恒河猴CD1d基因的克隆及其組織表達差異性分析

1、恒河猴CD1d基因的克隆及其組織表達差異性分析 作者：張萍, 周慧芳, 孫正華, 邵曉麗, 張華堂, 徐小寧【摘要】 目的: 克隆非人靈長類疾病動物模型恒河猴的CD1d基因并檢測其在不同組織中的表達差異情況。方法: 提取恒河猴血液及各組織的RNA, 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板, 用特異性引物擴增CD1d; 以管家基因GAPDH為內(nèi)參, 用半定量RTPCR的方法對CD1d的組織表達差異性進行分析。結果: 成功擴增了恒河猴CD1d基因的編碼區(qū)序列; 首次用半定量RTPCR的方法檢測了CD1d mRNA在恒河猴部分組織中的表達情況, 發(fā)現(xiàn)其表達水平存在明顯的組織差異性, 其中, 在肝臟、 脾臟和心

2、臟中的表達水平較高, 在血液、 小腸和肺中次之, 在腦中表達最少。結論: 研究結果為今后表達恒河猴CD1d蛋白并制備其四聚體進而研究恒河猴NKT細胞在眾多疾病中的作用奠定了基礎; 組織表達差異的研究結果提示其在相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要的角色, 具體作用還有待深入研究。 【關鍵詞】 CD1d; NKT細胞; 恒河猴; 組織分布 Abstract AIM: To amplify the CD1d and analyze its tissue distribution in Rhesus macaque. METHODS: Extracting total RNA from diffe

3、rent tissues of Rhesus macaque. CD1d amplification was carried using specific primers and tissue distribution was analyzed by semiquantification RTPCR, using the housekeeping gene GAPDH as an internal control. RESULTS: The CD1d coding region was obtained in this experiment and tissue distribution wa

4、s analyzed: a highest level of CD1d expression was detected in heart, liver and spleen, lower level in blood, lung, small intestine and stomach, and least in brain. CONCLUSION: The successful amplification of CD1d is useful to produce antiCD1d antibody and CD1dtetramer to study NKT cells in Rhesus m

5、acaque. The expression pro CD1d mRNA in Rhesus macaque is in accordance with the tissue distribution and the functions of NKT cells in other species. These results will provide important insights for future research on the relationship of CD1d/NKT cells and their roles in different tissues. Keywords

6、CD1d; NKT cells; Rhesus macaque; Tissue distributionCD1家族是一類非經(jīng)典的抗原遞呈分子, 包括CD1a、 b、 c、 d和e 5個成員, 其中CD1 a、 b、 c和e屬于第組, CD1d屬于第 組。在靈長類中兩類CD1分子均有表達, 但在小鼠等嚙齒類動物中僅表達CD1d, 稱為CD1d 11。CD1家族成員在進化中表現(xiàn)的非常保守。與經(jīng)典的抗原遞呈分子MHC結構類似, CD1d分子也包括胞膜外區(qū)（ 13）、 跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū), 并通過重鏈3結構域與2m非共價結合形成異源二聚體發(fā)揮抗原遞呈的功能; 與MHC不同的是, CD1d遞呈的是脂類抗原,

7、 而非肽類抗原。作為抗原遞呈分子, CD1d可以將外來或自身的脂類抗原遞呈給CD1d限制性的NKT細胞。NKT細胞是一類數(shù)量很少但很重要的免疫細胞, 在細胞免疫和體液免疫中均起重要作用2。鑒于NKT細胞表現(xiàn)出的CD1d限制性, 承載GalCer（一種從海綿中提取的鞘糖脂）的CD1d四聚體已經(jīng)成為檢測和認定NKT細胞的關鍵性標記之一3, 因此, 克隆并表達功能性的CD1d已經(jīng)成為研究NKT細胞的重要環(huán)節(jié)。 目前, 許多物種的CD1d基因序列已經(jīng)得到了公布, 其編碼區(qū)長度在不同物種中稍有差別, 人的CD1d基因編碼區(qū)全長有1 008 bp, 恒河猴為1 014 bp, 小鼠CD1d 為1 011

8、bp。盡管如此, 不同物種間CD1d的同源性及功能上均表現(xiàn)了高度的保守性。有研究表明, CD1d分子主要表達在脾細胞、 樹突狀細胞（DC）和胃腸道上皮細胞上。Canchis等4曾通過免疫組化染色方法檢測到人的CD1d在小腸、 肝臟、 胰臟、 腎臟、 胃以及皮膚等組織中均有表達。Kasai等5結合原位雜交及免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在大鼠的脾臟、 胸腺、 肝臟、 肺、 心臟、 腎臟、 小腸等組織中均有CD1d 1的表達。但尚未見到關于恒河猴的CD1d組織表達差異情況的詳細報道。本試驗中, 我們對人類疾病發(fā)生和治療等研究中被廣泛應用的非人靈長類動物模型恒河猴的CD1d分子進行了克隆和研究。成功克隆了恒河猴的

9、CD1d編碼區(qū)序列, 并首次用半定量RTPCR的方法檢測了部分組織中CD1d的表達情況, 為今后研究CD1d/NKT細胞的分布及其在不同組織中的功能特點給出了提示。 1 材料和方法 1.1 材料 恒河猴各組織總RNA由昆明動物研究所比較基因組學研究組提供; rTaq聚合酶 (DR001A)、 DNA Marker DL 2 000 (D501A)、 pMD19T（D102A）載體、 及其他生化常用試劑購自TaKaRa公司; 大腸桿菌DH5為中科院昆明動物研究室免疫生物學實驗室制備并保存; RNAprep培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒 （DP430）、 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 （DP21402）、 p

10、fu高保真聚合酶 （EP10101）、 TIANscript MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （ER10404）購自Tiangen公司; iCyclerTM Thermal Cycler PCR儀購自BioRad公司; Sal I （ER0641）和BamH I （ER0051）內(nèi)切酶購自Fermentas公司。 1.2 方法 1.2.1 組織cDNA模板的獲得 取10 L總RNA(約5 g), 按TIANscript MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的說明書進行反轉(zhuǎn)錄: 加入2 L dNTP (10 mol/L)和2 L oligo (dT)引物(10 mol/L), 混勻后70反應5 min; 冰上冷卻, 加入1 L

11、DTT, 4 L 5×First Strand Buffer, 混勻, 42反應2 min; 加入1 L反轉(zhuǎn)錄酶 MMLV (200 U), 42反應50 min; 最后95放置5 min終止反應即得到第1鏈cDNA。 1.2.2 基因的擴增、 質(zhì)粒的構建、 提取及鑒定 根據(jù)GenBank中恒河猴CD1d序列（NM_001033114）設計引物（表1）, 利用恒河猴血液的cDNA作模板進行擴增; 同時用管家基因GAPDH作為參照進行CD1d基因在各組織中表達差異性的半定量分析。用pfu高保真酶進行CD1d擴增的條件為: 50 L反應體系, 96預變性4 min, 擴增30個循環(huán)（95

12、變性30 s, 55退火30 s, 72延伸2 min）, 最后72充分延伸10 min。擴增完成后將產(chǎn)物進行加A處理: 50 L產(chǎn)物中加2 L dNTP和1 L rTaq, 72反應40 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測, 得到預期長度的片段后割膠回收, 然后連入pMD19T載體, 轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài), 菌液涂到含Amp的LB平板上, 37過夜培養(yǎng), 隨機挑取長出的克隆搖菌, 12 h后提質(zhì)粒; 提出的質(zhì)粒用Sal I和BamH I進行雙酶切鑒定, 鑒定正確的克隆送去測序, 進一步確認所得到的產(chǎn)物是恒河猴的CD1d基因。 1.2.3 恒河猴CD1d mRNA的組織表達差異性分

13、析 以管家基因GAPDH為參照, 用半定量RTPCR的方法檢測恒河猴不同組織中CD1d mRNA的表達水平。表1 擴增人和恒河猴的CD1d全長基因及GAPDH片段的引物 2 結果 2.1 恒河猴的CD1d基因的擴增 以人和恒河猴的血液cDNA為模板, 用如表1中設計的特異性引物擴增人和恒河猴的CD1d基因編碼區(qū), 經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)我們得到的片段長度為1 000 bp左右, 與預期結果相符（圖1）。 2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后連入pMD19T載體, 轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài), 涂含Amp的LB平板, 挑取長出的克隆搖菌, 12 h后提質(zhì)粒并用Sal I和BamH

14、 I進行雙酶切鑒定, 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)所提的重組質(zhì)粒中確實含有1 000 bp左右的插入片段（圖2）。 為進一步確認所得到的片段確為恒河猴CD1d基因, 我們將初步鑒定正確的克隆送出測序。測序結果顯示, 我們得到的片段為1 014 bp, 經(jīng)BLAST序列比對顯示該序列與GenBank中恒河猴的CD1d序列一致編碼336個氨基酸, 用EditSeq軟件預測其蛋白的相對分子質(zhì)量（Mr）約為37 861, 說明我們成功獲得了恒河猴CD1d的編碼區(qū)序列, 為今后表達該蛋白和研究該分子的功能奠定了基礎。 2.3 恒河猴CD1d mRNA的組織表達分布情況的初步分析 以恒河猴血液及各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的c

15、DNA為模板, 用管家基因GAPDH (669 bp)為參照對不同組織中CD1d（1 014 bp）的表達水平進行了檢測（圖3）, 結果表明, 檢測的各組織中均有CD1d mRNA的表達, 但以心臟、 肝臟和脾臟中表達最多, 小腸、 血液、 肺和胃中的表達相對較少, 腦中CD1d的表達水平最低。 3 討論 Canchis等利用免疫組化和原位雜交的方法檢測了人和大鼠中的CD1d在各組織中的表達情況4, 5, 而恒河猴CD1d的組織表達譜至今還沒有研究報道。本試驗中, 我們利用半定量RTPCR的方法對恒河猴CD1d mRNA在不同組織中的表達情況進行了檢測。結果發(fā)現(xiàn), CD1d在心臟、 肝臟和脾臟

16、中表達水平最高, 血液、 小腸、 肺和胃中相對較少, 腦中CD1d的表達水平最低, 這種表達模式與以往關于CD1d/NKT細胞的研究比較吻合。眾所周知, 肝臟承載著機體的新陳代謝和固有免疫等重要功能。研究證明, 肝臟中NKT細胞的比例是最多的, 而且CD1d/NKT細胞在抵抗HBV感染和發(fā)病、 肝細胞腫瘤免疫等方面都發(fā)揮著重要的作用6, 因此, 我們推測恒河猴肝臟中CD1d高表達的現(xiàn)象可能與NKT細胞在肝臟中抗病毒感染等免疫功能相關, 這給我們一定的提示, 有助于進一步研究肝臟NKT細胞的功能, 也提示我們可以利用CD1d限制性制備針對NKT細胞的相關疫苗來防治肝臟腫瘤和病毒感染性疾病。NKT

17、細胞在自體免疫反應和免疫耐受等疾病中也有重要影響, 研究表明, 脾外周B細胞高水平表達的CD1d分子及其活化的NKT細胞可以抑制1型糖尿病的發(fā)生7。本實驗的結果也驗證了在恒河猴脾組織中能檢測到高表達的CD1d, 借此結果, 我們可以進一步研究脾中的NKT細胞與1型糖尿病的關系, 從而找到治療1型糖尿病的方法。另外, 研究發(fā)現(xiàn), 巨噬細胞表達的CD1d所活化的NKT細胞會聚集到心臟的發(fā)炎部位8, 而本研究中我們又證明恒河猴的心臟中CD1d的表達水平較高, 可以推測其與心臟相關疾病的免疫是密切相關的。 CD1d和NKT細胞對于機體抗感染及抵抗病毒感染等具有重要作用, 但其機理和具體的分子機制尚不明

18、確, 需進一步的研究和補充。本實驗中得到了恒河猴CD1d在不同組織中的表達差異情況, 與以往的研究結果有很強的相關性, 提示我們可以以恒河猴為動物模型深入研究其CD1d分子與NKT細胞的關系和相互作用, 并研究NKT細胞在不同組織中的免疫功能, 進而為相關疾病的治療, 抗病毒感染及抗腫瘤免疫等研究提供基礎和依據(jù)。 致謝: 感謝中國科學院昆明動物研究所比較基因組學實驗室提供的恒河猴組織RNA; 感謝試驗過程中李德敏老師提供的幫助和建議?！緟⒖嘉墨I】 1 Brossay L, Kronenberg M. Highly conserved antigenpresenting function of

19、CD1d moleculesJ. Immunogenetics, 1999, 50(3): 146-151.2 Taniguchi M, Seino K, Nakayama T. The NKT cell system: bridging innate and acquired immunityJ. Nat Immunol, 2003, 4(12): 1164-1165.3 Li D, Chen N, McMichael AJ, et al. Generation and characterisation of CD1d tetramer produced by a lentiviral expression systemJ. J Immunol Methods, 2008, 330(1-2): 57-63.4 Canchis PW, Bhan AK, Landau SB, et al. Tissue distribution of the nonpo