改變組織醛固酮及其受體表達(dá)對SHR大鼠腎臟纖維化的影響

1、改變組織醛固酮及其受體表達(dá)對SHR大鼠腎臟纖維化的影響 作者：成彩聯(lián)， 婁探奇， 湯 穎， 石成鋼， 陳珠江 【摘要】 【目的】觀察改變腎組織醛固酮及其受體水平對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響?！痉椒ā?周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR） 24只及同源正常京都大鼠（WKY） 8只，SHR分為貝那普利干預(yù)組30 mg/(kg·d)、大劑量安體舒通干預(yù)組100 mg/(kg·d)和高血壓模型對照組，同時設(shè)同源的正常對照組，干預(yù)時間為8周，檢測收縮壓、尿蛋白、血白蛋白、尿素氮、肌酐、腎組織醛固酮受體、TGF-1的mRNA和蛋白表達(dá)?！窘Y(jié)果】貝那普利能下調(diào)組織醛固酮（15.8&

2、#177;2.6）vs(22.2±0.6）pg/mg及其受體水平(15±4)vs(13±5)PU并減輕腎臟纖維化(17.0±1.8)vs(20.0±2.3)PU，均為P< 0.05；大劑量安體舒通能上調(diào)組織醛固酮（24.3±4.6）vs(22.2±0.6）pg/mg及其受體水平(16±6)vs(13±5) PU并加重腎臟纖維化(22.6±3.0)vs(20.0±2.3)PU，均為P< 0.05?！窘Y(jié)論】腎組織醛固酮及其受體水平的改變可能影響高血壓腎臟纖維化的

3、過程。 【關(guān)鍵詞】 醛固酮； 醛固酮受體； 調(diào)節(jié)； 高血壓； 腎臟纖維化高血壓主要通過促進(jìn)動脈硬化形成導(dǎo)致的腎組織缺血性病變及通過腎小球高壓力、高灌注、高濾過導(dǎo)致腎臟病變。醛固酮作為腎臟纖維化進(jìn)程中的一個重要因素，已成為腎臟纖維化研究中的熱點(diǎn)之一。醛固酮受體在器官纖維化中的作用也開始受到重視1，并有學(xué)者嘗試改變靶器官中醛固酮受體的表達(dá)來影響器官纖維化的進(jìn)程2。但醛固酮受體在器官纖維化中作用的研究多集中在心臟方面，在腎臟領(lǐng)域研究很少。本研究旨在研究改變?nèi)┕掏荏w表達(dá)對腎臟纖維化的影響。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組 24只8周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hyp

4、ertensive rats, SHR），質(zhì)量200250 g，購自上海市高血壓研究所。SHR分為大劑量安體舒通干預(yù)組100 mg/（kg·d）；貝那普利干預(yù)組30 mg/（kg·d）（將藥物溶于4 ml飲用水中灌胃）；高血壓模型組；同時設(shè)同源的正常對照組京都大鼠（WKY）8只，高血壓對照組及正常對照組予4 mL飲用水灌胃，干預(yù)時間為8周。 1.2 觀察指標(biāo)及檢測方法 1.2.1 收縮壓 大鼠的收縮壓采用RBP-1B型大鼠血壓計(jì)進(jìn)行測量。 1.2.2 尿蛋白和血生化（白蛋白、尿素氮、肌酐） 采用OLYPUS AU640全自動生化分析儀檢測。 1.2.3 血漿和組織醛固酮含量

5、測定 取血2 mL，加入肝素20 ?滋L抗凝，3000 r/min離心10 min（r20 cm），取上清測血漿醛固酮含量（pg/mL）；取待測腎組織稱重后加入0.5 mol/L的乙酸，100 水浴15 min，冷卻后勻漿，12000 r/min離心15 min，取上清液檢測組織醛固酮含量（pg/mg）。測試盒由北京北方免疫試劑研究所提供，按試劑說明書操作。 1.2.4 腎小管間質(zhì)損傷評分 切片進(jìn)行HE染色，參照文獻(xiàn)3進(jìn)行評分，200倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇10個不含腎小球的視野。腎小管間質(zhì)病變由3個參數(shù)判定（小管擴(kuò)張和蛋白管型；炎癥細(xì)胞浸潤；間質(zhì)纖維化）每個參數(shù)按03分評定（0正常，1輕度

6、受損，2中度受損，3重度受損）。每個樣本小管間質(zhì)的評分為09分。 1.2.5 腎小球內(nèi)膠原沉積 切片進(jìn)行MASSON染色，參照文獻(xiàn)4進(jìn)行評分，200倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇腎組織內(nèi)5個腎小球，利用圖像分析系統(tǒng)，首先檢測腎小球總面積，再檢測相應(yīng)腎小球內(nèi)膠原的總OD(光密度)值（藍(lán)色代表膠原纖維），計(jì)算膠原纖維OD/腎小球總面積，代表膠原纖維的含量。 1.2.6 腎組織轉(zhuǎn)化生長因子和醛固酮受體mRNA 采用RT-PCR方法，TRIZOL試劑購于Invitrogen Life Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自晶美生物公司，PCR反應(yīng)預(yù)混液購自寶生物工程（大連）有限公司。取總量為4 ?

7、滋g的總RNA，以Random Primer為引物合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：GAPDH（725 bp）：94 2 min，94 30 s，52 30 s，72 45 s，72 10 min，32個循環(huán)；TGF-1（432 bp）：94 2 min，94 30 s，52 30 s，72 45 s，72 10 min，32個循環(huán)；MR（486 bp）：94 2 min，94 1 min，49 1 min，72 1 min，72 10 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)掃描照相，分析電泳帶的

8、灰度，以與內(nèi)參照GAPDH的條帶密度A值之比半定量表達(dá)水平。 1.2.7 腎組織TGF1和醛固酮受體蛋白 采用免疫組化方法，兔抗大鼠TGF-1單克隆抗體（使用濃度為1 100）購自Santa Cruz公司，抗兔SABC免疫組化試劑盒購自北京中山生物有限公司，山羊抗大鼠醛固酮受體多克隆抗體（使用濃度為1 50）及抗山羊SABC免疫組化試劑盒均購自Santa Cruz公司。用德國 KONTRON IBAS 2.5全自動圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化結(jié)果定量分析5。 1.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.0，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩

9、比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊資料采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較，等級資料采用秩變換分析方法進(jìn)行比較，=0.05。 2 結(jié) 果 2.1 血漿及組織醛固酮水平、醛固酮受體mRNA和蛋白的表達(dá)情況 高血壓對照組大鼠腎臟的醛固酮及其受體均高于正常對照組（P< 0.05），貝那普利干預(yù)后，腎臟的醛固酮及其受體較高血壓對照組明顯降低(P< 0.05)；而大劑量安體舒通干預(yù)后，腎臟的醛固酮及其受體較高血壓對照組明顯升高(P< 0.05)，見圖1、圖2和表1。 2.3 臨床指標(biāo) 高血壓對照組大鼠自實(shí)驗(yàn)開始時（8周齡）已出現(xiàn)高血壓，此后，隨著周齡增大，血壓

10、逐漸升高，在觀察時間為8周（16周齡）時血壓已升至180 mmHg左右，出現(xiàn)明顯的蛋白尿和低白蛋白血癥(P< 0.05)，血尿素氮和肌酐水平與正常對照組無明顯區(qū)別(P >0.05)，正常對照組大鼠整個觀察時間內(nèi)都沒有出現(xiàn)高血壓。貝那普利干預(yù)后，血壓逐漸下降，尿蛋白明顯降低（P< 0.05），血白蛋白水平升高（P< 0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后，血壓沒有明顯改變(P >0.05)，尿蛋白升高（P< 0.05），血白蛋白減少（P< 0.05）；血尿素氮和肌酐水平在各組間無明顯區(qū)別（P &g

11、t;0.05），見表2。 2.4 病理指標(biāo) 與正常對照組相比，高血壓對照組可以看到蛋白管型，小管擴(kuò)張，管周炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)膠原形成增多（P< 0.05）；貝那普利干預(yù)后，腎小球內(nèi)膠原形成明顯減少（P< 0.05）；安體舒通干預(yù)后，膠原形成明顯增多（P< 0.05），見圖3和表3。 2.5 腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達(dá) 高血壓對照組腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達(dá)比正常對照組高（P< 0.05），貝那普利干預(yù)后，腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達(dá)較高血壓對照組明顯降低（P< 0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后

12、，腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高，與高血壓對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P< 0.05），見圖4、圖5和表3。 3 討 論 腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)對體內(nèi)體液平衡和血壓調(diào)節(jié)起著主要作用，醛固酮是有絲分裂和膠原合成的強(qiáng)烈刺激劑，可以促進(jìn)心肌和腎臟纖維化6。醛固酮受體作為其中的一個重要環(huán)節(jié)，可能在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠血壓升高，尿蛋白明顯增多，白蛋白明顯下降，腎小球內(nèi)膠原沉積增多，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤、小管擴(kuò)張、蛋白管型、腎臟損傷明顯，腎臟的TGF1mRNA和蛋白表達(dá)也比正常對照組高，提示高血壓可導(dǎo)致腎損傷和腎臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)同時觀

13、察到SHR組大鼠血漿和組織的醛固酮水平及腎組織的醛固酮受體mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于正常對照組。Delano等7亦觀察到自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜毛細(xì)血管上醛固酮受體的密度高于正常對照組，導(dǎo)致對醛固酮的反應(yīng)升高的報(bào)道相符。由此我們設(shè)想，腎組織醛固酮及其受體的水平升高可能參與了腎損害的過程，改變腎臟醛固酮及其受體水平可能對腎臟纖維化有所影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)予貝那普利下調(diào)腎臟的醛固酮及其受體表達(dá)后，蛋白尿明顯減少，血白蛋白明顯增高；腎小球內(nèi)的膠原形成明顯減少，腎小管的擴(kuò)張減輕，小管上皮細(xì)胞基本恢復(fù)正常，基本看不到蛋白管型，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤減輕，與Beggah等2用反義RNA鏈減少醛固酮受體表達(dá)后心臟

14、纖維化減輕的現(xiàn)象相似。同時予大劑量安體舒通上調(diào)腎臟醛固酮及其受體的水平后，尿蛋白明顯增加，血白蛋白水平下降，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤加重，血管壁增厚、玻璃樣變、血管腔縮小甚至閉塞、腎小管萎縮、蛋白管型、腎小球內(nèi)膠原形成增多等病變，有部分腎小球硬化，腎間質(zhì)的TGF1mRNA和蛋白表達(dá)增高，與Yoshida 1報(bào)道的舒張性心力衰竭心肌組織中醛固酮受體的表達(dá)增高促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)展有相似之處，盡管觀察的靶器官不同。以上結(jié)果提示，改變組織醛固酮及其受體水平可能影響腎臟纖維化的進(jìn)程，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。 雖然有其他措施可以下調(diào)腎臟醛固酮受體的表達(dá)，如環(huán)孢霉素A（CsA）等，但這些措施在臨床實(shí)際應(yīng)用中并不可行，

15、或存在其它對機(jī)體不利的因素。目前國內(nèi)外尚未見到ACEI下調(diào)腎臟醛固酮受體的相關(guān)報(bào)道，De Resende等8研究發(fā)現(xiàn)卡托普利可以使梗死的心肌組織中升高的醛固酮受體表達(dá)恢復(fù)正常，但對腎組織正常表達(dá)的醛固酮受體沒有影響。我們觀察到的結(jié)果不同可能與所使用的動物模型不同有關(guān)。本研究的發(fā)現(xiàn)為ACEI治療腎臟纖維化提供了新的依據(jù)，同時也提示這可能是ACE治療腎臟纖維化的部分機(jī)制。 大劑量安體舒通上調(diào)腎臟醛固酮受體的表達(dá)后，腎組織中升高的醛固酮受體不但因結(jié)合了大量的安體舒通表現(xiàn)出激動效應(yīng)9，而且還有部分醛固酮受體可結(jié)合醛固酮，兩種效應(yīng)相加，加重了腎臟纖維化。目前關(guān)于大劑量安體舒通上調(diào)醛固酮受體僅在大腦有報(bào)道

16、10。國內(nèi)外雖然也有個別關(guān)于大劑量安體舒通導(dǎo)致腎臟纖維化加重的報(bào)道12，但未見上調(diào)腎臟醛固酮受體的報(bào)道。本研究結(jié)果提示大劑量安體舒通可能加重腎臟纖維化，為臨床正確掌握使用安體舒通的劑量提供了一定的參考意見。 本研究結(jié)果提示，醛固酮及其受體的表達(dá)水平與高血壓致腎臟纖維化可能有關(guān)，改變其表達(dá)水平可能影響腎臟纖維化的進(jìn)程?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 YOSHIDA M, MA J, TOMITA T, et al. Mineralocorticoid receptor is overexpressed in cardiomyocytes of patients with congestive heart fail

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