第四節(jié) 衰老DNA修復(fù)能力下降學(xué)說(shuō)

1、第四節(jié)DNA修復(fù)能力下降學(xué)說(shuō) 人體細(xì)胞中的DNA由兩條脫氧核糖核酸鏈組成，它們互相纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)。在內(nèi)環(huán)境(如自由基)和外環(huán)境(如陽(yáng)光中的紫外線(xiàn)、化學(xué)物質(zhì))等有害因素作用下，DNA鏈?zhǔn)軗p而發(fā)生斷裂，一般以一條鏈斷裂最為多見(jiàn)。在人體中，估計(jì)每天每一個(gè)細(xì)胞約發(fā)生2 000次DNA損傷事件。DNA損傷后，遺傳信息不能準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯，不過(guò)為了維持基因組的完整性以及機(jī)體的正常功能，細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中獲得了某些DNA修復(fù)機(jī)制，從而得以保證遺傳信息由親代高保真地傳至子代。細(xì)胞DNA的這種修復(fù)能力是生物體長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，由遺傳因素決定，可因機(jī)體所屬的物種平均壽命不同而異。1974年，Hmtt和Se

2、t：low對(duì)7種哺乳動(dòng)物(大鼠、小鼠、牛以及人等)皮膚成纖維細(xì)胞DNA非程序合成水平觀察后發(fā)現(xiàn)，用10 Jm2紫外線(xiàn)劑量照射各種培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞核中所出現(xiàn)的銀染顆粒數(shù)顯著不同，提示不同物種的DNA修復(fù)能力與其各自的最高壽命有著良好的正相關(guān)關(guān)系。 DNA損傷時(shí)，不同基因甚至同一基因不同部位的修復(fù)過(guò)程并不均一：轉(zhuǎn)錄活躍基因被優(yōu)先修復(fù)，而在同一基因中轉(zhuǎn)錄區(qū)被優(yōu)先修復(fù)。在細(xì)胞分裂的DNA復(fù)制時(shí)期，基因修復(fù)比較徹底，這就是干細(xì)胞能永葆青春的根本原因。目前國(guó)際上已證實(shí)人類(lèi)修復(fù)基因至少有30余種。實(shí)際上，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答不僅僅是誘導(dǎo)修復(fù)基因表達(dá)，而且通過(guò)轉(zhuǎn)換細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)(checkpoint)的功能，

3、特別是p53、p21系統(tǒng)，阻滯細(xì)胞周期，從而使受損DNA有時(shí)間完成修復(fù)。因此，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答時(shí)序及協(xié)調(diào)過(guò)程是由調(diào)控點(diǎn)控制基因(checkpoint control gene)控制的。 一、p53 p53基因位于17號(hào)染色體短臂17p131，DNA全長(zhǎng)1620 kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子2、4、5、7、8編碼5個(gè)進(jìn)化高度保守的mRNA結(jié)構(gòu)區(qū)，其蛋白產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，為一種含有393個(gè)氨基酸磷酸核蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為531O3，故稱(chēng)為p53。野生型p53(wtp53)基因編碼的p53是一種DNA結(jié)合蛋白，包含N一末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、四聚體化結(jié)構(gòu)域和

4、c一末端調(diào)節(jié)域，具有轉(zhuǎn)錄激活作用，通過(guò)兩個(gè)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育：一為調(diào)節(jié)：DNA復(fù)制啟動(dòng)復(fù)合物的組裝和功能，對(duì)細(xì)胞進(jìn)入s期進(jìn)行調(diào)控；二為反式激活某些抑制細(xì)胞增殖的基因，從而對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行負(fù)調(diào)控。此外，野生型p53基因還有監(jiān)視細(xì)胞基因組完整性的功能，例如，DNA遭受紫外線(xiàn)輻射等損傷時(shí)，p53蛋白將會(huì)累積，從而引起DNA復(fù)制停止，細(xì)胞停滯在G1期，提供足夠的時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)；如果修復(fù)失敗，則p53喪失這種功能，基因組穩(wěn)定性下降，突變和染色體重排以較高速率發(fā)生，最終導(dǎo)致惡性克隆出現(xiàn)。突變型p53(mtp53)基因編碼的。p53能夠抑制細(xì)胞凋亡，人類(lèi)腫瘤一半以上具有p53基因突變和缺失。綜上所述，p

5、53基因的主要功能為阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性和抑制腫瘤血管生成?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將溫度敏感型p53(p53Vall35)基因?qū)胗郎∈笈咛コ衫w維細(xì)胞NIH3T3中，該細(xì)胞株在培養(yǎng)條件下迅速表現(xiàn)出衰老相關(guān)特征，例如，細(xì)胞體積增大、細(xì)胞質(zhì)鋪展并伸出樹(shù)狀突起、細(xì)胞核增大并逐步分裂成多核、細(xì)胞質(zhì)中脂褐質(zhì)體增多以及細(xì)胞質(zhì)空泡化、吐核等現(xiàn)象，因此p53能夠誘導(dǎo)細(xì)胞迅速進(jìn)入衰老狀態(tài)。臨床上，p53與各種老年性疾病的關(guān)系也很密切，它能誘導(dǎo)炎癥蛋白SAA產(chǎn)生，引起動(dòng)脈粥樣化、骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及一些神經(jīng)退行性病變。p53引起細(xì)胞衰老的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)p21大量表

6、達(dá)有關(guān)。 二、p21 p21基因?yàn)閱慰截?，定位于?號(hào)染色體短臂上，DNA長(zhǎng)度85 kb，有三個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為68 bp、450 bp和1 600 bp，其蛋白產(chǎn)物含有164個(gè)氨基酸，富含精氨酸，相對(duì)分子量2l10。，故稱(chēng)為p21。p21是目前已知激酶抑制活性最廣的細(xì)胞周期抑制蛋白，可以抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(cyelindependent，kinase，CDK)活性。周期蛋白(eyclin)不僅有激活CDK的作用，還決定cDK何時(shí)、何處、將何種底物磷酸化，從而推動(dòng)細(xì)胞周期前進(jìn)。目前已分離出的周期蛋白有30余種，在脊椎動(dòng)物中為A1-2、B1-3、c、D1-3、El-2、F、G、H等，分為

7、G1型、G1s型s型和M型4類(lèi)，各類(lèi)周期蛋白均含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱(chēng)為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)的CDK在動(dòng)物中有7種，各種cDK分子均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，c1期cyclin D表達(dá)，然后與(,DK4結(jié)合使下游蛋白質(zhì)磷酸化，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄；在G1-s期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1s限制點(diǎn)進(jìn)入s期。因此，cyclinDl-CDK4和cyclinE-CDK2是參與細(xì)胞G1期調(diào)控的兩種主要的蛋白激酶復(fù)合體，它們與p21結(jié)合后活性受到抑制，pRB蛋

8、白不能發(fā)生磷酸化，從而使細(xì)胞周期停滯在Gl期。另外，p21還可以抑制核增殖抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)與DNA多聚酶6結(jié)合，使DNA全酶不能在DNA單鏈上滑動(dòng)，減慢復(fù)制叉行進(jìn)速度，為修復(fù)DNA損傷爭(zhēng)取時(shí)間，從而有利于基因修復(fù)。由此可見(jiàn)，p21是一種可誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制劑，能夠促使細(xì)胞脫離細(xì)胞周期、發(fā)生分化，在個(gè)體發(fā)育中有重要意義。當(dāng)細(xì)胞受到損傷或進(jìn)入衰老狀態(tài)時(shí)，p2l就會(huì)阻斷細(xì)胞周期，使細(xì)胞不再增殖。 三、gadd45gadd45(growth arrest and DNAdamage一inducible的縮寫(xiě))是p53信號(hào)鏈的下游基因之一

9、。它編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為19lO。，含有一個(gè)p53結(jié)合元件，與DNA修復(fù)的關(guān)系也很密切。Smith等人體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45促進(jìn)核苷酸切除修復(fù)的作用與p21有關(guān)，它可以同p21競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PCNA，成為修復(fù)復(fù)合體的成分而促進(jìn)切除修復(fù)；另一方面，它還能使p21或cDKcyclin復(fù)合體脫離修復(fù)位點(diǎn)來(lái)促進(jìn)切除修復(fù)。衰老細(xì)胞DNA損傷后，gadd45、p21基因。mRNA水平表達(dá)增高，但仍明顯低于年輕細(xì)胞。p53的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，DNA損傷時(shí)其mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變。因此衰老細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力下降以及細(xì)胞周期阻滯于G，期可能主要與gadd45、p21誘導(dǎo)表達(dá)下降有關(guān)。

10、隨著年齡增加，DNA修復(fù)能力下降，基因表達(dá)發(fā)生異常，錯(cuò)誤遺傳信息不斷累積，細(xì)胞功能逐漸減退，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老乃至死亡。1979年，Setlow等人利用紫外線(xiàn)誘發(fā)人外周血淋巴細(xì)胞DNA修復(fù)過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年輕人供體細(xì)胞的DNA修復(fù)能力高于中、老年人供體細(xì)胞，說(shuō)明同一物種內(nèi)，個(gè)體的DNA修復(fù)能力與其年齡呈負(fù)相關(guān)，即高齡個(gè)體DNA修復(fù)能力小于低齡個(gè)體。國(guó)內(nèi)學(xué)者韓宗超等人利用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線(xiàn)或過(guò)氧化氫損傷后，老年小鼠脾細(xì)胞DNA單鏈斷裂增多，其修復(fù)能力以及修復(fù)相關(guān)基因gadd45和gaddl53的表達(dá)情況均明顯低于青年鼠。韓宗超等人對(duì)大鼠衰老神經(jīng)細(xì)胞DNA氧化損傷與修復(fù)進(jìn)行的研究表明，神經(jīng)元為終末分化細(xì)胞，當(dāng)其DNA受損時(shí)，無(wú)論是衰老細(xì)胞還是正常細(xì)胞，都具備同樣性能的修復(fù)酶和一定的自我修復(fù)能力，但是衰老神經(jīng)元的DNA脆性和易損性增加，修復(fù)的忠實(shí)性較差。對(duì)人體培養(yǎng)細(xì)胞的研究