膠乳微球偶聯(lián)蛋白的使用中常見問題及解答

1、膠乳微球使用中常見問題及解答以下問題是我們用戶在使用過程中遇到的問題，我們?cè)儐柫藝獾募夹g(shù)人員，這是他們的答復(fù)）問：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑是平均粒徑嗎？答：產(chǎn)品說明書中給出的膠乳粒徑（Diameter）是平均粒徑。問：如何選擇膠乳微球的粒徑？答：一般選擇粒徑小的膠乳微球，則需要的抗體量就多，精密度和線性相對(duì)較好，而選擇粒徑大的膠乳微球性，則所需抗體少，精密度和線性相對(duì)較差，相對(duì)于小球，大球的靈敏度較好。問：一般狀況下我們所使用的微球的濃度或許是多少？答：整個(gè)測(cè)定體系中，微球的濃度大約在0.01%左右，當(dāng)然這與試劑本身規(guī)定的線性有關(guān)系。問：在使用離心方法偶聯(lián)乳膠微球，一般需要多大的（相對(duì)）離

2、心力？答：需要多大的離心力和所使用的乳膠微球有關(guān)，一般70nm左右的微球或許13000g/min 30min以上，粒徑越小所需時(shí)間越長，離心力越大。問：蛋白（抗體）與微球偶聯(lián)前，是不是微球的活化時(shí)間越長，效率越好？答：羧基微球的活化所需時(shí)間很短，一般以10-20分鐘為宜，長時(shí)間的活化反而會(huì)降低偶聯(lián)效率。問：由于抗體不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向與EDCA活化微球偶聯(lián)呢？假如是這樣，是不是會(huì)影響抗體與抗原的特異性反應(yīng)？答： 事實(shí)的確如此，當(dāng)然由于抗體的空間折疊方式和FC端疏水性強(qiáng)，因此偶聯(lián)反應(yīng)的絕大多數(shù)發(fā)生在Fc端，對(duì)抗體與抗原的結(jié)合的影響不大。問：膠乳微球與抗體偶聯(lián)后

3、，當(dāng)時(shí)沒發(fā)覺有凝集，但隔夜后發(fā)覺有凝集，這是什么緣由？如何把握和避開？答：這種狀況一般是偶聯(lián)效率低的緣由。當(dāng)體系中蛋白不足或是其它緣由，使微球表面在交聯(lián)后還空出很多反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)又可以與相連微球上的蛋白反應(yīng)，結(jié)果是把球又拉在一起了，所以有聚集?？梢约右恍┳钄鄤?解決,常見的是BSA，另外，也可提高微球的交聯(lián)率。但為什么是過一段時(shí)間后才消滅凝集呢，這是由于微球偶聯(lián)上蛋白后，相互之間由于攜帶同種電荷的關(guān)系，比較穩(wěn)定（所以能以膠體樣存在），只有當(dāng)間或相互碰撞，遇上彼此的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)才能結(jié)合。3、膠乳的自凝現(xiàn)象如何把握和避開？答：膠乳自凝與很多因素有關(guān)，如高電解質(zhì)濃度、表面價(jià)電荷被中和、或置于某些

4、不利環(huán)境如冷凍時(shí)。假如電解質(zhì)濃度上升到某一水平，使得表面的價(jià)負(fù)荷被掩蔽，膠乳微球之間發(fā)生接觸，于是便產(chǎn)生凝集，故高離子強(qiáng)度的緩沖溶液不應(yīng)使用，緩沖溶液的的濃度不要超過50mM，但有些CML膠乳微球具有高電荷密度，則也能夠耐受較高的離子強(qiáng)度。對(duì)負(fù)電荷膠乳微球，不能使用陽電荷的緩沖溶液如Tris緩沖溶液，由于能使電荷中和而凝集。在長期貯藏時(shí)，懸浮介質(zhì)的pH值應(yīng)至少保持在比膠乳微球表面基團(tuán)的pKa值高1-2pH單位。高濃度的膠乳微球簡潔促使膠體不穩(wěn)定，故膠乳微球的濃度盡量以低濃度為宜，膠乳微球也不能受冷凍，否則會(huì)凝集。問：抗體偶聯(lián)至羧基微球后，即時(shí)檢測(cè)效果很好，但置于37度 2天后，抗體活性好像下降

5、很大，什么緣由？答：這種狀況或許是以下狀況所致：一、乳膠微球含有表面活性劑，導(dǎo)致膠乳自身消滅自凝現(xiàn)象，可以通過顯微鏡進(jìn)行觀看，假如是膠乳含有活性劑，則在偶聯(lián)之前進(jìn)行清洗，保證偶聯(lián)的膠乳微球沒有聚集。二、假如共價(jià)結(jié)合反應(yīng)是成功的而抗體活性失活如此快速，最常見的緣由是抗體質(zhì)量差或試劑過期所致，而且還會(huì)消滅一個(gè)自由流淌白色粉末、持續(xù)性團(tuán)塊等，這表表明試劑已被污染。問：膠乳溶液用什么緩沖液多大離子強(qiáng)度保存穩(wěn)定性最好？答：一般常用的是低濃度的Goods緩沖液，如MOPSO、MES、HEPES等緩沖液，濃度在25-50mmol/L。問：膠乳微球偶聯(lián)抗體后與抗原進(jìn)行反應(yīng)，但是反應(yīng)不明顯，是什么緣由所致？答：

6、抗原和抗體不匹配；包被的抗體量下足；抗體使用量雖多，但偶聯(lián)效率低。問：如何選擇膠乳試劑的波長？答：膠乳試劑隨著檢測(cè)波長的增加吸光度降低，為了保證試劑檢測(cè)過程中不超過吸光度的檢測(cè)限，一般膠乳試劑的波長選擇在546-600nm左右。微球表面基團(tuán)種類及其反應(yīng)微球表面基團(tuán)活化劑與之反應(yīng)之基團(tuán)生成化學(xué)鍵類型羧基EDC；EDC/(sulfo)NHS；CDI；CMPI伯氨；仲氨酰胺；仲胺氨基交聯(lián)劑硼氫化氰羥基琥珀酰亞胺酯；醛基鹵乙?；?；氯甲基酯酰胺；仲胺或叔胺酰肼交聯(lián)劑硼氫化氰羥基琥珀酰亞胺酯醛基二?；逻€原型腙環(huán)氧基 氨基；巰基；羥基仲胺；硫醚；醚醛基硼氫化氰；苯胺酰肼；肼；氨氧基腙；腙；肟巰基

7、交聯(lián)劑；四硫磺酸鈉4,4'-聯(lián)吡啶二硫醚馬來酰亞胺；鹵乙?；欢蜻拎?；環(huán)氧基；羥基琥珀酰亞胺酯；乙烯砜硫醚；硫醚；二硫化物二硫化物；硫醚；硫醚硫醚羥基CDI；對(duì)甲苯磺酰氯溴化氰；DSC雙環(huán)氧基化合物氨基；巰基；羥基胺；仲胺；硫醚；醚金屬基硫醇或二硫醇硅羥基硅烷共價(jià)結(jié)合膠乳微球的參考方法（以下內(nèi)容均為國外文獻(xiàn)翻譯過來的）A. 一步法1. 配制50 mM 的MES反應(yīng)緩沖溶液，pH值為6.0；2. 將蛋白質(zhì)溶解于反應(yīng)緩沖溶液中，其濃度為10mg/ml；3. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其濃度為1%（W/V）；4. 將上述蛋白質(zhì)溶液與膠乳微球混和，混和后在室溫培育20分鐘；5. 用去離子

8、水配制EDAC溶液，濃度為10 mg/ml（52mol/ml）；6. 取計(jì)算量的EDAC溶液加到蛋白質(zhì)與膠乳微球混合液中；7. 用0.1 M氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)整該反應(yīng)混合液的pH值至 6.5±0.2，在搖床室溫培育2小時(shí)；8. 將未結(jié)合的蛋白質(zhì)除去，貯藏于緩沖溶液中。B. 二步法簡潔二步法1. 用反應(yīng)緩沖溶液稀釋膠乳微球，使其濃度為1%（W/V）；2.1ml膠乳微球懸浮液，加入20 mg EDAC，在室溫培育40分鐘，在20分鐘后其次次加入20 mg/ml；3.用相等體積的該緩沖溶液來洗滌膠乳微球，離心，用1倍體積的緩沖溶液重復(fù)處理；4.將蛋白質(zhì)溶解于50-100mM的MES

9、緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml；5.再將膠乳微球懸浮于去離子水或結(jié)合的緩沖溶液中，快速加入溶解的蛋白質(zhì)，37攪拌反應(yīng)3小時(shí)；6.按1ml反應(yīng)混合液加入2.5 l乙醇胺混合，攪拌反應(yīng)10分鐘；7.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，貯藏與貯存的緩沖溶液中。生成NHS-酯的中間體二步法1.每ml反應(yīng)混合物加入下列各物：a.去離子水是最終容積為1.0 ml；b.0.1 ml的10x的貯備緩沖溶液，其pH值為6.0-6.5（一般可用0.5 M MES緩沖溶液）；膠乳微球最終濃度為1%（W/V）；c.0.23 ml的50 mg/ml 的NHS在去離子水中的溶液；d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC

10、在去離子水中的溶液（注5、6）；2.在室溫將此混合物反應(yīng)15-30分鐘，不斷攪拌；3.用MES緩沖液或純化水洗滌膠乳微球懸浮物，除去未反應(yīng)的NHS和EDAC；4.重新將膠乳微球在去離子水中懸浮，使其濃度為1%（w/v）；5.將結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于50-100mM 的MES緩沖溶液中，濃度為1 mg/ml；6.馬上加入蛋白質(zhì)溶液（膠乳微球、蛋白質(zhì)和緩沖溶液的濃度分別為0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）；7.將混合物反應(yīng)至少2小時(shí)，輕輕攪拌；8. 按1ml反應(yīng)混合液加入2.5 l乙醇胺混合，攪拌反應(yīng)10分鐘；9.除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和乙醇胺，貯與適宜的貯存緩沖溶液中。C、蛋白質(zhì)與

11、帶醛基的膠乳微球反應(yīng)帶醛基的膠乳微球是疏水性的膠乳微球，能吸附并能與蛋白質(zhì)在中性pH條件下生成Schiff堿，這是脂肪族醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生的反應(yīng)（賴氨酸的伯胺）。這些膠乳微球不需事先活化而生成共價(jià)鏈。Schiff堿的生成是可逆反應(yīng)。此Schiff堿能被氰基氫硼化鈉（sodium cyanoborohydride）反應(yīng)還原至穩(wěn)定的烷基胺。當(dāng)肽類或其他有單一反應(yīng)氨基的分子與帶醛基的膠乳微球結(jié)合時(shí)，由于還原而趨向穩(wěn)定。下面說明蛋白質(zhì)與帶醛基的膠乳微球結(jié)合的方法：1. 配制50 mM的反應(yīng)緩沖溶液，pH值為7.0-7.5；2. 配制10 mg/ml的蛋白質(zhì)在反應(yīng)緩沖溶液中的溶液；3. 配制1%(w/v) 帶醛基膠乳微球在反應(yīng)緩沖溶液中的懸浮液；4. 將1份蛋白質(zhì)溶液和10份膠乳微球懸浮液混和，在室溫反應(yīng)2小時(shí)；5. 除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)；6. 貯藏膠乳微球結(jié)和物與適宜的貯存緩沖溶液中。元升生物科技（上海）有限公司是一家專業(yè)為診斷試劑廠家