhuǎn)化基因的卸甲T-DNA可以由不同

8、的質(zhì)粒提供雙元載體31根瘤農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化32農(nóng)桿菌與單子葉植物 大部分單子葉植物在農(nóng)桿菌的宿主范圍之外 受傷的單子葉植物不能產(chǎn)生足夠水平的酚類物質(zhì)來誘導(dǎo)vir基因表達(dá) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻是第一個得到轉(zhuǎn)化的谷類植物 單子葉植物的受傷位點傾向于木質(zhì)化 添加酚類物質(zhì)，增強毒性功能33高容量雙元載體 非常大的基因分析或者多基因的轉(zhuǎn)化 BIBAC2，包含一個F質(zhì)粒的復(fù)制起始位點，并且模仿細(xì)菌人工染色體 反式提供高水平的VirG和VirE的毒性輔助質(zhì)粒 TAC，模仿P1人工染色體的載體 用于由突變確定的基因的定位克隆34根毛農(nóng)桿菌與Ri質(zhì)粒 毛根農(nóng)桿菌引起植物毛狀根疾病，它是由根誘導(dǎo)質(zhì)粒（Ri）引發(fā)的 Ri質(zhì)

9、粒是類似于根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒 Ri T-DNA在植物中通過有性方式傳遞，并影響多種形態(tài)學(xué)和生理學(xué)性狀，但通常可能不具有毒性35DNA直接轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 擴(kuò)大農(nóng)桿菌的宿主范圍 聚乙二醇、電轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要限制不在于基因轉(zhuǎn)化過程本身，而是在于宿主物種從原生質(zhì)體再生的能力36基因槍 使用金屬顆粒包裹DNA，以足夠穿透細(xì)胞壁的速度打入植物細(xì)胞。 TMV轟擊洋蔥表皮 大豆、煙草、玉米 應(yīng)用范圍沒有限制，完全由物理參數(shù)控制37整株（in planta）轉(zhuǎn)化 減少對組織培養(yǎng)的需求 擬南芥 個體小，每株產(chǎn)生的種子多 種子在農(nóng)桿菌的培養(yǎng)物中浸泡吸取過夜，然后再進(jìn)行發(fā)芽 將細(xì)菌真空滲透進(jìn)擬南芥的花中 將受精時期的花浸泡在細(xì)菌懸液中38葉綠體轉(zhuǎn)化 T-DNA復(fù)合物往往都要進(jìn)入細(xì)胞核 衣藻，單個的大型葉綠體 顆粒轟擊 基因槍和聚乙二醇轉(zhuǎn)化實現(xiàn)有效的葉綠體轉(zhuǎn)化39植物病毒載體農(nóng)桿菌或DNA直接轉(zhuǎn)移的替代，具有以下優(yōu)點： 病毒可以吸附完整的植物細(xì)胞并將其核酸導(dǎo)入 感染細(xì)胞可以產(chǎn)生大量病毒，可以進(jìn)行高水平的基因表達(dá) 病毒感染通常是全系統(tǒng)的 病毒感染很快，幾周之內(nèi)就會產(chǎn)生大量的重組蛋白 植物病毒是游離型復(fù)制，不受位置效應(yīng)的影響40DNA病毒載體花椰菜花葉病毒 典型成員是CaMV 最大插入片段小于1kb41雙粒病毒 具有一對病毒粒子，它們含有兩個可以