大腸桿菌對(duì)土壤微生物群落組成與修改

1、大腸桿菌對(duì)土壤微生物群落組成與修改摘要：這個(gè)實(shí)驗(yàn)研究了縮影生存模式的三個(gè)大腸桿菌株(起源于土,狗糞和人類排泄物)對(duì)土壤微生物群落組成與修改。密度逐步增加(0.05%、0.15%、0.30%和0.50%)的膽汁鹽3號(hào)(BS3)被添加到砂壤土壤中。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的大腸桿菌被灌輸進(jìn)土壤并孵化150天來(lái)監(jiān)控他們的生存模式。通過(guò)對(duì)土壤中BS3的檢測(cè)來(lái)判斷細(xì)菌群落的多樣性。該方法是通過(guò)兩個(gè)栽培和培養(yǎng)為基礎(chǔ)的獨(dú)立的方法。一般來(lái)說(shuō), 孵化10天和90天，逐步增加BS3濃度都會(huì)導(dǎo)致CFU計(jì)數(shù)的減少。DGGE分析表明只要輕微改變細(xì)菌群落組成需10天,但一個(gè)明顯的變化需90天。生存的大腸桿菌在土壤中顯著影響微生物群落的

2、多樣性,因?yàn)榇竽c桿菌的死亡速率逐漸下降該土壤中微生物群落多樣性也減少。生存的大腸桿菌對(duì)不同土壤微生物群落中的多樣性都有重要影響,因此結(jié)合預(yù)測(cè)模型對(duì)水質(zhì)管理和微生物源跟蹤研究有重要意義。關(guān)鍵詞：膽汁鹽3號(hào); 大腸桿菌; 微生物群落結(jié)構(gòu) ； 土壤 ;生存1引言土壤和水體是大腸桿菌的主要來(lái)源。起源于農(nóng)業(yè)的大腸桿菌進(jìn)入土壤通過(guò)應(yīng)用動(dòng)物肥料或直接沉積或通過(guò)放牧牲畜沉淀。土壤綁定大腸桿菌通過(guò)雨水徑流轉(zhuǎn)入水系統(tǒng),因此大腸桿菌也影響水的質(zhì)量。生存的大腸桿菌在土壤中,一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題當(dāng)考慮到周圍的水域污染的風(fēng)險(xiǎn),是不很好地確定由于缺乏信息的主要影響因素的土壤。非生物因素,如溫度、濕度（Byappanahalli和F

3、ujioka,2004,Byappanahalli et al。,2006,Desmarais et al。2002)、土壤質(zhì)地(Desmarais et al。,2002年)、有機(jī)物質(zhì)含量(泰特,1978),和糞肥介質(zhì),已經(jīng)被證明能夠影響生存的大腸桿菌在土壤中,盡管這些因素如何影響大腸桿菌還不清楚。一些生物因素,如捕食,也被報(bào)告影響大腸桿菌在土壤中的持久性 (Brettar和Hofle,1992)。理解其他生物因素的影響,例如,土壤微生物群落組成,但是,仍然是很有限的(Bogosian et al。1996和Korhonen和Martikainen,1991)。生存或持久性的大腸桿菌引入土壤

4、后土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)改變(Colwell,1997,McGradySteed et al。1997、納伊·姆和李,1997和Tilman et al。,1997)。一個(gè)逆關(guān)系之間被發(fā)現(xiàn)的存活率銅綠假單胞菌和復(fù)雜的小麥根際微生物多樣性(Matos et al。,2005)。在另一項(xiàng)研究在人為構(gòu)造的縮影,invasibility Ralstonia青枯病菌的生化變種被發(fā)現(xiàn)逆相關(guān)程度的土壤微生物群落多樣性(Irikiin et al。,2006)。Van Elsas(Van Elsas et al。,2007年)表明,生存的大腸桿菌是負(fù)面影響土壤微生物的復(fù)雜性社區(qū)。大腸桿菌物種基因多樣化

5、(Dykhuizen,1984),它已被證明,致病菌株的大腸大腸桿菌存活不同于非株(Fenlon et al。2000、這里et al。2000和奧格登et al。,2001)。因此要推廣環(huán)境行為不當(dāng)?shù)闹虏【昶渌竽c桿菌種群。作為一個(gè)選擇性抑制劑,膽汁鹽# 3(BS3)廣泛應(yīng)用于微生物培養(yǎng)基濃度,0.15%支持增長(zhǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌腸。BS3已經(jīng)應(yīng)用于土壤微觀研究降低土壤細(xì)菌的數(shù)量,進(jìn)而推動(dòng)本土生長(zhǎng)的自然大腸桿菌數(shù)量(Byappanahalli和Fujioka,2004)。在這項(xiàng)研究中BS3是用于構(gòu)建微觀與梯度的土壤微生物群落結(jié)構(gòu),和那些被用作模型微觀土壤生態(tài)系統(tǒng)與不同的微生物群落結(jié)構(gòu)來(lái)確定生

6、存的接種大腸大腸桿菌菌株。這是假設(shè)應(yīng)用程序在不同濃度的BS3土壤會(huì)導(dǎo)致逐漸改良土壤微生物群落組成,這將影響生存的反向接種過(guò)的大腸桿菌。1 材料和方法 總結(jié)了實(shí)驗(yàn)方案在這項(xiàng)研究中的應(yīng)用，如圖1所示。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下:圖12.土壤取樣和治療 收集的沙質(zhì)土壤是來(lái)自表面10厘米層草原在印度河研究和教育中心,佛羅里達(dá)州皮爾斯堡。這草地已經(jīng)十年了,因?yàn)樗潜粡母涕倭趾蜎](méi)有有機(jī)修正案被應(yīng)用在轉(zhuǎn)換后。畢竟石頭和植物殘?bào)w被移除,土壤被同質(zhì)化通過(guò)使用2 mm篩,并存儲(chǔ)在4°C和使用10天內(nèi)建立土壤縮影。一部分土壤消毒日常高壓滅菌法為2h,在121年連續(xù)5天以Unc和戈斯(2006)程序。促進(jìn)發(fā)芽的孢子

7、autoclavings之間的土樣在無(wú)菌條件下保持室溫。蒸發(fā)損失的水是通過(guò)添加相應(yīng)的補(bǔ)償金額無(wú)菌去離子水對(duì)土壤。Aliquots蒸壓土壤的板稀釋到營(yíng)養(yǎng)瓊脂板和孵化室溫48小時(shí)來(lái)檢查高壓滅菌法的有效性。沒(méi)有增長(zhǎng)48小時(shí)后被發(fā)現(xiàn)。存在/缺乏背景大腸桿菌種群在收集的土壤驗(yàn)證了如下:1 g的均質(zhì)土壤是懸浮在10毫升的大豆胰蛋白酶的肉湯,動(dòng)搖和孵化24 h在37°C(一式三份)。在35°C培養(yǎng)2 h,其次是22h孵化為44.5°C。沒(méi)有觀察到藍(lán)色,表明缺乏背景大腸桿菌在土壤樣品接種之前。2.1土壤微觀設(shè)置 新鮮的土壤被放置到一個(gè)消毒浴缸。膽汁鹽溶液(20%)被噴入土壤和均質(zhì)

8、化后,最終濃度為0.50%、0.30%、0.15%或0.05%。沒(méi)有BS3新鮮土壤和無(wú)菌土被用來(lái)提供積極的和消極的控制。土壤水分含量調(diào)整到50%的田間持水量用無(wú)菌去離子水,100克的土壤被放置到一個(gè)玻璃瓶里覆蓋著保鮮膜和在25°C培養(yǎng)在黑暗的總數(shù)為90天,建立一系列的土壤生態(tài)系統(tǒng)與逐漸改變了微生物群落結(jié)構(gòu)。共有594微觀(6×3 E治療。桿菌菌株×11破壞性抽樣事件后接種大腸桿菌×3復(fù)制每個(gè))建立。含水量的核心是評(píng)估每5天,失去的水量中添加形式的無(wú)菌蒸餾水通過(guò)滴,以便保持水分狀況在治療。在第10天微觀采樣和天90監(jiān)控變化的微生物群落使用這兩種文化基礎(chǔ)和非

9、文化基礎(chǔ)的方法。是否存在大腸在第90天測(cè)試桿菌使用上面描述的方法。沒(méi)有增長(zhǎng)的大腸大腸桿菌是明顯當(dāng)時(shí)點(diǎn)。土壤微觀在90天孵化被用作接收者的大腸桿菌接種。2.2大腸桿菌劑制備和孵化 從土壤中分離株最初來(lái)自牛牧場(chǎng)(S),人類排泄物(H)和狗糞便(D)被用作inoculums。簡(jiǎn)要10 g新鮮糞便或土壤樣本稀釋95毫升的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;137毫米氯化鈉,2.7毫米氯化鉀,100毫米Na2HPO4,2毫米KH2PO4)和動(dòng)搖280 rpm 30分鐘。對(duì)糞便樣本,200L 10-5稀釋的上層,固體物質(zhì)免費(fèi)階段被傳播到mFC瓊脂;土壤樣本200L稀釋的土壤自由懸掛被使用。這些盤(pán)子是在35°

10、C培養(yǎng)2 h隨后在44.5°C的孵化22小時(shí)。藍(lán)色飛跑到mFC瓊脂和44.5°C培養(yǎng)24小時(shí)。單一的在mFC瓊脂接種到MacConkey瓊脂板,在37°C培養(yǎng)24小時(shí)。粉紅色或紅色屬地在MacConkey瓊脂被確認(rèn)為大腸桿菌使用一系列的生化測(cè)試(Dombek et al。,2000):增長(zhǎng)最小乳糖瓊脂板、缺乏增長(zhǎng)最小檸檬酸瓊脂板和吲哚生產(chǎn)。確認(rèn)菌株進(jìn)行使用API20E。3株用于這項(xiàng)研究被認(rèn)為是大腸通過(guò)與優(yōu)秀的識(shí)別API20E桿菌分?jǐn)?shù)。3株生長(zhǎng)曲線構(gòu)造比較他們的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)使用Bioscreen C自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)(皮斯卡塔韋,NJ)。非常類似的增長(zhǎng)率和動(dòng)態(tài)

11、值觀察,表明3株的可比性。一夜之間大腸桿菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯是在3000×g 4°C和30分鐘收獲而離心,顆粒狀細(xì)胞被重新懸浮在無(wú)菌水,洗兩次通過(guò)離心3000×4°C g和30分鐘,然后重新懸浮在無(wú)菌水達(dá)到最終濃度的9LogCFU /毫升,是維持在20°C然后4 h接種之前確保所有過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌利用了。大腸桿菌接種到土壤微觀通過(guò)噴霧,輕輕攪拌建立一個(gè)細(xì)胞密度大約8Log CFU / g干土。被稱為發(fā)酵劑的使用在如此高的濃度是確保檢測(cè)大腸隨后的DGGE分析大腸桿菌。最后接種密度是由連續(xù)稀釋和菌落計(jì)數(shù)。微觀世界是在黑暗中孵化在25°C,總共

12、是150天。土壤從微觀是狼狽地取樣日0(1 h接種后)、7、14、21、28,45歲,60、75、90、120、150年為枚舉的可耕種的大腸桿菌。分析了土壤樣品的微生物群落的變化使用DGGE在天0、21、45、75、90、120和150。水分損失在孵化是補(bǔ)償通過(guò)添加去離子水維持恒定土壤水分狀況。2.3細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)和細(xì)菌指數(shù)計(jì)算 土壤樣品(5 g)被加載到45毫升的無(wú)菌磷酸鹽緩沖稀釋水(PBW)(0.002米、0.0003米MgCl2 KH2PO4)和30s在冰上使用超聲波dismembrator(型號(hào)100,費(fèi)舍爾科學(xué))。粒子自由上清當(dāng)時(shí)用十進(jìn)制使用無(wú)菌PBW稀釋。200L合適的稀釋擴(kuò)散到R2

13、A是在重復(fù)媒體(Difco)和孵化室溫(25°C)長(zhǎng)達(dá)10天。屬地在盤(pán)子里被枚舉每日第一6天,然后每隔一天為以下4天。描述了細(xì)菌群落組成,兩個(gè)索引進(jìn)行計(jì)算。這個(gè)殖民地發(fā)展指數(shù)(CD)提出Sarathchandra et al。(1997)是計(jì)算方式如下:CD =(N1/1 + N2/2 + N3/3 + N4/4 + N5/5 + N6/6 + N8/8 + N10/10)×100,其中N代表比例的細(xì)菌菌落出現(xiàn)在天1,2,3,10。它通常假設(shè)一個(gè)高CD值表示一個(gè)大比例的特化種而低價(jià)值的建議有更高比例的k-戰(zhàn)略家。在這里計(jì)算,CD的值范圍從100(如果所有的殖民地都出現(xiàn)在第一

14、天)到10(如果所有的殖民地都出現(xiàn)在一天10)。這個(gè)生理(EP)指數(shù)被描述為DeLeij et al(1993)是改編自香農(nóng)多樣性指數(shù)的概念(H),通常用于確定細(xì)菌菌落發(fā)展在瓊脂(De Leij et al。,1993)。EP指數(shù)計(jì)算為:EP =(Pi×log10Pi),Pi是人口/總?cè)丝?對(duì)于每種八類(殖民地出現(xiàn)在每個(gè)8天)。更高的CD和EP指數(shù)表明更均勻分布的殖民地類.2.4枚舉的大腸桿菌在孵化土壤 三瓶從每個(gè)治療進(jìn)行破壞性抽樣和枚舉的可耕種的大腸在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)大腸桿菌。5克(鮮重)的土壤被添加到一個(gè)50毫升錐形離心管包含45毫升的無(wú)菌PBW隨后使用超聲波聲處理在冰dismembr

15、ator(型號(hào)100,費(fèi)舍爾科學(xué))在30s成立6組。解決后10分鐘粒子自由上層的是用十進(jìn)制稀釋和過(guò)濾膜過(guò)濾系統(tǒng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)膜過(guò)濾協(xié)議。簡(jiǎn)單地說(shuō),解決方案是透過(guò)一個(gè)0.45m膜過(guò)濾及孵化改性膜耐熱的大腸桿菌瓊脂(修改mTEC)瓊脂為35°C 2 h在隨后在44.5°C的孵化為18 - 22小時(shí)。紅色或洋紅殖民地算為大腸桿菌。隨著數(shù)量的可耕種的大腸桿菌跌低于偵測(cè)極限的薄膜過(guò)濾法(3LogCFU)、或然數(shù)法與五管每稀釋?xiě)?yīng)用為枚舉(Clesceri,1989)。3結(jié)果3.1 BS3效應(yīng)對(duì)微生物群落組成在這項(xiàng)研究中,治療后以不同濃度的BS3,板計(jì)數(shù)進(jìn)行量化改變土壤中可耕種的細(xì)菌10天后,

16、90天孵化。在eco生理結(jié)構(gòu)變化的細(xì)菌社區(qū)是由EP和CD指數(shù)表示。BS3的影響在細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)通過(guò)放大的碎片高度保守16 s rRNA基因使用PCR和異形DGGE的。3.2大腸桿菌菌株在土壤雖然沒(méi)有明顯的增長(zhǎng)的大腸桿菌檢測(cè),所有三個(gè)大腸桿菌菌株可能存在于土壤在一段時(shí)間后,一些人甚至仍可檢測(cè)的末尾的孵化(150 d)(圖3)。變異的大腸桿菌隨著時(shí)間的推移,適應(yīng)檢查動(dòng)態(tài)的菌株接種在土壤縮影。這種方法通常是用于大多數(shù)監(jiān)測(cè)實(shí)踐在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。一般來(lái)說(shuō),生存的模式為所有三個(gè)大腸桿菌菌株配合很好,一個(gè)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型,最常用的模型來(lái)描述腸道細(xì)菌死亡在土壤(博爾頓et al。1999、起重機(jī)和摩爾,19

17、86,Natvig et al。2002和Reddy et al。,1981),R平方值的范圍從0.821到0.937。大腸桿菌數(shù)量隨著時(shí)間逐漸下降與衰減率從0.04到0.12不等LogCFU每天每克土壤(圖2)。死亡模式的大腸在土壤桿菌菌株依賴:狗大腸桿菌菌株衰退更加迅速地在土壤比其他兩個(gè)菌株:在第一個(gè)75天孵化,水平的狗應(yīng)變下降了多達(dá)8個(gè)數(shù)量級(jí),而減少的其他兩個(gè)只有兩到六個(gè)數(shù)量級(jí),狗應(yīng)變無(wú)法被檢測(cè)到從所有的治療120天后孵化,而其他兩個(gè)菌株展示了更大的持久性和可以探測(cè)到在一些微觀甚至150天后孵化.感謝這項(xiàng)研究,在一定程度上支持格蘭特(合同# )從佛羅里達(dá)州南部地區(qū),佛羅里達(dá)水資源管理。作

18、者感謝哈伍德博士在南佛羅里達(dá)大學(xué)的技術(shù)援助。我們感謝兩個(gè)匿名評(píng)論者的講話幫助改善手稿。參考文獻(xiàn): Persistence and differential survival of fecal indicator bacteria in subtropical waters and sedimentsApplied and Environmental Microbiology, 71 (2005), pp. 30413048Aries et al., 1969V. Aries, J.S. Crowther, B.S. Drasar, M.J. HillDegradation of bi

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