敲除小鼠常見(jiàn)問(wèn)題與回答

1、敲除小鼠常見(jiàn)問(wèn)題與答復(fù)一、什么是ES細(xì)胞顯微注射？答：胚胎干細(xì)胞顯微注射是制作基因敲除小鼠的一個(gè)最常用的方法。主要過(guò)程是將攜帶目的基因的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時(shí)含有來(lái)源于囊胚的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉(zhuǎn)基因或打靶基因來(lái)源于胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的后代。二、嵌合體遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體。免疫學(xué)上的涵義則指一個(gè)機(jī)體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在,彼此能夠耐受,不產(chǎn)生排斥反應(yīng),相互間處在

2、嵌合狀態(tài)。在基因敲除鼠中指通過(guò)向囊胚注射被外源基因轉(zhuǎn)化了的胚胎干細(xì)胞，使得發(fā)育成為的個(gè)體中含有不同基因型的細(xì)胞，產(chǎn)生的個(gè)體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)胞一種是基因型被改變了的細(xì)胞，另一種是原來(lái)的基因型的細(xì)胞。三、條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個(gè)DNA重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的LoxP位點(diǎn)組成它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處（LoxP位點(diǎn)）,該系統(tǒng)可以將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除?；贑re-LoxP的基因打靶要分兩步來(lái)進(jìn)行。首先要在胚胎干細(xì)胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過(guò)打靶載體的設(shè)計(jì)和對(duì)同源重組子的

3、篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)。下一步通過(guò)Cre介導(dǎo)的重組來(lái)實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞水平上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在個(gè)體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠。四、如何鑒定和挑選嵌合體？答：動(dòng)物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動(dòng)物。它的鑒定主要根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來(lái)源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據(jù)毛色的嵌合率來(lái)鑒定和挑選嵌合體。五、ROSA26與定點(diǎn)插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點(diǎn)插入

4、到ROSA26位置。ROSA26是一個(gè)安全區(qū)域，外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會(huì)影響其他基因的表達(dá)。常見(jiàn)問(wèn)題1、你們是否接受打靶載體或者重組的胚胎干細(xì)胞之后的服務(wù)工作？目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服務(wù)，同時(shí)也可以承擔(dān)打靶載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和顯微注射等服務(wù)項(xiàng)目。2、您公司的C57BL/6野生型胚胎干細(xì)胞株是否可以出售？C57BL/6野生型胚胎干細(xì)胞株我們是不對(duì)外出售的。這個(gè)細(xì)胞株是我們自主研發(fā)并具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞系。鑒于基因敲除工作的重要環(huán)節(jié)以及是否可以得到一個(gè)比較好的Germlinetransmission的關(guān)鍵就是是否有一個(gè)高質(zhì)量的EScellline，因此這個(gè)EScelllin

5、e已經(jīng)成為我們公司的最核心的資產(chǎn)。所以，非常抱歉！我們不能對(duì)外出售，請(qǐng)您諒解！3、公司最后提供給客戶多少只F1代小鼠？有相關(guān)的檢測(cè)方法或檢測(cè)報(bào)告嗎？我們最后提供給客戶的是不少于兩只的F1雜合子小鼠。一般情況下，我們可以提供更多的F1代雜合子小鼠。我們會(huì)有相關(guān)的檢測(cè)方法和最終的檢測(cè)報(bào)告提供給您，您也可以自己進(jìn)行核實(shí)檢測(cè)！也可以在我們的幫助之下完成。4、客戶委托公司制備基因敲除小鼠需要提供哪些材料？客戶只需要告訴我們要操作的基因名字和您的特殊要求。對(duì)于沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的客戶，我們會(huì)免費(fèi)為您提供咨詢，了解您的需求，以及想得到的結(jié)果，為您提供最正確的設(shè)計(jì)方案。我們會(huì)對(duì)該基因進(jìn)行序列分析后，給您一個(gè)初步的設(shè)計(jì)，

6、雙方溝通沒(méi)有問(wèn)題后，我們會(huì)簽署一份技術(shù)服務(wù)合同，然后我們進(jìn)行BAC的訂購(gòu)，開(kāi)始模型的制備。直到您得到F1代小鼠。5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服務(wù)？我們公司現(xiàn)在主要是提供各種基因敲除小鼠模型的制備服務(wù)。有關(guān)基因敲除的大鼠模型，我們公司正在對(duì)技術(shù)進(jìn)行研發(fā)和優(yōu)化。所以現(xiàn)在還不能為您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！請(qǐng)關(guān)注我們公司的網(wǎng)站。我們一旦開(kāi)始提供大鼠基因敲除服務(wù)，我們將在公司網(wǎng)站上公布估計(jì)在2013年。6、公司提供基因敲進(jìn)服務(wù)時(shí)，對(duì)敲進(jìn)的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？公司提供基因敲進(jìn)服務(wù)時(shí)，對(duì)于特殊的基因，需要客戶提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比較好。對(duì)

7、于5-10kb的，效率可能會(huì)低一些。對(duì)于大片段的敲進(jìn)，由于重組效率將大大地降低，我們可能會(huì)收取較多的費(fèi)用。7、公司會(huì)安排多少個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行囊胚注射？我們通常在注射的時(shí)候會(huì)安排四個(gè)克隆，但是我們做陽(yáng)性重組胚胎干細(xì)胞篩選的時(shí)候通常要求得到不少于6-8個(gè)克隆，以備篩選更好的注射克隆之用。而且，我們的最終目標(biāo)是要得到優(yōu)良的Germ-linetransmission。8、公司如何對(duì)轉(zhuǎn)染的ESC進(jìn)行篩選，如何確保目的基因的正確插入？我們?cè)跇?gòu)建打靶載體時(shí)會(huì)引入NEO亢性基因篩選標(biāo)記，同時(shí)在打靶載體特定位置引入酶切位點(diǎn)。打靶載體電轉(zhuǎn)細(xì)胞后，首先進(jìn)行G418的抗性初篩。之后，我們會(huì)通過(guò)兩次Southern雜交實(shí)

8、驗(yàn)，對(duì)插入位點(diǎn)的兩端進(jìn)行驗(yàn)證，以此確保目的基因完整的插入到正確位置，以及其它位置沒(méi)有隨機(jī)插入。9、公司制備完成的小鼠如何運(yùn)輸？公司在根據(jù)客戶的要求得到F1雜合子小鼠后，我們會(huì)根據(jù)客戶的具體要求選擇運(yùn)輸方式與運(yùn)輸日期。如果您沒(méi)有特殊要求，我們會(huì)通過(guò)專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)輸公司，以空運(yùn)的方式安排運(yùn)輸。10 、何謂Flox小鼠？所謂Flox小鼠是指在某個(gè)基因的某個(gè)外顯子兩側(cè)各放一個(gè)LoxP序列。這段序列就是FlankedbyLoxP，也就叫做Flox小鼠。這種Flox小鼠一般要通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建打靶載體、胚胎干細(xì)胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來(lái)獲得。11 、條件性敲除設(shè)計(jì)中，為什么在抗性基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)的

9、是Frt-Flip重組系統(tǒng)，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重組系統(tǒng)？在設(shè)計(jì)中，其中的一個(gè)系統(tǒng)是為了把抗性基因去掉。另一個(gè)系統(tǒng)是為了把目的基因去掉。Frt-Flip系統(tǒng)或Cre-Loxp系統(tǒng)都可以用來(lái)放在抗性基因或是目的基因外顯子的兩側(cè)。理論上是沒(méi)有區(qū)別的。只所以“在抗性基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)的是Frt-Flip重組系統(tǒng)，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重組系統(tǒng)”，主要有以下幾個(gè)原因：1工具鼠：Cre-LoxP系統(tǒng)已經(jīng)用了將近20年了，科學(xué)家研發(fā)了很多的Cre工具鼠。其實(shí)目前絕大部分工具鼠都是Cre工具鼠?，F(xiàn)在大家做一個(gè)Flox(FlankedByLoxP)小鼠花費(fèi)很多的時(shí)間和金錢(qián)，都會(huì)希望自

10、己的小鼠與更多的工具鼠交配，得到更多的結(jié)果。2) Flip酶的活性比較低。Flip酶是從酵母中別離出來(lái)的。其最適溫度是30度，而小鼠的體溫是37度。盡管現(xiàn)在有些實(shí)驗(yàn)室對(duì)Flip的37度適應(yīng)性做了優(yōu)化，但應(yīng)該還是沒(méi)有Cre的活性好。把Frt放在抗性基因的兩側(cè)，得到小鼠之后，跟FlipDeleter小鼠交配，篩選出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。即使Flip的活性不高，也可以得到Flox小鼠。這些Flox小鼠可以跟各種Cre工具鼠交配，得到條件性敲除小鼠。反過(guò)來(lái)，如果用Cre來(lái)去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。這種情況下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。如果看5、6年前

11、的文章，大家其實(shí)是把Loxp不僅放在要敲除基因的兩側(cè)，也用來(lái)敲除抗性基因(NeoR)。那個(gè)時(shí)候篩選起來(lái)特別麻煩。因?yàn)橐龃罅康暮Y選，篩出只敲掉抗性基因，而沒(méi)有敲掉目的基因的Flox小鼠。需要很多的時(shí)間和精力。12 、怎樣用最簡(jiǎn)單的描述區(qū)分基因敲除、基因敲進(jìn)、基因敲降、和轉(zhuǎn)基因1基因敲除Knockout)：把一個(gè)基因從基因組里面全部或部分拿掉；2條件性基因敲除ConditionalKO):把一個(gè)基因從特定細(xì)胞的基因組里面全部或部分拿掉；3基因敲進(jìn)Knockin)：在基因組里放一個(gè)外源基因如GFP,LacZ,TdTomato等；4基因敲降Knock-down):通過(guò)降解mRNA勺方法降低蛋白的表達(dá)

12、水平一般是用microRNA或siRNA)。5轉(zhuǎn)基因：在體內(nèi)過(guò)表達(dá)一個(gè)特定基因，就象在細(xì)胞系里用高水平表達(dá)載體表達(dá)一個(gè)蛋白。13 、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到雜合子是什么原因？高嵌合率不代表種系傳遞就好。許多實(shí)驗(yàn)室，包括我們公司，都發(fā)現(xiàn)特別高嵌合率的嵌合體小鼠不能交配產(chǎn)仔。原因不是很清楚,這應(yīng)該跟打靶的基因是不是性染色體沒(méi)有關(guān)系?？梢詸z查一下嵌合體小鼠是不是有隱睪的現(xiàn)象。另外，毛色看到的嵌合率與生殖細(xì)胞的嵌合率不一定完全一致。也有人認(rèn)為雄性ES細(xì)胞注射到雌性囊胚使得胚胎發(fā)育過(guò)程中性別轉(zhuǎn)化不完全，造成的所謂不男不女現(xiàn)象。現(xiàn)在好似還沒(méi)有一個(gè)定論知道到底是什么原因。14、ROSA2皎點(diǎn)插入外源基

13、因的設(shè)計(jì)原理是什么？Rosa26位點(diǎn)基因敲入，在原來(lái)的設(shè)計(jì)中，目的基因cDNA上游帶有一段轉(zhuǎn)錄終止序列“Stop”3個(gè)拷貝的SV40多聚A序列，tPA,轉(zhuǎn)錄終止序列的兩端各有一個(gè)Loxp位點(diǎn)，將此結(jié)構(gòu)定點(diǎn)嵌入Rosa26基因位置，整個(gè)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄受Rosa26啟動(dòng)子控制。在沒(méi)有Cre的情況下，由于Rosa26啟動(dòng)子與目的基因之間“STOP的存在，目的基因不能被表達(dá)。如果有Cre表達(dá)，Cre重組酶將去除“STOP”，Rosa26啟動(dòng)子就可以啟動(dòng)目的基因表達(dá)。但是，由于Rosa26啟動(dòng)子是一個(gè)弱啟動(dòng)子，其啟動(dòng)能力有限，目的基因經(jīng)常達(dá)不到研究人員需要的表達(dá)水平。為了解決這一問(wèn)題，可以對(duì)原Rosa26基

14、因敲入系統(tǒng)做改良，引入了一個(gè)強(qiáng)效的啟動(dòng)子，如CAG啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子由雞actin啟動(dòng)子和CMV曾強(qiáng)子融合而成，用這一雜合啟動(dòng)子代替Rosa26啟動(dòng)子，從而高效地啟動(dòng)目的基因表達(dá)。15 、在做條件性基因敲除小鼠模型的設(shè)計(jì)時(shí)，為什么不能從exon1敲除？條件性基因敲除小鼠模型的設(shè)計(jì)，不能從exon1開(kāi)始敲除，原因是loxpsite最好不要插入到啟動(dòng)子區(qū)域，因?yàn)楹茈y預(yù)測(cè)啟動(dòng)子和所有調(diào)控元件的位置，loxp的插入很有可能會(huì)因?yàn)槠茐牧藛?dòng)子或調(diào)節(jié)原件而影響野生型蛋白的表達(dá)，所以條件性敲除設(shè)計(jì)中，一般都不會(huì)從exon1開(kāi)始敲除。16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1目前用于基因沉默的技術(shù)方法主要是

15、siRNA。對(duì)于一個(gè)待敲除的候選基因，需要設(shè)計(jì)多個(gè)siRNA，并對(duì)每一個(gè)siRNA進(jìn)行驗(yàn)證一般利用細(xì)胞系，這就造成篩選具有干擾作用siRNA的選擇難度相當(dāng)大。2一般情況下，RNAi對(duì)于基因的抑制不會(huì)很完全。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們一般只是觀察1-5天，以驗(yàn)證siRNA的抑制功能。而在小鼠體內(nèi)，siRNA盡管可以降低mRNAS勺水平,從而影響蛋白的表達(dá)，但并不一定影響基因的功能。一是蛋白表達(dá)水平雖然達(dá)不到正常水平，但可能同樣發(fā)揮完整的功能；二是蛋白表達(dá)水平降低會(huì)導(dǎo)致蛋白降解速度降低，從而使蛋白的整體水平得到補(bǔ)償。所以，除非非常運(yùn)氣，siRNA轉(zhuǎn)基因一般很難得到比較肯定的結(jié)果。如果不能完全阻斷基因的

16、表達(dá)，利用siRNA進(jìn)行基因敲降時(shí)沉默掉的基因仍保留一定的表達(dá)信號(hào)，可能會(huì)得到無(wú)法解釋的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。除非是為了研究siRNA,或miRNA在體內(nèi)的功能而不是研究siRNA/miRNA所對(duì)應(yīng)的候選基因，一般我們不建議利用siRNA法進(jìn)行基因敲除的設(shè)計(jì)。在這種情況下，我們通常會(huì)建議客戶做基因敲除來(lái)到達(dá)目標(biāo)基因缺失其原始蛋白功能的目的。17、為什么來(lái)源于129背景的小鼠胚胎干細(xì)胞的模式小鼠一定要在C57BL/6背景的小鼠上進(jìn)行回交？1發(fā)明小鼠基因敲除技術(shù)以來(lái)，傳統(tǒng)上一直用129遺傳背景的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶制備模式小鼠，然后在C57BL/6等近交系小鼠上回交back-cross)超過(guò)10代，才能

17、進(jìn)行諸如免疫學(xué)、癌癥、神經(jīng)學(xué)等絕大部分生物醫(yī)學(xué)研究?；亟恢辽傩枰?年多的時(shí)間，給科研工作者在時(shí)間上、金錢(qián)上造成很大損失。比方生物實(shí)驗(yàn)經(jīng)常進(jìn)行諸如細(xì)胞器官移植等實(shí)驗(yàn)，我們從動(dòng)物供給商得到的小鼠多數(shù)是C57BL/6或Balb/C等純系小鼠，而很少供給大量129小鼠以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果由129品系ES細(xì)胞制備的模式小鼠在C56BL/6品系上回交的代次不夠，就會(huì)帶有很多129小鼠抗原。將其細(xì)胞等移植到C57BL/6或其他近交系小鼠后，受體鼠會(huì)由于自身免疫排斥的原因，將轉(zhuǎn)移的細(xì)胞殺死或產(chǎn)生耐受現(xiàn)象。2由于129品系小鼠遺傳背景復(fù)雜，得到的模式小鼠需在C57BL/6等近交系小鼠上做回交，并且回交次數(shù)不同也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。這對(duì)開(kāi)發(fā)制作標(biāo)準(zhǔn)模式動(dòng)物是一個(gè)很大的難題，對(duì)生物科研、醫(yī)藥企業(yè)、安評(píng)中心、藥檢部門(mén)等，也是一個(gè)很大的缺憾。所以如果能夠直接用C57BL/6ES細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠，保證了模式小鼠的穩(wěn)定性，極大的提高了制作速度縮短了科研周期。18、既然129背景的