熱休克蛋白70對供心一氧化氮及一氧化氮合酶表達的影響VIP

1、熱休克蛋白70對供心一氧化氮及一氧化氮合酶表達的影響【摘要】 目的 探討熱休克蛋白70 (HSP70) 對供心一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影響。方法 Wistar 大鼠18只,分為2組：對照組(C，n = 9)，腹腔注射生理鹽水0.5 ml，24 h后取離體心臟灌注康斯特保護液（HTK液）,4保存3 h后建立Langendorff離體心臟灌注模型,灌注KH液2 h；實驗組(E,n = 9)腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1mol/kg(0.53mg/kg)，腹腔注射24 h后取離體心臟,處理方法同C組。測定心肌HSP70含量、NO、NOS的含量以及相關生化指標并

2、做統(tǒng)計學處理比較。 結果 HSP70含量E組較C組明顯增高(P<0.01) ,NO、NOS的含量E組較C組明顯增多(P<0.01) ,生化指標E組明顯優(yōu)于C組。結論 心肌HSP70高表達對供心具有明顯的保護效應，并且其促進心肌NO、NOS的表達,可能是HSP70發(fā)揮心肌保護作用的因素之一。 【關鍵詞】 熱休克蛋白70；一氧化氮；一氧化氮合酶Abstract: OBJECTIVE To investigate the protection of heat shock protein 70 on donor heart and the effects on expres

3、sion of myocardial cell nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) of isolated rat heart. METHODS 18 Wistar rats were randomly divided into 2 groups. Control group (C,n = 9) ,Normal saline 0.5ml was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 for 3 hours wit

4、h Histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solutions, and then isolated hearts were perfused for 2 hours by Langendorff model. Experimental group (E,n = 9), Noradrenaline Bitartrate 3.1mol/kg(0.53mg/kg) was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 for 3 hours wi

5、th HTK,and then isolated hearts were perfused for 2 hours with Krebs-Henseleit (K-H) solutions by Langendorff model. Myocardial HSP70 content , the expression of NO，NOS and related biochemical indicators were detected. RESULTS HSP70 ，NO and NOS in E group are higher than those in C group and biochem

6、ical indicators in E group is better than that in C group . CONCLUSION This study demonstrated that the high expression of HSP70 has obvious protection on donor heart ,and it can markedly affect the expression of NO，NOS of isolated rat heart and it is perhaps one of important factors for myocardial

7、protection.Key words： Heat shock protein 70；Nitric oxide；Nitric oxide synthase熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一組所有的細胞能在應激情況下由熱休克基因所編碼合成的序列高度保守的伴隨細胞蛋白, 并能對抗更為嚴重的應激損傷, 研究發(fā)現(xiàn)在高溫、缺氧、再灌注、局部損傷或感染等多種有害因素1刺激均可產(chǎn)生熱休克蛋白。HSP70是HSP中最保守、最主要、含量最豐富的一類。實驗表明一氧化氮(NO) 、一氧化氮合酶(NOS) 作為效應因子可介導心肌缺血再灌注損傷的保護作用, HSP70心肌保護作用是否與供心

8、缺血再灌注后NO、NOS表達有關尚未可知,本實驗的目的是探討HSP70在發(fā)揮供心心肌保護作用時與NO、NOS的關系。1 資料與方法1.1 實驗動物和分組 雄性Wistar大鼠18只,體重250350 g,由青島市藥檢所動物中心提供,隨機分為2組(n=9):對照組(C組):腹腔注射生理鹽水0.5 ml,注射后24 h取離體心臟,灌注Histidine-tryptophan-ketoglutarate(HTK)心臟保護液,儲存于4保存液中3 h,然后心臟行Langendorff灌注Krebs-Henseleit(K-H)液2 h；實驗組(E組),腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1

9、mol/kg(0.53mg/kg)，24 h后取離體心臟,余處理步驟同C組。心臟灌流結束后取左室心肌組織測定。HTK液和KH液自行配制2，配制試劑購自上?；菖d生化試劑有限公司。1.2 測定指標1.2.1 心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）10min漏出率測定。復灌后10min ,留取冠脈流出液,置于-20冰箱中保存,以備測定心肌酶漏出量。全自動生化分析儀測定CK、LDH濃度。單位: IU/(10min·g)。CK(LDH)漏出率=CK（或LDH）（IU/L）×10min漏出液 1000×心肌濕重(g)1.2.2 心肌含水量（MWC）測定。實驗結束后在固定部

10、位取心室肌約100 mg，先用濾紙吸干心肌表面水分，使用電子天平稱心肌濕重。然后將心肌置入100恒溫烤箱烘烤5 h，待恒重后稱干重，計算MWC。單位：%。MWC= 心肌濕重-心肌干重心肌濕重×100% 。1.2.3 心肌NO、NOS含量測定。試驗結束后在同一部位取心肌組織約200 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測定前稱重，剪取100 mg左右心肌組織塊,研磨成10 %勻漿,低溫離心,取上清液,測定上清液中NO、NOS含量(化學法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，嚴格按操作步驟進行測定)。1.2.4 免疫組織化學法檢測心肌組織HSP70含量。試驗結束后在同一部位取左室心肌組織，10

11、%甲醛液固定，制備石蠟切片。免疫組化染色嚴格按照說明書進行（采用SP法，試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司提供）。HSP70表達位于心肌細胞細胞質, DAB染色棕色顆粒為陽性產(chǎn)物。光鏡觀察后應用MPIAS-1000型多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析, 并自動測量染色陽性面積。每張切片隨機選10個視野(×400) , 以染色陽性面積占視野面積的百分比的均值作為HSP70的表達量。1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( ±s )表示,使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，相關關系采用直線相關分析。2 結果2.1 心肌HSP70、NO、NOS的含量 HSP7

12、0表達量E組明顯高于C組(t=17.96，P<0.01)，見圖1、圖2；心肌NO、NOS的含量E組明顯高于C組 (t=4.96，P<0.01；t=7.19，P<0.01) ,見表1。表1 心肌HSP70表達、NO、NOS的含量（略）注：*與C組比較，P<0.01圖1 E組HSP70表達（×400） （略）圖2 C組HSP70表達（×400）（略）2.2 心肌生化指標 LDH和CK 10 min漏出率、MWC含量E組較C組明顯降低(t=15.81，P<0.01；t=9.82,P<0.01；t=

13、4.13,P<0.01),見表2。表2 心肌組織的CK和LDH10min漏出率、MWC（略）注：與C組比較，P<0.013 討論 熱休克蛋白又稱應激蛋白，參與細胞的損傷與修復。HSP70 是一族最保守和最重要的熱休克蛋白家族。HSP70 在應激后生成最為顯著, 它作為分子伴侶參與細胞內蛋白質的折疊、裝配,維持某些肽鏈的伸展狀態(tài),以利其跨膜轉位，在線粒體、內質網(wǎng)等不同的區(qū)域內發(fā)揮作用，在細胞的信息傳遞、生長、分化中具有重要的調控作用,同時它又可以促進某些變性蛋白質的降解清除，重新激活某些酶的活性，維持細胞的正常生理功能，作為一種內源性保護物質對臟器損傷產(chǎn)生自身保護作用

14、3。目前國內外已有許多實驗證明了HSP70在心肌缺血再灌中發(fā)揮了保護作用。NO、NOS 在心肌缺血再灌注中的作用引起人們的注意并進行了廣泛的研究, 大量證據(jù)表明NO系統(tǒng)在缺血再灌注過程中扮演著重要角色, 但研究結果分歧較大。有人認為NO、NOS 可能是減輕心臟缺血再灌注損傷的保護性因素之一4-6，對HSP70發(fā)揮供心保護作用是否與NO、NOS有關，關系如何也少有報道。 心臟移植是終末期心臟病確定的治療手段 ,供心保護效果在很大程度上決定了移植的成功與否,并對移植后的遠期療效也起到重要作用。心臟移植過程要經(jīng)歷常溫缺血、低溫保存、以及缺血后的再灌注。目前理論研究和臨床實踐都證實了心肌缺血再灌注損傷

15、的存在7-8,低溫保存的目的是降低組織代謝, 減少缺氧組織對營養(yǎng)的需求, 但是也同時破壞了正常的生理狀態(tài), 一定程度上加重心肌結構和功能的損害9。本實驗模擬心臟移植過程，將離體供心經(jīng)過3個小時的低溫保存（兩組均采用目前成功應用于臨床并具有卓越心肌保護作用的HTK液作為心肌保護液）后進行再灌注，結果表明，與C組比較, E組在再灌注期間,LDH、CK的漏出率及MWC含量減少, E組NO、NOS的含量明顯高于C組，說明NO、NOS在心臟移植過程中對供心心肌缺血再灌注及低溫保存期間的損傷具有保護作用。本實驗證明心肌NO、NOS的含量與HSP70的表達呈明顯的正相關(r =0.887，0.953) ，證

16、實了HSP70可促進供心心肌細胞NO、NOS的表達，這也提示我們HSP70促進NO、NOS的表達可能是其發(fā)揮供心心肌保護作用的機制之一。【參考文獻】 1 Morimoto R, Sarge KD, A bravya K. Transcriptional regulation of heat shock genes:a paradigm for inducible genomic responseJ. J Bio l Chem,1992,267(31):21987-21990.2 張濤，高長青，李佳春，等.康斯特保護液對中低溫離體大鼠心肌的保護作用J.中國體外循環(huán)雜志，2006，4（1）：33-

17、35.3 Gusarova V,Caplan AJ,Brodsky JL,et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecular chaperones HSP90 and HSP70J.J Biol Chem,2001,276(27):24891-24892.4 Sumeray MS ,Rees DD , Yellon DM. Infarct size and nitric oxide synthase in murine myocardiumJ. J Mol Cell Cardiol . 2000 ,32(1) :35-42.5 Hannan RL , John MC, Kouretas PC,et al. Deletion of endothelial nitric oxide synthase exacerbates myocardial stunning in an isolated mouse heart model J. J Surg Res,2000,93(1) :127-132.6 Zingarelli B, Hake PW,Yang Z,et al. Absense of inducible nitric oxide synthase modulates early reperfusion