纖維蛋白膠在骨修復(fù)過程中的應(yīng)用進(jìn)展

1、纖維蛋白膠在骨修復(fù)過程中的應(yīng)用進(jìn)展             作者：劉越，田學(xué)忠，張伯勛，崔賡   【關(guān)鍵詞】  纖維蛋白膠在骨修復(fù)過程中纖維蛋白黏合膠，又稱纖維蛋白封閉系統(tǒng)或纖維蛋白膠(fibrin glue, FG/fibrinfibronectin sealing system, FFSS/fibrin sealant, FS)是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，因其生物相容性、可塑性良好，具有一定的彈性和黏附能力，易被組織吸收，無細(xì)胞毒性，制備方便，近年來被廣泛

2、用于骨組織工程中?，F(xiàn)將纖維蛋白膠在骨修復(fù)治療的新近研究進(jìn)展綜述如下。   1  歷史淵源   纖維蛋白膠作為天然外科黏合劑的研究始于上世紀(jì)初，1909年Bergel首次利用纖維蛋白混懸液嘗試用于止血。1944年，首次出現(xiàn)了以纖維蛋白原與凝血酶粗制品混合，用于黏合移植皮瓣的報道。70年代，隨著分離、提純技術(shù)的完善，F(xiàn)S得以定型并初步在臨床實驗性使用。80年代，德國、法國及奧地利等歐洲國家率先開發(fā)出商品化人源性纖維蛋白膠(Tisscol、Beriplast、Biocol等)并應(yīng)用于臨床。但人源性FS存在著傳播潛在疾病、來源受限、成本昂貴等缺點。在此

3、基礎(chǔ)上90年代，我國科技工作者研制出動物源性的醫(yī)用FS，并在臨床上廣泛試用，顯示出良好的臨床效果。目前FS的生產(chǎn)方法成熟穩(wěn)定，作用機理、體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程和終產(chǎn)物都很明確，臨床應(yīng)用結(jié)果顯示FS在止血、組織黏結(jié)、促進(jìn)傷口愈合、防止組織黏連等方面效果確切。   2  纖維蛋白膠的作用機理及理化性質(zhì)   纖維蛋白膠是利用哺乳類動物或人的血液中有關(guān)成分，通過人工提取而來。制劑由2部分組成：(1)濃縮纖維蛋白原，X因子和抑肽酶，其中纖維蛋白原含量與凝固的強度、止血效果、黏合力直接相關(guān)；(2)凝血酶粉及其溶解劑氯化鈣。凝血酶的濃度決定了成膠的速度與時間。2部分

4、混合后，凝血酶酶切纖維蛋白原，釋放出纖維蛋白A肽及B肽，促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，形成纖維蛋白單體，凝血因子X有催化聚合作用，使纖維蛋白分子交聯(lián)，聚合成網(wǎng)狀，增加凝集強度。凝血酶同時激活因子X，活性態(tài)的因子Xa在鈣離子存在下參與纖維蛋白多肽的交聯(lián)，使之形成堅固的不易降解的凝塊。由于纖維蛋白膠在成型之前2種成分都是液體成分，具有可以任意塑型的特點，作為一種可注射性細(xì)胞支架材料目前已經(jīng)在組織工程學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。研究已經(jīng)證實：FS是一種生物相容性很好的復(fù)合物，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)新血管的形成，而且不會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)1。  纖維蛋白膠一個重要的特性是在體內(nèi)纖溶酶作用

5、下能夠在一定時間內(nèi)降解吸收。通常纖維蛋白在體內(nèi)的降解時間在2周左右2?？焖俚慕到庾饔糜欣诮M織的愈合、細(xì)胞及因子的釋放3,4,7。但是也存在一定的問題。具有天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，長期穩(wěn)定的纖維蛋白膠是細(xì)胞生長和分泌特異性基質(zhì)的必要條件。如果纖維蛋白膠降解吸收過快或其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于緊密會抑制細(xì)胞增殖與遷移，影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成5。纖維蛋白膠內(nèi)不同的組成成分，如纖維蛋白原、凝血酶濃度、離子強度能夠影響纖維蛋白膠的穩(wěn)定性及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)6,7。Ferry等人首先報道了2種不同類型的纖維蛋白膠：粗糙型和精細(xì)型。Fine纖維蛋白膠是由大量分支狀的細(xì)纖維組成，膠體透明堅固，孔隙率較小，降解吸收時間較長。相反，Coa

6、rse纖維蛋白膠是由粗纖維組成，由于存在大量的側(cè)枝，因此肢體混濁，松散，孔隙率大，降解吸收時間短。底物酶及其他底物濃度如pH值、溶液的離子濃度能夠影響這種側(cè)枝連接8,9。此外，外源性的加入纖溶酶抑制劑如抑肽酶、氨甲環(huán)酸等能夠抵抗纖溶酶、胰蛋白酶等蛋白降解酶的降解作用，延長纖維蛋白多聚體存在的時間，有利于組織的修復(fù)與重建1012。但是也有一些作者對于抗纖溶制劑應(yīng)用持反對意見，他們認(rèn)為添加纖溶酶抑制劑將會引起過敏反應(yīng)、血栓形成、局部血栓性靜脈炎等副作用，同時影響細(xì)胞的遷移及周圍巨噬細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞的積聚，引起異體巨細(xì)胞的出現(xiàn)，不利于細(xì)胞基質(zhì)成分的形成13，14。  3

7、0; 纖維蛋白膠在骨修復(fù)方面的應(yīng)用研究3.1  纖維蛋白膠作為細(xì)胞支架在骨修復(fù)方面的應(yīng)用  臨床治療骨缺損時，常需不同形狀和規(guī)格的植骨材料，如能解決材料的可塑性問題，將為臨床提供極大的方便。纖維蛋白膠在這方面具有自己獨特的優(yōu)勢。纖維蛋白膠在成型之前是液體成分，凝固后可以任意塑型并具有一定的黏彈性，可以將骨膜、骨片或無機骨替代材料黏附在一起，用于修復(fù)骨缺損。Isogai等15將新生牛的橈骨干骺端的骨膜取下絞碎后與FG混合植入無胸腺裸鼠背部皮下觀察異位骨化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗組12周有新骨形成，單純FG組未見新骨形成。Minamide等人16將自體骨片與FS混合進(jìn)行骨

8、修補，其中11例后路脊柱融合、7例前路融合和1例骨缺損修補，僅需數(shù)分鐘混合物就塑成緊固移植物黏附于受體部位。所有病例均未發(fā)生有關(guān)的并發(fā)癥，療效極好。Guehennec等人17將纖維蛋白膠與雙相磷酸鈣顆粒構(gòu)建成可注射型材料來修復(fù)骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨使用磷酸鈣組新骨形成出現(xiàn)在顆粒的表面，而聯(lián)合使用纖維蛋白膠與磷酸鈣組新骨則出現(xiàn)在距磷酸鈣表面一定距離的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。隨后他們通過改變纖維蛋白膠中凝血酶的濃度發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象是與凝血酶有關(guān)的。提高凝血酶能夠改變纖維蛋白膠的纖維厚度、孔隙率及均質(zhì)性；加入磷酸鈣顆粒并不改變纖維蛋白膠的交聯(lián)，而且凝血酶能夠促進(jìn)早期的鈣化，改變了材料界面間能量的分布，可以通過二次

9、成核作用形成鈣磷沉積，這與常見的所見的晶體表面外延生長形成鈣磷沉積的形式不同6。  骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定的條件下可向骨、軟骨、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌、骨骼肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等間葉組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化，故也稱為間充質(zhì)干細(xì)胞。由于BMSC來源易得，取材方便，增殖能力強，可在體外大規(guī)模擴(kuò)增，并且異體移植時排斥反應(yīng)小，是近年來常用的組織工程種子細(xì)胞。FS與骨髓基質(zhì)細(xì)胞兩者之間組織相容性良好，兩者的復(fù)合物可以用于修復(fù)骨缺損。Lee等人3模擬了FS復(fù)合BMCs在修復(fù)骨肉瘤切除后造成的骨缺損情況。他們將小鼠股骨干制成1.5 mm的缺損，分成正常組與化療組，2組動

10、物都采取3種不同的方法處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：缺損部位填充FS/BMCs的動物都有明顯的新骨形成，而單純FS組及空白組中無新骨的形成，同時研究還發(fā)現(xiàn)：FS具有保護(hù)骨髓基質(zhì)細(xì)胞免受化療藥物影響、延長細(xì)胞存活時間的作用。陳克明等人18利用纖維蛋白原與凝血酶生成纖維蛋白的反應(yīng)過程制備了BMCs與纖維蛋白的復(fù)合物，將該復(fù)合物用于修復(fù)橈骨骨缺損，研究結(jié)果同樣證實具有良好的效果。3.2  FS作為細(xì)胞支架在軟骨組織修復(fù)方面的應(yīng)用  關(guān)節(jié)軟骨缺乏自身修復(fù)能力，對于4 mm的軟骨缺損，其自發(fā)的修復(fù)過程是形成生物力學(xué)性能較差的纖維軟骨或纖維瘢痕組織。以往使用的自體、異體軟骨移植和人工關(guān)節(jié)移

11、植均未能解決這一問題。組織工程學(xué)的迅速發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)帶來了曙光。在軟骨組織工程學(xué)生物支架選擇上，人工合成高分子支架因其代謝產(chǎn)物對于種子細(xì)胞生長有著一定的影響而在實際運用上受到一定的限制，而纖維蛋白膠由于其特殊的理化性質(zhì)，成為近年來軟骨組織工程支架的研究熱點。Sims19等將牛軟骨細(xì)胞種植于纖維蛋白膠支架上，然后植于裸鼠皮下，證實利用纖維蛋白膠可以構(gòu)建體外組織工程化軟骨。在此基礎(chǔ)上，Silverman等20通過對比觀察發(fā)現(xiàn)：軟骨細(xì)胞-纖維蛋白膠復(fù)合物形成軟骨的質(zhì)量、數(shù)量與纖維蛋白膠內(nèi)包含的軟骨細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)，他們研究認(rèn)為：每毫升FS內(nèi)含4×107個軟骨細(xì)胞復(fù)合物具有最佳的成

12、軟骨特性。  BMCs在特定的條件下可以分化成軟骨細(xì)胞；纖維蛋白膠與BMCs復(fù)合可以用于修復(fù)軟骨組織缺損。Huang等21將纖維蛋白膠、骨髓基質(zhì)細(xì)胞與轉(zhuǎn)化生長因子復(fù)合物包埋于皮下、肌肉及骨膜下，觀察復(fù)合物誘導(dǎo)軟骨形成的作用發(fā)現(xiàn)：皮下包埋組及肌肉包埋組6周后復(fù)合物周圍圍繞大量的細(xì)胞基質(zhì)成分和血管組織，骨膜下包埋組在第2周出現(xiàn)軟骨細(xì)胞，6周后有新生軟骨的形成。黎建偉等22將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMCs)與纖維蛋白膠(FG)的混合物用來修復(fù)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨缺損和新鮮缺損應(yīng)用BMCs與FG復(fù)合修復(fù)的效果無明顯差異，均為類透明軟骨組織修復(fù)。陳舊組與新鮮組248周

13、期間關(guān)節(jié)功能良好。BMCs與FG的混合物在短期內(nèi)能夠良好地修復(fù)陳舊性關(guān)節(jié)軟骨全層缺損。         3.3  作為抗生素及因子的緩釋載體在骨修復(fù)方面的作用  抗生素的局部藥物緩釋被認(rèn)為是防治開放性骨折感染的一種有效方法。自從1980年Klemn首次局部應(yīng)用慶大霉素-PMMA鏈珠防治骨與軟組織感染獲得成功后，對抗生素局部緩釋載體的研究成為熱點，但由于其存在不可吸收、含有雜質(zhì)、需要二次手術(shù)取出、免疫反應(yīng)、載體分解過快以及藥物濃度不能維持適當(dāng)時間等問題而不能廣泛應(yīng)用到臨床中。纖維蛋白膠是

14、模擬人體自身凝血反應(yīng)最后階段形成具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的纖維蛋白多聚體，其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也提供了較大的承載藥物的表面積，其網(wǎng)眼間隙使藥物按一定速率恒定釋放，提供盡可能長的抗生素局部支持時間。Mader等人23利用纖維蛋白膠作為妥布霉素的緩釋載體來治療感染性的骨髓炎。結(jié)果顯示：纖維蛋白膠復(fù)合妥布霉素組與妥布霉素-PMMA鏈珠組治療效果相似，與PMMA相比，F(xiàn)S的應(yīng)用更加安全、方便。但是由于他們的試驗動物樣本較少，所得的結(jié)果有待進(jìn)一步的考證。Gao等人24將纖維蛋白膠作為骨形成蛋白及慶大霉素的共同載體，期治療感染性的骨缺損。研究發(fā)現(xiàn)：FG-BMP-慶大霉素復(fù)合組在控制感染及骨修復(fù)方面均有良好的效果。陳仲等

15、人25對32例開放性骨折患者傷口局部應(yīng)用蛋白膠-慶大霉素復(fù)合體防治骨折感染，其中2例發(fā)生傷口局部感染，感染發(fā)生率6.12%，治愈后隨訪3個月均無感染復(fù)發(fā)；而空白對照組發(fā)生傷口局部感染9例，感染發(fā)生率為23.1%，治愈后隨訪3個月有5例患者發(fā)生傷口局部感染復(fù)發(fā)，其中2例診斷為骨髓炎。  利用FS形成前，其組成成分可溶解于流體物質(zhì)的特性，復(fù)合多種能夠促進(jìn)骨修復(fù)和創(chuàng)傷愈合的生物因子，使其在發(fā)揮原有的止血、黏合、修復(fù)作用的同時，還具有強大的成骨能力，在骨修復(fù)過程中有較高的臨床實用價值。Han等4用纖維蛋白封閉系統(tǒng)(FFSS)和rhBMP4復(fù)合物治療8 mm的顱骨缺損，植入后2周、8

16、周分別取材進(jìn)行組織學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFSS與BMP復(fù)合組在新骨形成的能力及質(zhì)量上均好于單純FFSS組與空白對照組。分析原因，他們認(rèn)為是由于FS刺激了未分化的間充質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)毛細(xì)血管增生和長入，為BMP的誘導(dǎo)活動提供了豐富的靶細(xì)胞環(huán)境和理想的微環(huán)境。同時，F(xiàn)S天然的網(wǎng)狀微觀結(jié)構(gòu)有助于BMP等生長因子的附著及與靶細(xì)胞的接觸，其強大的黏著力有利于BMP等生長因子的緩慢釋放，隨著FS的降解，在植入材料的周圍形成了一個BMP濃度梯度，增加了BMP等生長因子與靶細(xì)胞作用的時間，使其骨誘導(dǎo)活性得以最大限度地發(fā)揮。充分發(fā)揮其誘導(dǎo)功能，骨生長因子的釋放幾乎伴隨新骨形成的全過程，因而為新骨的形成提供了非常有利

17、的內(nèi)環(huán)境。Zhu等26研究了纖維蛋白膠體復(fù)合BMP修復(fù)軟骨缺損的能力，結(jié)果表明該復(fù)合物具有良好成軟骨的特性，可以用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。這是由于纖維蛋白膠作為生物性材料，其內(nèi)部良好的微環(huán)境及大分子蛋白可保護(hù)BMP不發(fā)生非特異性蛋白水解，防止生長因子局部流失，盡可能長時間的保護(hù)特定條件BMP誘導(dǎo)成軟骨的活性。  理想的細(xì)胞支架應(yīng)該具有良好的組織相容性、降解速度、一定的機械強度、可塑性；利用細(xì)胞生長貼附的細(xì)胞-材料界面，具有無毒、無免疫反應(yīng)等特點。纖維蛋白膠作為細(xì)胞支架材料還存在降解時間較快、機械性能較差等缺陷。如何改善纖維蛋白膠的降解時間，增強其力學(xué)性能將是今后研究的方向。

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