食品中化學(xué)物質(zhì)的基礎(chǔ)毒性評(píng)價(jià)

1、第六章 食品中化學(xué)物質(zhì)的基礎(chǔ)毒性評(píng)價(jià) 毒理學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)。本章介紹最基本的毒理學(xué)試驗(yàn)，包括系統(tǒng)毒性和局部毒性的研究?；A(chǔ)毒性是與特殊毒性相對(duì)應(yīng)的，特殊毒性主要是指致癌作用、致突變作用、致畸和生殖毒性等?；A(chǔ)毒性研究是化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)和危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的重要組成部分。另一方面，對(duì)外源化學(xué)物系統(tǒng)毒性研究可能發(fā)現(xiàn)其毒作用的靶器官，為進(jìn)一步的靶器官毒理學(xué)研究和中毒機(jī)制研究提供線索。第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn) 急性毒性試驗(yàn)是毒理學(xué)研究中最基礎(chǔ)的工作，是我們了解外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的急性毒性的根本依據(jù)。1927年Trevan引入了半數(shù)致死量(LD50)的概念來評(píng)價(jià)急性毒性，此后，該指標(biāo)得到廣泛應(yīng)用，并成為急性毒性的

2、主要指標(biāo)?；瘜W(xué)物的急性毒性資料對(duì)于安全性評(píng)價(jià)及化學(xué)物管理方面非常重要。對(duì)急性毒性試驗(yàn)程序國際上和我國已有一些法規(guī)。以下就試驗(yàn)程序的基本原則和進(jìn)展作一介紹。一、急性毒性和急性毒性試驗(yàn)的目的 急性毒性是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次接觸或24小時(shí)內(nèi)多次接觸某一化學(xué)物所引起的毒效應(yīng)，甚至死亡。對(duì)于上述定義中的“一次”接觸在經(jīng)呼吸道與皮膚染毒時(shí)，指在一個(gè)規(guī)定的期間內(nèi)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)接觸化學(xué)物的過程。而“多次”的概念是指當(dāng)外源化學(xué)物毒性很低時(shí)，即使一次給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最大染毒容量還觀察不到毒性作用，同時(shí)該容量還未達(dá)到規(guī)定的限制劑量時(shí)，便需要在24小時(shí)內(nèi)多次染毒，從而達(dá)到規(guī)定的限制劑量。 急性毒性試驗(yàn)的目的： 1. 評(píng)價(jià)化學(xué)物

3、對(duì)機(jī)體的急性毒性的大小、毒效應(yīng)的特征和劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，并根據(jù)LD50值進(jìn)行急性毒性分級(jí)。 2. 為亞慢性、慢性毒性研究及其他毒理試驗(yàn)接觸劑量的設(shè)計(jì)和觀察指標(biāo)的選擇提供依據(jù)。 3. 為毒作用機(jī)制研究提供線索。 通過外源化學(xué)物的急性毒性試驗(yàn)，可以得到一系列的毒性參數(shù)，包括：絕對(duì)致死劑量或濃度(LD100或LCl00)；半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)；最小致死劑量或濃度(MLD，LD01或MLC，LC01)；最大耐受劑量或濃度(MTD，LD0或MTC，LC0)，或稱為最大非致死劑量(MNLD)。以上4種參數(shù)是外源化學(xué)物急性毒性上限參數(shù)，以死亡為終點(diǎn)。此外，還可以得到急性毒性下限參數(shù)

4、，即：急性毒性LOAEL(觀察到有害作用的最低劑量)；急性毒性NOAEL(未觀察到有害作用的劑量)。這兩個(gè)參數(shù)則是以非致死性急性毒作用為終點(diǎn)。因此，急性毒性試驗(yàn)可以分為兩類。一類是以死亡為終點(diǎn)，以檢測(cè)受試物急性毒性上限指標(biāo)為目的的試驗(yàn)，這類試驗(yàn)主要是求得受試物的LD50值。另一類急性毒性試驗(yàn)檢測(cè)非致死性指標(biāo)。二、經(jīng)典急性致死性毒性試驗(yàn)OECD(1987)關(guān)于經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)規(guī)定如下。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首選大鼠。應(yīng)設(shè)足夠的劑量組，至少3組，組間有適當(dāng)?shù)膭┝块g距，產(chǎn)生一系列毒性和死亡率，以得到劑量-反應(yīng)關(guān)系和求得LD50。每組至少同性別5只動(dòng)物，如用雌性動(dòng)物，應(yīng)未產(chǎn)和未孕。限量試驗(yàn)劑量為2000mg/kg體

5、重，用雌雄各5只動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。觀察期14天，臨床觀察每天至少一次，觀察皮膚、被毛、眼睛和粘膜改變、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)和行為方式的變化，特別要注意有無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡、昏迷等現(xiàn)象。準(zhǔn)確記錄死亡時(shí)間。于染毒前、染毒后每周和死亡時(shí)測(cè)定體重。所有的動(dòng)物均應(yīng)進(jìn)行大體尸體解剖，并記錄觀察到的全部病變，存活24小時(shí)以上的動(dòng)物必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查?？捎萌魏我环N公認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算LD50的值及95的可信限范圍，如B1iss法，Litchfield和Wilcoxon法，F(xiàn)inney法，Weil法，Thompson法，Miller和Tainter法等。 有關(guān)經(jīng)典急性致死性毒性試驗(yàn)的

6、要點(diǎn)如下： 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和處置 試驗(yàn)要求健康成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般是在小鼠、大鼠等動(dòng)物中測(cè)半數(shù)致死量，并在狗中觀察毒性反應(yīng)。一般嚙齒類動(dòng)物年齡與體重相關(guān)，故可以用體重表示動(dòng)物年齡。急性毒性試驗(yàn)一般用大鼠180240g，小鼠1825g，家兔22.5kg，豚鼠200250g，狗1015kg。不同品系的同種動(dòng)物年齡相同會(huì)出現(xiàn)體重不同，以小鼠為例，純系小鼠如C57BL6、BALB/C體重較小，而同年齡的昆明種小鼠則體重較大。試驗(yàn)動(dòng)物體重變異范圍不應(yīng)超過平均體重的20。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)當(dāng)是雌、雄各半，雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求是未經(jīng)交配和受孕的。如果發(fā)現(xiàn)受試化學(xué)物急性毒性有性別差異時(shí)，應(yīng)分別求出雌性與雄性動(dòng)物的L

7、D50值。如果試驗(yàn)是為致畸試驗(yàn)作劑量準(zhǔn)備，也可僅做雌性動(dòng)物的LD50試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行檢疫，檢疫期一般為57天，剔除異常的動(dòng)物。檢疫期與實(shí)驗(yàn)期間雌、雄動(dòng)物必須分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法隨機(jī)分組。染毒途徑應(yīng)模擬人可能的接觸途徑。經(jīng)口灌胃染毒，要求試驗(yàn)前要對(duì)動(dòng)物禁食。大鼠應(yīng)過夜禁食，小鼠應(yīng)禁食4小時(shí)。 大動(dòng)物則在每日上午喂食前給以受試化學(xué)物。染毒后繼續(xù)禁食24小時(shí)。但在禁食時(shí)要保障飲水的供應(yīng)。 2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)之前，首先要了解受試外源化學(xué)物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)(液態(tài)、固態(tài)或氣態(tài))、生產(chǎn)批號(hào)、純度、雜質(zhì)成分與含量、溶解度、揮發(fā)度、pH值(可測(cè)時(shí))等等。然后根

8、據(jù)該受試物有關(guān)的測(cè)試規(guī)范要求，決定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)于一個(gè)新的受試化學(xué)物，我們可以先查閱文獻(xiàn)找到與受試化學(xué)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相近的化學(xué)物毒性資料，取與本實(shí)驗(yàn)相同動(dòng)物物種或品系，相同染毒途徑的LD50值作為參考值，選擇劑量系列。例如，要測(cè)定氯乙酸的大鼠經(jīng)口LD50，查文獻(xiàn)可知乙醇大鼠經(jīng)口LD50為10.8gkg體重，乙酸為3.4gkg體重，氯乙醇為71mg/kg體重。故氯取代可增強(qiáng)毒性，推測(cè)氯乙酸的大鼠經(jīng)口LD50應(yīng)與氯乙醇相近，實(shí)測(cè)結(jié)果為78mg/kg體重。 劑量選擇是否恰當(dāng)是急性毒性試驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ幕A(chǔ)。就嚙齒類動(dòng)物而言，總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間隔(一般是按幾何級(jí)數(shù))給藥，找出10

9、90(或0100)的致死劑量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)以合適的間距設(shè)幾個(gè)劑量組。在利用不同的方法計(jì)算化學(xué)物L(fēng)D50時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)劑量設(shè)計(jì)和動(dòng)物數(shù)的要求不同。急性致死性毒性試驗(yàn)可以不設(shè)陰性對(duì)照組。 3. 觀察 染毒后一般要求觀察14天。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒癥狀，對(duì)于獲得受試化學(xué)物的急性毒性特征十分重要，有助于了解該化學(xué)物的靶器官。還應(yīng)注意觀察記錄發(fā)生每種癥狀的時(shí)間、癥狀表現(xiàn)程度、各癥狀發(fā)展的過程及死亡前特征和死亡時(shí)間。臨床中毒反應(yīng)和死亡時(shí)間可提供中毒機(jī)制的線索。如染毒后立即出現(xiàn)驚厥、共濟(jì)失調(diào)和死亡可能是神經(jīng)毒性。經(jīng)一段潛伏期后的遲發(fā)性死亡可能提示對(duì)腎或肝的作用。腹瀉和或豎毛，可能為植物神經(jīng)興奮。

10、 有些化學(xué)物(如有機(jī)磷類化合物)中毒癥狀發(fā)展迅速且很快死亡。而有些化學(xué)物的中毒癥狀發(fā)展緩慢，甚至出現(xiàn)癥狀緩解，此后再發(fā)生嚴(yán)重癥狀而死亡。如碳基鎳染毒早期先出現(xiàn)上呼吸道癥狀，當(dāng)日即可緩解，23日后或更晚些才出現(xiàn)嚴(yán)重的肺水腫，呼吸困難而死亡。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體對(duì)受試化學(xué)物的反應(yīng)性快慢也有差異，如過氧化二碳酸二環(huán)已酯給小鼠腹腔注射后，在同一劑量組中最早死亡的可在染毒后7小時(shí)，而最遲的可達(dá)染毒后150小時(shí)。對(duì)于速殺性化學(xué)物也可僅根據(jù)24小時(shí)的死亡數(shù)計(jì)算LD50。有些速殺性化學(xué)物(如久效磷)，其24小時(shí)的LD50與14天的LD50沒有差別。若是報(bào)告24小時(shí)的LD50，則應(yīng)在試驗(yàn)結(jié)果中加以說明。在實(shí)際工作中，

11、應(yīng)該根據(jù)受試物的有關(guān)測(cè)試規(guī)程的要求來確定觀察期的長短。當(dāng)然，對(duì)于特殊的化學(xué)物不能完全固定觀察期限。 化學(xué)物給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒后，動(dòng)物往往出現(xiàn)興奮抑制死亡，或者抑制死亡的現(xiàn)象。如以含有氰基的氰氫酸和丙烯腈對(duì)大鼠和小鼠染毒后，都很快出現(xiàn)興奮。染毒丙烯腈的動(dòng)物首先出現(xiàn)活動(dòng)增加、騷動(dòng)、竄跑、甚至跳躍，之后出現(xiàn)呼吸困難，耳與尾青紫色；而氰氫酸呈一過性興奮，呼吸加快、加深，之后呼吸困難，耳與尾則為桃紅色?？梢娡瑸榍杌?，其中毒機(jī)制有所不同。有的化學(xué)物給動(dòng)物染毒后不久，動(dòng)物先出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，直至死亡。例如N-苯甲?；?N-(3，4-二氯苯基)-2-氨基-丙酸乙酪，給大鼠或小鼠灌胃致死劑量，動(dòng)物很快表現(xiàn)為閉目靜臥、

12、四肢無力、站立不穩(wěn)、步態(tài)蹣跚、呼吸減慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。有的化學(xué)物給予動(dòng)物后，動(dòng)物先出現(xiàn)刺激癥狀，如碳基鎳吸入染毒在大、小鼠先出現(xiàn)前肢反復(fù)搔鼻等呼吸道刺激癥狀。小鼠吸入染毒某些餾溫段的冷油后，大汗淋漓，被毛全濕，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。 在觀察期內(nèi)還需多次測(cè)量動(dòng)物體重，體重改變可以反映動(dòng)物染毒后的整體變化。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒后的死亡時(shí)間也應(yīng)記錄、分析，有時(shí)死亡時(shí)間的分析可以提供一些重要信息。例如久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)隨染毒劑量增加，死亡時(shí)間縮短。以死亡時(shí)間與染毒劑量作圖，可呈直線負(fù)相關(guān)，提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致死是可能由于化學(xué)物原形所致。而過氧化二磷酸二環(huán)己酯給大鼠腹腔注射后呈現(xiàn)明顯的染毒劑

13、量對(duì)數(shù)值與死亡時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但給小鼠腹腔注射后，染毒劑量或染毒劑量對(duì)數(shù)與死亡時(shí)間無明顯相關(guān)。這可能是與該化學(xué)物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關(guān)。 急性毒性研究中，應(yīng)注意觀察非致死指標(biāo)及其可復(fù)性，從而能夠?qū)瘜W(xué)物的急性毒性作全面的了解。可復(fù)性毒效應(yīng)是指隨著化學(xué)物從體內(nèi)消失而逐漸減小以至消失的毒效應(yīng)。毒作用的可復(fù)性與作用器官和系統(tǒng)、化學(xué)物本身的毒作用特點(diǎn)、化學(xué)物接觸時(shí)間、特定時(shí)間內(nèi)機(jī)體接觸化學(xué)物的總量、動(dòng)物的年齡及一般狀況有關(guān)?；瘜W(xué)物引起機(jī)體激素失衡常常是一種可復(fù)性的反應(yīng)，比如化學(xué)物對(duì)甲狀腺的影響，如果沒有超過導(dǎo)致甲狀腺組織損傷的閾值，則常常是一種可復(fù)性的毒效應(yīng)。發(fā)生在組織再生能力迅速的器官(如肝

14、)的損傷比發(fā)生在沒有再生能力的組織(如神經(jīng))的損傷更可能是可復(fù)性的。在動(dòng)物研究中觀察到的不可復(fù)性的毒效應(yīng)，在外推到人時(shí)比可復(fù)性毒效應(yīng)更為重要。 對(duì)中毒死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖作大體尸檢，觀察各器官有無充血、出血、水腫或其他改變，必要時(shí)對(duì)肉眼觀察有變化的臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活與對(duì)照組的動(dòng)物也應(yīng)作病理學(xué)檢查。死亡動(dòng)物的大體尸檢或組織病理學(xué)檢查有時(shí)可得到有價(jià)值的資料。 4. LD50計(jì)算 LD50是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得到的毒性參數(shù)，并可報(bào)告其95可信限。LD50(LC50)值是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，較少受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體易感性差異的影響，較為準(zhǔn)確，因此是最重要的急性毒性參數(shù)，也用來進(jìn)行急性毒性分級(jí)。對(duì)于

15、非致死性指標(biāo)的量化問題，可以利用ED50(median effective dose)和相應(yīng)的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線來解決。ED50是指一次給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某種化學(xué)物引起動(dòng)物群體中50的個(gè)體出現(xiàn)某種特殊效應(yīng)的劑量，該指標(biāo)也是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算處理得到的。圖 6-1 急性毒性的劑量-反應(yīng)曲線關(guān)系曲線模式圖 由圖6-1可以看到在以對(duì)數(shù)劑量為橫軸，死亡率為縱軸的圖中，隨劑量增加，累積死亡率也增加，呈“S”形曲線；如果以死亡頻率為縱軸時(shí)，則不同劑量下死亡頻率的分布呈正態(tài)分布，為典型的“鐘罩”型；而將累積死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位后作為縱軸時(shí)，則對(duì)數(shù)劑量與死亡率(概率單位)的圖形則表現(xiàn)為直線。因此我們可以將劑量對(duì)數(shù)值與死

16、亡率(概率單位)的關(guān)系，進(jìn)行直線回歸，用最小二乘法求出a、b值。代入直線方程：ya十bX。式中，X為劑量對(duì)數(shù)值，y為死亡率的概率單位。利用此式即可求得受試化學(xué)物的LD50及其95可信區(qū)間。 對(duì)數(shù)劑量-反應(yīng)曲線的斜率在進(jìn)行危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)時(shí)比LD50的數(shù)值更重要。Finney(1978)曾指出斜率是LD50標(biāo)準(zhǔn)差的倒數(shù)，反映了群體對(duì)此受試物反應(yīng)的差異性。平行的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線可能提示這兩種化學(xué)物的毒作用機(jī)制、動(dòng)力學(xué)特征類似。 利用LD50來比較不同外源化學(xué)物急性毒性大小見圖6-2?；瘜W(xué)物A、B、C的劑量反應(yīng)關(guān)系曲線(已用劑量對(duì)數(shù)和死亡率(概率單位)轉(zhuǎn)換成直線)的斜率相同，而LD50 ABC，因此，急

17、性毒性大小的次序?yàn)镃BA。而化學(xué)物D的LD50與C相同。但斜率比C大，可見在低于LD50的劑量時(shí)急性毒性CD，即在低于LD50的劑量時(shí)化學(xué)物C引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率高于化學(xué)物D。圖6-2 四種不同外源化學(xué)物的LD50及劑量/反應(yīng)(死亡)關(guān)系曲線 最小致死劑量(MLD)。如果急性毒性試驗(yàn)得到較好的劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可直接計(jì)算LD0l(使一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1死亡的劑量)，并以LD0l作為MLD的估計(jì)值。實(shí)際上，即使得到很好的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線，LD0l的可信限將是相當(dāng)寬的，并包含了MNLD(最大非致死劑量)。 5. 經(jīng)典的急性致死性毒性試驗(yàn)的局限性 對(duì)經(jīng)典的急性毒性試驗(yàn)和LD50的意義，多年來一直有不同的

18、意見：消耗的動(dòng)物量大，按經(jīng)典法的要求測(cè)LD50，一次實(shí)驗(yàn)需要60100只動(dòng)物。獲得的信息有限，LD50的值又不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評(píng)價(jià)急性毒性的許多觀察終點(diǎn)之一?；瘜W(xué)物單次大劑量急性中毒，動(dòng)物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒作用特征，另外，由于死亡迅速，各種器質(zhì)性變化尚未發(fā)展，不能顯示出靶器官的病變。測(cè)得的LD50值實(shí)際上僅是近似值，1977年歐洲共同體組織了13個(gè)國家的100個(gè)實(shí)驗(yàn)室，統(tǒng)一主要的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)5種化學(xué)物的LD50進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)收集到的80個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果分析，結(jié)果仍然存在相當(dāng)大的差別，可達(dá)2.448.38倍(表6-1)。在安全性評(píng)價(jià)中僅評(píng)價(jià)動(dòng)物

19、死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其他化驗(yàn)檢查所提供的深入詳細(xì)的毒性信息。ICH(1991)規(guī)定在新藥的報(bào)批材料中，不必準(zhǔn)確地測(cè)定LD50，只需了解其近似致死量和詳細(xì)觀察記錄中毒表現(xiàn)即可。為此，已發(fā)展了一些急性毒性試驗(yàn)的方法。表6-l 五種化合物的LD50值的實(shí)驗(yàn)室間變異化合物 范圍(mg/kg) 比值(最大值最小值)五氯酚 74620 8.38 水楊酸鈉 9302328 2.50 苯胺 4791169 2.44 乙酰苯胺 7233060 4.23 氯化鎘 105482 4.59三、急性毒性分級(jí) 目前國際上對(duì)外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。世界衛(wèi)生組織的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可

20、見表6-2。歐洲共同體的急性口服毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：高毒(Very Toxic，LD5025mg/kg)、有毒(Toxic，LD50為25200mg/kg)、有害(Harmful：LD50為2002000mg/kg)、不分級(jí)(UncIassified，LD502000mg/kg)等四個(gè)等級(jí)。除了參考國際上的幾種分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)外，我國于1978年提出了農(nóng)藥及工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及農(nóng)藥急性毒性分級(jí)暫行標(biāo)準(zhǔn)。目前我國食品毒理則沿用了國際上六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，即極毒、劇毒、中等毒、低毒、實(shí)際無毒、無毒(表6-3)。表6-2 外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)(WHO) 6只大鼠吸入4小時(shí)毒性分級(jí) 大鼠一次經(jīng)口LD50 死亡24只

21、 兔經(jīng)皮LD50 對(duì)人可能致死劑量 (mg/kg) 的濃度(ppm) (mg/kg) g/kg (g/60kg)劇毒 1 10 5 0.05 0.1高毒 1 10 5 0.05 3中等毒 50 100 44 0.5 30低毒 500 1000 350 5 25微毒 50000 10000 2180 15 1000表6-3 我國食品毒理急性毒性分級(jí)法1994急性毒性分級(jí) 大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg) 大致相當(dāng)于體重為70kg人的致死劑量6級(jí)(極毒) 1 稍嘗，7滴5級(jí)(劇毒) 150 7滴1茶匙4級(jí)(中等毒) 51500 1茶匙35克3級(jí)(低毒) 5015000 35350克2級(jí)(實(shí)際無毒)

22、500115000 3501050克1級(jí)(無毒) 15000 1050克四、急性毒性試驗(yàn)的其他方法 1. 近似致死劑量的研究 在確定近似致死劑量的研究中，僅用6只動(dòng)物，每只動(dòng)物給以不同劑量的受試物，每個(gè)劑量間距為l.5倍。這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以得到近似最小致死劑量。利用該方法測(cè)試了87種化學(xué)物，發(fā)現(xiàn)83的化學(xué)物近似致死劑量都位于用經(jīng)典的急性毒性試驗(yàn)方案所得到的LD50的正、負(fù)30范圍以內(nèi)。 另一種確定近似致死劑量的方法是先選擇一個(gè)劑量給予2只動(dòng)物，24小時(shí)后，觀察動(dòng)物的情況，然后再根據(jù)動(dòng)物反應(yīng)確定下一個(gè)給藥劑量；如果動(dòng)物未死亡，以第一次給藥劑量的1.5倍劑量再次給予2只動(dòng)物;如果動(dòng)物死亡，則以第一次

23、給藥劑量的23再次給予2只動(dòng)物。重復(fù)操作一直到確定最大非致死劑量和最小致死劑量。 2. 固定劑量法(fixed dose Procedure) 固定劑量法是由英國毒理學(xué)會(huì)1984年提出，OECD于1992年正式采用。這種方法與以往方法不同的是它不以動(dòng)物死亡作為觀察終點(diǎn)，這個(gè)方法可以利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來對(duì)化學(xué)物的毒性進(jìn)行分類及分級(jí)。實(shí)驗(yàn)選擇的劑量范圍是5、50和500mg/kg，而最高限量是2000mg/kg。首先用50mg/kg的受試物給予10只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(雌、雄各半)。如果存活率低于100，則再選擇一組動(dòng)物給予5mg/kg的受試物。如果存活率仍低于1

24、00，則將該受試物歸于“高毒”類，反之歸于“有毒”類。如果給予50mg/kg受試物后存活率為100，但有毒性表現(xiàn)，則不需進(jìn)一步試驗(yàn)而將其歸于“有害”類。如果給予50mg/kg后存活率為100，而且沒有毒性表現(xiàn)，繼續(xù)給另外一組動(dòng)物500mg/kg的受試物，如果存活率仍為100，而且沒有毒性表現(xiàn)時(shí)，則給予2000mg/kg受試物進(jìn)行觀察，如果仍然100存活，將受試物歸于“無嚴(yán)重急性中毒的危險(xiǎn)性”類。對(duì)于固定劑量法的結(jié)果評(píng)價(jià)可見表6-4。 OECD組織了對(duì)固定劑量法國際性的驗(yàn)證(Van Den Heuvel l990)，11個(gè)國家的33個(gè)實(shí)驗(yàn)室用固定劑量法和OECD(1981)規(guī)定的經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)

25、法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毒性分級(jí)：比較了30個(gè)化合物的兩種試驗(yàn)法所得結(jié)果，根據(jù)歐共體急性口服毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，516次固定劑量法試驗(yàn)中，有414次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的毒性分級(jí)與LD50的分級(jí)相同，一致性為80.2。毒性反應(yīng)：從毒性反應(yīng)的類別、出現(xiàn)和持續(xù)的時(shí)間、消失的時(shí)間等方面分析，兩種試驗(yàn)方法未顯出明顯差別。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù)：LD50經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)，平均每個(gè)化合物用大鼠24.2只，固定劑量法平均用大鼠14.8只，明顯比前者少。表6-4 單次口服固定劑量法試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)劑 量（mg/kg）試 驗(yàn) 結(jié) 果存活率100% 100%存活，毒性表現(xiàn)明顯 100%存活，無明顯中毒表現(xiàn) 5.0 高毒LD5025mg/

26、kg 有毒 用50mgkg試驗(yàn) 50.0 有毒或高毒 有害 用500mg/kg試驗(yàn) 用5mg/kg試驗(yàn) LD502002000mg/kg 500.0 有毒或有害 LD502000mg/kg 用2000mg/kg試驗(yàn) 用50mg/kg試驗(yàn) 2000.0 用500mg/kg試驗(yàn) 該化學(xué)物無嚴(yán)重急性中毒的危險(xiǎn)性 3. 急性毒性分級(jí)法(acute toxic class method)傳統(tǒng)的急性毒性試驗(yàn)方法以死亡為終點(diǎn)，而固定劑量法以明顯的毒性體征作終點(diǎn)。OECD(1996)急性經(jīng)口毒性分級(jí)法是分階段試驗(yàn)法，每階段3只動(dòng)物，根據(jù)死亡動(dòng)物數(shù)，平均經(jīng)24階段即可判定急性毒性。所用動(dòng)物少，仍可得到可接受的結(jié)

27、論，此法基于生物統(tǒng)計(jì)學(xué)，并經(jīng)過OECD組織的國際證實(shí)研究(Schlede等，1994)。此法應(yīng)用于嚙齒類，首選大鼠，利用3個(gè)固定劑量25、200、2000mg/kg體重其中之一開始進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：不需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行分級(jí)；下一階段以相同劑量的另一種性別試驗(yàn)；下一階段以較高或較低的劑量水平進(jìn)行(從200mg/kg體重開始的程序見圖6-3)。于確認(rèn)染毒動(dòng)物存活后，進(jìn)行下一個(gè)性別或下一個(gè)劑量的實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物觀察14天，染毒當(dāng)天觀察體征和死亡至少兩次，之后每日觀察一次。染毒前和每周測(cè)體重，所有動(dòng)物均進(jìn)行大體解剖，必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。圖6-3 急性毒性分級(jí)法:以200mg/kg體重開始的試驗(yàn)方

28、案 4. 上、下移動(dòng)法(updown method)或階梯法，該法可用于觀察不同的終點(diǎn)，第二個(gè)動(dòng)物接受化學(xué)物的劑量由第一只動(dòng)物染毒后的反應(yīng)決定，如果動(dòng)物死亡，則下一個(gè)劑量降低；如果動(dòng)物存活則下一個(gè)劑量增高，但是實(shí)驗(yàn)需要選擇一個(gè)比較合適的劑量范圍，使得大部分的動(dòng)物所接受的化學(xué)物劑量都會(huì)在真正的平均致死劑量左右。如果劑量范圍過大，則需要有更多的動(dòng)物來進(jìn)行觀察。對(duì)于該法進(jìn)行改進(jìn)以后，上、下移動(dòng)法則只需要69只動(dòng)物。Lipnick等(1995)比較了上下法、固定劑量法和經(jīng)典LD50法，根據(jù)EEC分級(jí)系統(tǒng)對(duì)化學(xué)品急性毒性分級(jí)，上下法和經(jīng)典法一致性為2325，上下法與固定劑量法一致性為1620。上下法需一

29、個(gè)性別610只動(dòng)物，少于另兩種方法。 5. 金字塔法(“pyramiding”study) 利用本設(shè)計(jì)觀察動(dòng)物急性毒性，動(dòng)物用量最少。典型的金字塔法研究在整個(gè)觀察期內(nèi)都給動(dòng)物受試物，一般是隔天染毒，但劑量是逐漸增加的。例如l、3、10、30、100、300、1000和3000mg/kg劑量系列或者是10、20、40、80、160、320、640和1280mg/kg劑量系列。給予動(dòng)物的劑量一直按上述系列增加，直到一只動(dòng)物或兩只動(dòng)物死亡，或者達(dá)到劑量上限。對(duì)于藥物，非嚙齒類動(dòng)物一般很少超過1000mg/kg，嚙齒類動(dòng)物則很少超過3000mg/kg。金字塔法常用于非嚙齒類的動(dòng)物的急性毒性研究。試驗(yàn)組

30、4只，對(duì)照組4只均雌雄各半，共8只狗。試驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)第0、2、4、7、9天染毒，每次染毒后24h內(nèi)進(jìn)行臨床體檢，包括觸診，行為觀察，脊髓反射檢查、瞳孔光反射、呼吸率，心電圖、直腸溫度、臨床實(shí)驗(yàn)室檢查，于實(shí)驗(yàn)第10天處死試驗(yàn)組動(dòng)物，并進(jìn)行尸體解剖。 通過金字塔研究獲得的資料可以得到三種結(jié)論：如果沒有動(dòng)物死亡，則最小致死劑量和LD50均大于極限劑量或?qū)嶒?yàn)所用最高劑量。如果所有動(dòng)物死于同一劑量，則LD50和最小致死劑量在實(shí)驗(yàn)所用最后兩個(gè)劑量之間。如果一只動(dòng)物死于某一個(gè)劑量，而另一只死于高一個(gè)劑量，則最小致死劑量位于出現(xiàn)第一只動(dòng)物死亡的劑量與前一個(gè)劑量之間，LD50則位于出現(xiàn)第一只動(dòng)物死亡的劑量與所有動(dòng)

31、物死亡的劑量之間。此法的缺點(diǎn)為：此法得不到死亡曲線，也無法計(jì)算LD50；本法無法確定遲發(fā)的死亡，比如，第二次給藥后動(dòng)物出現(xiàn)死亡，則無法確定是由于第一次給藥引起的遲發(fā)死亡，還是第二次給藥引起的死亡；對(duì)于有些半衰期特別長的化學(xué)物，由于蓄積作用可能會(huì)導(dǎo)致得到的急性致死劑量偏低，而由于適應(yīng)性的存在，可使得到的急性致死劑量偏高。 6. 限量試驗(yàn) 如受試物的毒性很低，可用限量試驗(yàn)。一般嚙齒類(大鼠或小鼠)20只，也有用10只，雌雄各半。單次染毒劑量不必超過5gkg體重，也有認(rèn)為劑量一般不超過2gkg體重，對(duì)于食品毒理學(xué)試驗(yàn)限量可為15gkg體重?？赡艿慕Y(jié)果為：如果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡，結(jié)論是最小致死劑量(MLD

32、)大于該限量；如果死亡動(dòng)物數(shù)低于50，結(jié)論是LD50大于限量；如果死亡動(dòng)物數(shù)高于50，則應(yīng)重新設(shè)計(jì)，進(jìn)行常規(guī)的急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)二項(xiàng)分布，20只動(dòng)物死亡5只，死亡百分率的95可信區(qū)間為949。因此，保守的觀點(diǎn)認(rèn)為如果死亡動(dòng)物數(shù)為5只或5只以下，結(jié)論是LD50大于限量；如死亡為6只或6只以上，即應(yīng)重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)。用10只大鼠或小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，如無死亡或死亡動(dòng)物數(shù)僅為1只，才可認(rèn)為LD50大于限量。 7. 急性系統(tǒng)毒性試驗(yàn) 此試驗(yàn)的設(shè)計(jì)是為了更全面地確定藥物的急性毒性。共有3種，即最低急性毒性試驗(yàn)、完全急性毒性試驗(yàn)和補(bǔ)充的急性毒性試驗(yàn)。 在劑量設(shè)計(jì)上應(yīng)注意，一般設(shè)3個(gè)劑量組和1個(gè)溶劑對(duì)照組。最高劑量應(yīng)

33、有明顯的毒性(包括死亡)，但不需要使全部動(dòng)物死亡。如果受試物毒性很低可僅設(shè)1個(gè)限量組和1個(gè)對(duì)照組。每組10只大鼠或小鼠，雌雄各半。最高劑量超過3gkg體重幾乎不會(huì)得到更多的毒性資料，最高劑量不應(yīng)大于人臨床擬用劑量的100300倍，劑量間距應(yīng)較大(如310倍)。 最低急性毒性試驗(yàn)：在染毒當(dāng)天(0天)測(cè)體重后染毒，染毒后多次(如每小時(shí)1次，共4次)觀察臨床體征，此后每天1次觀察體征和死亡率，于第7天和第14天測(cè)體重，第14天處死。對(duì)觀察期死亡和試驗(yàn)結(jié)束處死的動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖。 完全急性毒性試驗(yàn)：目的是發(fā)現(xiàn)靶器官，每組20只大鼠或小鼠、雌雄各半，除最低急性毒性試驗(yàn)的要求之外，于第0、1、2、3、4天

34、測(cè)體重和飼料消耗，于第3天和第14天各處死50動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖、臨床實(shí)驗(yàn)室檢查及收集器官(腦、心、肝、脾、腎、胃、胸腺、睪丸)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。補(bǔ)充急性毒性試驗(yàn)較少進(jìn)行，主要是有特殊的目的，如毒物動(dòng)力學(xué)研究、靶器官毒性的特殊研究等。上述三種急性系統(tǒng)毒性可能得到的毒性資料見表6-5。表6-5 急性系統(tǒng)毒性試驗(yàn)可得到的資料(Gad，1995)致死死亡率LD50及其可信限致死曲線的形狀和斜率最大非致死劑量或最小致死劑量，以LD01估計(jì)死亡時(shí)間臨床體征發(fā)生和恢復(fù)時(shí)間急性LOAEL和NOAEL瀕死體征或非瀕死體征特異的或一般的毒效應(yīng)劑量反應(yīng)曲線與致死曲線的間隔體重改變體重下降或增長降低恢復(fù)飼料消耗改變

35、死亡和存活動(dòng)物體重變化靶器官鑒定尸體解剖組織學(xué)檢查臨床化學(xué)和血液學(xué)改變特定的功能試驗(yàn)免疫功能神經(jīng)肌肉篩查行為篩查毒物動(dòng)力學(xué)不同染毒途徑的毒性差別受試物血漿濃度，曲線下面積、分布體積，半衰期受試物代謝譜在關(guān)鍵器官的分布血漿濃度與臨床體征發(fā)生的關(guān)系第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn) 急性毒性試驗(yàn)主要是研究外源化學(xué)物急性毒作用的特征和上限參數(shù)，即LD50，并據(jù)此可進(jìn)行急性毒性分級(jí)。由于人體接觸外源化學(xué)物往往是長期的反復(fù)的接觸，利用急性毒性試驗(yàn)的資料難以預(yù)測(cè)慢性毒性。這是因?yàn)椋和庠椿瘜W(xué)物在長期重復(fù)染毒時(shí)可產(chǎn)生與急性毒性試驗(yàn)完全不同的毒作用。如苯急性中毒引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，而長期反復(fù)接觸可引起粒細(xì)胞缺乏及白

36、血病。隨著動(dòng)物的衰老，有些因素如組織易感性改變、代謝和生理功能的改變，以及自發(fā)性疾病等均可影響毒作用的性質(zhì)和程度。某些重要的疾病例如心臟病、慢性腎衰、腫瘤等均與年齡的增長有關(guān)?；谏鲜鲈?，進(jìn)一步研究外源化學(xué)物的慢性毒性是很有必要的； 毒理學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)按染毒期限可分為四種，即急性、亞急性、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)，后三種可統(tǒng)稱為重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)分別代表了人一次染毒和長期反復(fù)染毒這兩種暴露特征的毒性試驗(yàn)方法。由于慢性毒性試驗(yàn)耗費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間，亞急性、亞慢性毒性試驗(yàn)就具有預(yù)備或篩選試驗(yàn)的性質(zhì)。當(dāng)外源化學(xué)物在亞急性、亞慢性毒性試驗(yàn)中有嚴(yán)重的毒作用時(shí)，此受試物就應(yīng)考慮放

37、棄，只有在必要時(shí)才進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)。Parkinson等(1995)報(bào)告117種藥品狗亞慢性(90天)和慢性(24月)毒性試驗(yàn)結(jié)果與大鼠(短期或長期毒性試驗(yàn))的結(jié)果比較，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)新的毒性資料。因此，Parkinson等認(rèn)為，動(dòng)物毒性試驗(yàn)長于6個(gè)月是沒有必要的，除非是研究致癌作用。這與Lumley等(1985)的報(bào)告及日本Igarashi(1993)對(duì)90個(gè)藥品的比較研究結(jié)果相似。WeiI等(1969)報(bào)告，112種受試物中，大鼠染毒90天后才出現(xiàn)毒性效應(yīng)的只有3種(占2.5)，其他受試物均在90天內(nèi)已出現(xiàn)毒性效應(yīng)，故認(rèn)為大鼠90天毒性試驗(yàn)即可確定受試物的未觀察到有害作用水平(NOAEL)。

38、盡管還有爭(zhēng)論，亞慢性毒性試驗(yàn)(特別是90天亞慢性試驗(yàn))已成為比較常用的重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)；而從科學(xué)上和經(jīng)濟(jì)上考慮，慢性毒性試驗(yàn)就傾向于和致癌試驗(yàn)合并進(jìn)行。 由于亞慢性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法上較相似，故一并介紹。一、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的概念和目的 亞慢性毒性(subchronic toxicity)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)(通常13個(gè)月)重復(fù)染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)；慢性毒性(chronic toxiciy)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長期染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)。 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的目的： 1. 確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜，對(duì)在急性及亞急性毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并

39、發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)的毒作用； 2. 研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官； 3. 研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)，提出此受試物的安全限量參考值； 4. 研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性； 5. 亞慢性毒性試驗(yàn)為慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)及觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)； 6. 確定不同動(dòng)物物種對(duì)受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。二、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)方法 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和染毒期限 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)一般選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一種是嚙齒類，一種是非嚙齒

40、類，常用大鼠和狗。選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是為了降低外源化學(xué)物對(duì)不同物種動(dòng)物的毒作用特點(diǎn)不同所造成的將實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人的偏差。在亞慢性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)時(shí)，也可考慮用兔或脈鼠。 一般情況下，亞慢性和慢性試驗(yàn)選用雌雄兩種性別，如某種藥物臨床上只用于一種性別，此時(shí)可選用單性別的動(dòng)物。慢性毒性試驗(yàn)的目的是使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的大部分時(shí)間染毒該受試物，因此在生命的早期開始染毒是很重要的，美國FDA要求嚙齒類動(dòng)物在研究開始時(shí)應(yīng)小于6周齡。 同樣的染毒期限對(duì)不同的試驗(yàn)動(dòng)物，其意義不同。一般地講，慢性毒性試驗(yàn)對(duì)哺乳類應(yīng)為兩年的時(shí)間，對(duì)嚙齒類相當(dāng)于終生染毒，但對(duì)兔只相當(dāng)于生命期的36，狗為20，見表6-6。表6-6 動(dòng)物研究期限

41、相當(dāng)于壽命期()和人染毒的時(shí)間物種研究期限(月)相當(dāng)于壽命期()研究期限(月)相當(dāng)于人(月)13612241361224大鼠4.112.025.049.099.0 34 101202 404 808兔1.44.59.018.036.0 12 36 72 145 289狗0.822.54.99.820.06.5 20 40 81162豬0.822.54.99.820.06.5 20 40 81162猴0.551.6 3.36.613.04.5 13 27 61107 慢性毒性實(shí)驗(yàn)的期限應(yīng)依受試物的具體要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種而定，工業(yè)毒理學(xué)要求6個(gè)月，環(huán)境毒理學(xué)和食品毒理學(xué)要求一年以上，OECD要求

42、慢性毒性試驗(yàn)大鼠染毒期限至少一年。如慢性毒性試驗(yàn)與致癌試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行則染毒期限最好接近或等于動(dòng)物的預(yù)期壽命。 在藥物臨床前毒性研究中，長期毒性試驗(yàn)的期限主要取決于臨床擬用藥的期限(見表6-7)。最近，各種規(guī)范對(duì)染毒期限的要求也在逐漸趨向于縮短，如ICH(1998)規(guī)定嚙齒類臨床前長期毒性試驗(yàn)為6個(gè)月，非嚙齒類為9個(gè)月。但是，一般來說至少有兩種器官(眼和心臟)和一種嚴(yán)重的疾病(癌)需要進(jìn)行長期染毒才能有明顯的毒效應(yīng)。此外，還發(fā)現(xiàn)如給嚙齒類動(dòng)物正常飼料量的7080，其壽命可延長3540個(gè)月，故正常的生命周期有待進(jìn)一步確定。表6-7 臨床前研究動(dòng)物長期毒性試驗(yàn)的期限臨床用藥時(shí)間 動(dòng)物染毒期限 最多3次

43、 2 周 10天 1個(gè)月 1個(gè)月 3個(gè)月 未限制 1年(美國)，6個(gè)月(歐洲及日本) 在用非嚙齒類(狗，猴等)進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，染毒期限常不能持續(xù)整個(gè)生命期，仔細(xì)研究受試物的動(dòng)力學(xué)和代謝狀況可彌補(bǔ)染毒期限的不足(如試驗(yàn)終點(diǎn)不是致癌作用)。如果在穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)建立之后繼續(xù)較長時(shí)間的染毒，從臨床表現(xiàn)上或由間斷處死動(dòng)物的病理變化未見到毒性作用的增強(qiáng)，則可部分代替全壽命期試驗(yàn)，并使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性增加。 2. 染毒途徑 外來化合物的染毒途徑，應(yīng)當(dāng)盡量模擬人類接觸受試化學(xué)物質(zhì)的方式(途徑)，并且亞慢性與慢性毒作用研究的染毒途徑應(yīng)當(dāng)一致。亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)常用經(jīng)胃腸道、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮膚染毒三種途徑，藥物臨

44、床前毒性試驗(yàn)中，動(dòng)物染毒途徑應(yīng)盡可能與人的用藥途徑一致。經(jīng)胃腸道染毒毒物最好采用喂飼法，即將受試物與食物或飲水混勻，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然攝入。如果受試化學(xué)物質(zhì)有異味或易水解時(shí)，也可以用灌胃方式染毒。應(yīng)注意對(duì)揮發(fā)性受試物及飼料粉塵的影響，盡量減少實(shí)驗(yàn)人員及動(dòng)物受污染的危險(xiǎn)性。當(dāng)用狗或猴進(jìn)行長期實(shí)驗(yàn)時(shí)，不常采用喂飼染毒，因浪費(fèi)量太大，通常采用膠囊或插胃管染毒。 經(jīng)呼吸道吸入染毒，每天吸入時(shí)期依實(shí)驗(yàn)要求而定，亞慢性毒性研究在工業(yè)毒理學(xué)可14小時(shí)不等，環(huán)境毒理學(xué)可為46小時(shí)。在慢性毒性研究中，工業(yè)毒理學(xué)要求每天吸入46小時(shí)，環(huán)境毒理學(xué)一般要求每天吸入8小時(shí)。凡需要在吸入期間喂食、喂水時(shí)，要注意防止受試化學(xué)物

45、質(zhì)污染食物、飲水及食具。 經(jīng)皮染毒的去毛部位面積一般不大于動(dòng)物體表總面積的1015，大鼠約為2050cm2，每次染毒46小時(shí)，應(yīng)防止動(dòng)物舔食。 而且，為保證受試物在動(dòng)物體內(nèi)濃度的穩(wěn)定，每天應(yīng)在相同的時(shí)間及實(shí)驗(yàn)室條件下染毒。每周至少染毒67天，有研究表明，相同毒物在相同劑量的情況下，每周5天染毒與7天染毒的毒性反應(yīng)是不一致的。 按預(yù)定劑量水平，吸入染毒氣體和蒸氣以mg/m3表示其濃度(mgm3=（MW·ppm）22.4)，摻入飼料或飲水以或ppm(mg/kg，mg/L)表示其濃度。必須每周或每兩周調(diào)整飼料中受試物的濃度以維持恒定的劑量水平，因?yàn)閱挝惑w重的飼料消耗量隨動(dòng)物年齡的增長而下降

46、。如在嚙齒類試驗(yàn)中，從離乳到成年過程中飼料中受試物濃度保持恒定不變，則在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的染毒劑量約減少至40。這可影響毒性反應(yīng)的嚴(yán)重程度，并可能作出有耐受性的錯(cuò)誤判斷。 3. 試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì) 在亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)中，為了要得出明確的劑量-反應(yīng)關(guān)系，一般至少應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性(溶劑)對(duì)照組。高劑量組應(yīng)能引起較為明顯的毒性，中劑量組應(yīng)該為觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)，低劑量組應(yīng)相當(dāng)于未觀察到有害作用劑量(NOAEL)。亞慢性毒性試驗(yàn)高劑量的選擇，可以參考兩個(gè)數(shù)值，一種是以急性毒性的閾劑量為該受試物的亞慢性毒作用的最高劑量，另一種是取受試物L(fēng)D50的12015為最高劑量。高、中

47、、低3個(gè)劑量間組距以310倍為宜，最低不小于2倍。慢性毒性試驗(yàn)劑量選擇，高劑量可以選擇亞慢性毒效應(yīng)的NOAEL或其1512為慢性毒性研究的最高劑量；各劑量組間距以差25倍為宜，最低不小于2倍。慢性毒性試驗(yàn)劑量間距應(yīng)小于亞慢性毒性試驗(yàn)。劑量選擇的一般步驟是從急性(單劑量)毒性試驗(yàn)14天毒性試驗(yàn)90天毒性試驗(yàn)的程序，直接從急性毒性資料來確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量經(jīng)常有困難，可能高估或低估受試物的慢性毒性。如對(duì)劑量選擇沒有把握，則可在某項(xiàng)試驗(yàn)中多設(shè)幾個(gè)劑量組，這要比重復(fù)整個(gè)試驗(yàn)費(fèi)用低得多。同時(shí)，如有性別差異，不同性別可選擇不同的劑量。 對(duì)于藥物而言，可用人擬用劑量的倍數(shù)來設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量，亞慢性毒性試驗(yàn)大鼠

48、可用人擬用劑量10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍；慢性毒性試驗(yàn)大鼠可用人擬用劑量5、15和50倍，非嚙齒類可用3、9、30倍(Traina,1983)。ICH對(duì)于藥品慢性毒性和致癌性研究的最高劑量已取得一致的意見，但對(duì)于農(nóng)藥、工業(yè)化學(xué)品、食品添加劑和其他非藥用化學(xué)物試驗(yàn)劑量的選擇還有爭(zhēng)論。美國ILSI風(fēng)險(xiǎn)科學(xué)研究所由代表美國、加拿大、歐洲和日本的科學(xué)界、工業(yè)及政府的科學(xué)家組成關(guān)于嚙齒類慢性毒性試驗(yàn)劑量選擇工作組，該工作組(1997)鼓勵(lì)不再唯一依照MTD原則(MTD主要由體重和組織病理學(xué)來確定)，并提出選擇最高劑量和較低劑量的如下5個(gè)原則。 根據(jù)毒理學(xué)原理，慢性毒性試驗(yàn)劑量選擇

49、應(yīng)使慢性毒性試驗(yàn)的敏感性增加到最大程度。在合理的劑量范圍內(nèi)，提高劑量可能增加檢測(cè)毒效應(yīng)的能力。在選擇劑量時(shí)，應(yīng)考慮適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)設(shè)計(jì)、作用機(jī)制及其他有關(guān)的資料。中、低劑量的選擇不應(yīng)該僅按最高劑量的某個(gè)固定的比例，而應(yīng)考慮毒作用的機(jī)制和模式、毒動(dòng)學(xué)、以及下述的其他因素。而且中、低劑量的選擇應(yīng)盡可能顯示劑量反應(yīng)曲線的形狀，并且考慮人體的暴露水平。選擇劑量時(shí)應(yīng)考慮之前進(jìn)行的各項(xiàng)研究所評(píng)價(jià)的終點(diǎn)如組織病理學(xué)、毒動(dòng)學(xué)、細(xì)胞增殖和凋亡、生理功能、臨床化學(xué)、血液學(xué)和尿分析、器官重量、體重等。應(yīng)考慮理化因素、生物利用度、在飼料或飲水中的適口性等。 所選動(dòng)物亞慢性毒性試驗(yàn)一般大鼠68周齡(體重80100g)，每組大

50、鼠不少于20只；狗812月齡，每組68只，雌雄各半。于慢性毒性試驗(yàn)中動(dòng)物的年齡應(yīng)低于亞慢性毒性試驗(yàn)，大鼠應(yīng)剛離乳，體重在5070克為宜，一般要求每組40只，雌雄各半。必須設(shè)置陰性對(duì)照組，必要時(shí)動(dòng)物數(shù)可以再多些，以排除其他因素和自然死亡的干擾。以狗為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，每個(gè)劑量組應(yīng)各8只或以上，雌雄各半。在12年的長期實(shí)驗(yàn)中，必須考慮某些意外事故，需增添額外的動(dòng)物。如對(duì)照組大鼠在2年期間自然死亡可使動(dòng)物數(shù)減少20。Homburer(1983)主張對(duì)照組的動(dòng)物數(shù)等于每個(gè)染毒組的動(dòng)物數(shù)乘以染毒組組數(shù)的平方根，如每組40只大鼠，共4個(gè)染毒組，則對(duì)照組應(yīng)有80只大鼠，即40×只。 如果設(shè)計(jì)要求在染毒受

51、試物期間處死一部分動(dòng)物，進(jìn)行某些指標(biāo)動(dòng)態(tài)觀察(如病理組織學(xué)檢查或某些臟器的生化檢查)，則在試驗(yàn)開始時(shí)應(yīng)相應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。 4. 觀察指標(biāo)外來化學(xué)物亞慢性毒作用研究對(duì)毒性效應(yīng)檢測(cè)流程圖見圖6-4。 圖6-4 亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)檢測(cè)各種毒性終點(diǎn)的流程圖 (1) 一般性指標(biāo) 在實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)仔細(xì)觀察動(dòng)物的外觀(體表通道和毛色等)，社會(huì)行為(躁動(dòng)、冷漠、探究活動(dòng))；刺激性(好斗等)及對(duì)周圍環(huán)境、食物、水的興趣，這些信息如單獨(dú)一項(xiàng)無太多的意義，但結(jié)合起來就有可能揭示出未觀察到毒性癥狀前的潛在毒性效應(yīng)。 在亞慢性及慢性毒性研究中，動(dòng)物體重是一個(gè)比較重要且比較敏感的指標(biāo)，反映了受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長發(fā)育

52、及一般狀態(tài)的影響。與對(duì)照組處于相同的喂飼條件下，如果受試組動(dòng)物體重增長比對(duì)照組低10，就可以認(rèn)為是由受試化學(xué)物所引起的毒效應(yīng)。如果各劑量組體重增長改變有劑量-反應(yīng)關(guān)系，就可以肯定這是一種綜合毒性效應(yīng)。一般在亞慢性毒性試驗(yàn)應(yīng)每周測(cè)體重一次，對(duì)慢性毒性試驗(yàn)，最初13周每周測(cè)體重一次，以后如動(dòng)物健康狀況無明顯改變可每2周或每月測(cè)體重一次。 對(duì)各劑量組和對(duì)照組動(dòng)物同期體重的統(tǒng)計(jì)和比較可有多種方式，可以用體重直接統(tǒng)計(jì)，也可用體重的增長重量，或用體重百分增長率(以染毒開始時(shí)體重為100)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 除體重外，還應(yīng)記錄動(dòng)物的飼料消耗，并計(jì)算食物利用率(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每食入100克飼料所增長的體重克數(shù))。比較各染毒組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的食物利用率，有助于分析受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)效應(yīng)。食物利用率可用于鑒別嚙齒類動(dòng)物體重降低或增長減緩是由于受試物不適口，還是真正的毒作用。 (2) 實(shí)驗(yàn)室檢查 在慢性毒性試驗(yàn)中，必須評(píng)價(jià)受試物對(duì)各器官系統(tǒng)的功能影響。血、尿等體液的實(shí)驗(yàn)室檢查的目的是發(fā)現(xiàn)受試物所致的器官功能紊亂。最主要的是評(píng)價(jià)解毒和排泄器官(即肝和腎)，因?yàn)樵谶@兩個(gè)器官染毒受試物的濃度較高，另一個(gè)重要的靶器官是血液。血液學(xué)檢查包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類、血小板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間等。血液生化檢查主要為血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、