本科畢業(yè)論文花生中植物螯合肽PC的研究

1、題 目： 花生中植物螯合肽PC的研究 學(xué) 院： 專 業(yè)： 姓 名： 指導(dǎo)教師： 完成日期： 摘 要重金屬是我們熟知的環(huán)境污染物之一，近些年， 工礦業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥、 化肥的使用，使得重金屬對水體，土壤的污染愈來愈嚴(yán)重，而在植物的器官中累積的重金屬，最終經(jīng)過食物鏈迫害人類。利用植物減輕重金屬污染是國內(nèi)外研究開發(fā)的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)鎘被人體吸收后，在體內(nèi)變成鎘硫蛋白，鎘硫蛋白具有選擇性，可累積于腎、肝中。其中，進(jìn)入體內(nèi)的1/3的鎘可被腎臟吸收，腎臟是鎘中毒的靶器官。其它臟器例如胰、脾、甲狀腺和毛發(fā)等也會累積一定量。鎘在體內(nèi)可與含氨基、羥基、硫基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，抑制許多酶系統(tǒng)，從而使肝、腎器官中酶系統(tǒng)的

2、正常功能受阻。由于鎘會損傷腎小管，病人會出現(xiàn)糖尿、蛋白尿和氨基酸尿的癥狀。更嚴(yán)重的會使使骨骼的代謝受阻，造成骨質(zhì)疏松、萎縮等一系列癥狀，鎘的危害已經(jīng)受到人們極大地關(guān)注。本研究以花生形成的植物螯合肽含量為指標(biāo)，探索了不同濃度的鎘誘導(dǎo)花生產(chǎn)生植物螯合肽含量的影響。以在不同重金屬鉻的環(huán)境下生長的花生為原料，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀來測定花生中植物螯合肽的含量。本實(shí)驗(yàn)利用C反相柱，用乙腈和1.5%的三氟乙酸檢測了花生中在不同濃度鎘誘導(dǎo)下形成的植物螯合肽含量。在以上的實(shí)驗(yàn)條件下，檢出限為0.25mg/L；線性范圍分布在0.60-0.25mg/L( R2=0.9988)之間，回收率在80% 以上，靈敏

3、度相對較高。選用該方式對花生中的螯合肽做定量分析，證明了花生中有植物螯合肽。結(jié)果表明，重金屬鎘污染的花生中都檢出不同濃度的植物螯合肽。本實(shí)驗(yàn)的目的在于為重金屬鎘污染的減弱做一份貢獻(xiàn)。 關(guān)鍵字：鎘污染；花生；植物螯合肽（PC）；高效液相色譜-質(zhì)譜Abstractheavy metals is known as one of environmental pollutants, in recent years, the development of industrials, the use of pesticides, fertilizers, makes the heavy metals

4、 in the aquatic and soil pollution becomes more and more serious, and heavy metals are accumulated in the plant organs, the finally, human is persecuted by heavy metals through the food chain.Using plants to reduce heavy metal pollution is a hotspot of research and development at home and abroad. Th

5、e study found that cadmium absorbed by the body will turn into cadmium sulfide protein, cadmium sulfide is a selective protein, can be accumulated in kidney, a third of the cadmium can be absorbed by the kidney, the kidney is the target organ of cadmium poisoning. Other organs such as pancreas, sple

6、en, thyroid gland and hair also be accumulated a certain amount. Cadmium in the body will be united by protein molecules containing amino, hydroxyl, inhibition of many enzyme system, so that the normal function of the liver and kidney organs in enzyme system will be damaged. Due to the cadmium, the

7、patient can appear the symptom of diabetes, protein and amino acid urine, More seriously, which can make bone metabolism, cause osteoporosis, contraction and a series of symptoms, the harm of cadmium has been greatly concerned.In this study, Chelating peptide content in plants was used as an index,

8、which explored the influence that different concentrations of cadmium induced the content of peanut plant chelating peptide, the study use peanuts grown in different heavy metal chromium as raw material and take advantage of high performance liquid chromatography-mass spectrometry instrument to dete

9、rmine the content of peanut plant in chelating peptide.This experiment took advantage of reversed phase column C, acetonitrile and 1.5% trifluoroacetic acid, which detected the chelating peptide content of peanut under The induced of different concentrations of cadmium. In the above experimental con

10、ditions, the detection limit was 0.25 mg/L; distribution of the linear range was 0.60 -0.25 mg/L (R2 = 0.9988), and between the recovery rate was over 80%, relatively high sensitivity. Choosing the way of peanut chelating peptide was found quantitative analysis. The results showed that the Peanuts p

11、olluted by heavy metal cadmium were detected with different concentration of plant chelating peptide.The purpose of the study was to do a contribution for heavy metal cadmium pollution reduced.Key words：Cadmium pollution; Peanuts; Plant chelating peptide (PC); High performance liquid chromatography

12、- mass spectrometry目 錄序言1 0.1 植物螯合肽( PC)的簡介10.2 植物螯合肽( PC)的合成1 0.3 PC對重金屬的解毒作用3第1章 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法51.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器51.2 實(shí)驗(yàn)方法5第2章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分討論7 2.1 PC標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的色譜分離72.2 鎘對花生體內(nèi)PC和GSH含量和PC狀態(tài)的影響72.3 花生樣品中PC4的含量檢測8第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)論12 3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論12 3.2 研究展望12參考文獻(xiàn)13致謝14序言0.1植物螯合肽( PC)的簡介 0.1.1 PC的種類植物螯合肽（PC phytoehelatin），是在重金屬誘導(dǎo)下，

13、植物通過一個(gè)富含半胱氨酸的多肽的酶催化合成的一種巰基含量特別高蛋白質(zhì)。研究表明PC由Glu、Cys、 Gly三種氨基酸組成，分子量位于1.5-4KD之間。研究表明PC最初是在用200 mMol/LCdSO4誘導(dǎo)蛇根木懸浮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)的，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種帶有不同的C-末端氨基酸種類的PC，分別是：（-谷氨酸-半胱氨酸）n-Gly，(-谷氨酸-半胱氨酸）n-Gly，（-谷氨酸-半胱氨酸）-Ala，（-谷氨酸-半胱氨酸）n-ser和（-谷氨酸-半胱氨酸）-n。 PC螯合重金屬的原理植物螯合肽對重金屬離子具備很強(qiáng)的螯合能力，因此在重金屬的積聚與解毒過程當(dāng)中起著決定性功能。其機(jī)理是：重金屬離子植物吸

14、收到體內(nèi)后，與細(xì)胞內(nèi)的PC 作用構(gòu)成復(fù)合物， 而后轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器( 特別是液泡)，然后區(qū)室化絡(luò)合，降低細(xì)胞質(zhì)中有毒的金屬離子的濃度。 PC的測定方法PC的測定方式包含高效液相色譜-氨基酸主動分析聯(lián)用法、前衍生反相高效液相色譜熒光檢測法、電化學(xué)法、 電泳法。其中，柱前衍生液相色譜熒光法的優(yōu)點(diǎn)是能測定不同種類的 PC，但是衍生試劑難購買到，并且衍生過程復(fù)雜；電化學(xué)法和電泳法可測定總的PC，但不能確定不同作物的PC的類型；而高效液相色譜-氨基酸自動分析聯(lián)用方式難達(dá)成；高靈敏度液相色譜-質(zhì)譜法，具有分離率高，可在多肽復(fù)合物測定PC結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)點(diǎn)，成為PC的主要測定方法。0.2 PC合成 Salt等

15、研究者將植物對金屬的解毒機(jī)制分為生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞修復(fù)作用、區(qū)室化作用、螯合作用這四個(gè)方面。螯合效應(yīng)是指在植物中的PC利用高親和力螯合金屬離子，金屬濃度降低后，植物重金屬毒性有所削弱。螯合作用是指植物中的重金屬經(jīng)過與PC這種高親和力物絡(luò)合成螯合物從而使重金屬離子在植物體內(nèi)的濃度降低，削弱其毒性。0.2.1 PC的合成需要金屬離子的誘導(dǎo)PC 的合成可被金屬離子激活，因?yàn)槊傅幕钚阅鼙唤饘匐x子誘導(dǎo)。當(dāng)植物組織液、細(xì)胞生長介質(zhì)或酵母培養(yǎng)液中加入微量重金屬元素時(shí)，即可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生少量PC，其中Cd2+對PC 的影響最大。曾有學(xué)者用實(shí)驗(yàn)測定了金屬離子對PC的合成的誘導(dǎo)能力比較，結(jié)果顯示其中Cd2+對PC合成的

16、影響最大，同時(shí)Ni2+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Ag+、Sn2+、Zn2+、Sb3+、P2+、Au+均可誘導(dǎo)PC合成，然而將激活劑金屬離子濃度降低或者是外加金屬螯合劑( 例如EDTA)時(shí)，PC的合成就會被迫停止，這說明 PC 生物合成需要金屬離子的誘導(dǎo)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明不同金屬對 PC誘導(dǎo)作用在不同種植物中有不同的強(qiáng)度。 PC是以谷胱甘肽(GSH)為底物的酶促反應(yīng)關(guān)于GSH合成 PC的過程，研究者普遍認(rèn)為按一下方式進(jìn)行的：-GCS-Glu-Cys+GlyGlu+Cys- ATP ->-PCGSHGS-ATP->->PCS+ Cd2+ 圖 1.1PC 的生物合成過程半胱氨酸：

17、Cys；谷氨酸：Glu；甘氨酸：Gly；谷胱甘肽：GSH 谷胱甘肽酶：GS；-谷氨酰半胱氨酸合成酶：GCS；植螯合肽：PC；植物螯合肽合成酶：PCS 第一步-GCS使用ATP把Cys和Glu連接成- Glu- Cys，再由ATP供應(yīng)能量， 谷胱甘肽合成酶（GS）在-谷氨酸-半胱氨酸連接甘氨酸殘基，從而合成一個(gè)-谷氨酸-半胱氨酸甘氨酸分子即GSH，植物螯合肽合成酶（植物chelatin合成酶，PCS）N端具有有源區(qū)和信號區(qū)，沒有Cd2 +的存在時(shí)，C端檢測領(lǐng)域不會觸發(fā)信號，則N端的激活結(jié)構(gòu)域的酶就無活性；而當(dāng)溶液中有 Cd2+時(shí)，信號檢測域感受到Cd2+，與Cd2+、Cys連接構(gòu)成特別的空間結(jié)構(gòu)

18、，使酶的N端區(qū)域擁有催化活性。在這個(gè)地區(qū)，一個(gè)分子的PC合酶催化另一種分子GSH合成PC2，PC2可以繼續(xù)被GSH催化，使 PC3進(jìn)一步合成。0.3 PC對重金屬的解毒作用0.3.1 PC可提高植物對重金屬的抗性 斯特芬和其他科學(xué)家在1986年使番茄品種細(xì)胞用足以致死的濃度處理，獲得了抗Cd2+的細(xì)胞，獲得的抗性細(xì)胞中，植物螯合肽的累積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞， 但隨著-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑BSO（丁亞磺酰亞胺）作用于Cd2+抗性細(xì)胞之后，其又恢復(fù)了對Cd2+的敏感性，所以他們認(rèn)為PC含量與細(xì)胞對Cd2+的抗性有關(guān)，做了不同植物的實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果是一樣的。研究人員發(fā)現(xiàn)，吃蘑菇的美味牛肝菌（牛肝菌

19、）通過PC螯合Cd（Collin漢森2007），當(dāng)線蟲cepcs3和煙草耐Cd能力改進(jìn)以后，胞漿中PCCD所占的比重也增加了。許多試驗(yàn)表明，隨著鎘濃度的增加，鎘螯合肽細(xì)胞數(shù)量也增加，高分子螯合肽含量也增加，這些研究表明，PC可以減輕鎘的毒性作用，越來越多的研究表明，PC不僅可以緩解重金屬鎘對植物的毒性作用還可以提高對重金屬鎘的抗性。0.3.2 PC解除重金屬的毒害作用機(jī)理 植物螯合肽的功能主要是通過絡(luò)合重金屬與將重金屬區(qū)室化來減輕重金屬對細(xì)胞的毒害，多數(shù)金屬離子都能被PC 絡(luò)合，但是研究較清楚的是植物螯合肽與金屬Cd的絡(luò)合機(jī)制，并且日前分離出的PC大多是PC-Cd型復(fù)合物。Howden等從被C

20、d2+誘導(dǎo)的植物中分離出兩種 PC-Cd復(fù)合物，一種是硫含量低的Pc-Cd復(fù)合物和含硫量高的pC-CdS 復(fù)合物，它們均是可溶性化合物，硫含量低的Pc-Cd是Cd2+ 的運(yùn)輸載體，大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中；硫含量高的pC-CdS是液飽中Cd 2+存在的主要方式。植物對Cd2+解毒方法可以分為硫含量低的Pc-Cd復(fù)合物的跨液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)、硫離子在液泡中的累積導(dǎo)致的含硫量高的pC-CdS 形成這兩種方式。當(dāng)Cd2+進(jìn)入到細(xì)胞后，PC合酶與Cd2+形成硫含量低的Pc-Cd復(fù)合物，它在重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白hmtl( heavy metal toleranee)（位于液泡膜上）的幫助下進(jìn)入到液泡里面，接著和液泡中的Cd2

21、+、硫化物結(jié)合形成毒性較低的HMW，從而解除了Cd2+的毒性。研究還發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下，液泡中的HMW復(fù)合物上的金屬離子還能和檸檬酸、蘋果酸相結(jié)合，失去金屬離子的PC 分解成形成氨基酸，又返回細(xì)胞質(zhì)中參與 PC的合成。見圖1.2圖1.2 PC解除重金屬的毒害作用機(jī)理示意圖第1章 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 該實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)試劑有：三氟乙酸（分析純，沈陽新紀(jì)化學(xué)公司）；乙腈(色譜純，沈陽新紀(jì)化學(xué)公司 )；(- G l u-Cys) 4- A la(北京盛科博源生物科技有限公司)；PC標(biāo)準(zhǔn)品（純度> 97%的丙氨酸類植物螯合肽PC4 )；去離子水；花生。該實(shí)驗(yàn)所用的

22、實(shí)驗(yàn)儀器有：配備二極管陣列檢測器；色譜儀 (美國公司 )；單極質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國公司) ； 有50mm、1 mm、 3.5mm規(guī)格的C18色譜柱（美國公司)，配有電霧化學(xué)源，質(zhì)譜工作站。1.2實(shí)方法驗(yàn) 花生樣品的處理 花生種植后，樣品被粉碎，利用索氏提取脫脂，脫脂干燥后是一種粗蛋白粉，稱 0 .6-2.5 g蛋白粉末。 花生中PC的提取 根據(jù)sneller（2000）的方法，把花生鮮樣用液氮在研缽中磨碎，然后冷凍干燥達(dá)70小時(shí)，冷凍干燥以后稱量約0.1g的花生，再加入7mL的0.1% TFA（含6.3mmol/LDOTA，PH<1)，充分振蕩 30min ，然后4度下， 在約10000

23、r/m in離心率下離心20 m i n ，吸取上清液以備待測用。 巰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品的配制 選用0.1% TFA(含6.3mmol /L的LDTPA) 制成4種巰基化合物貯備液，濃度均為1mmol /L的，分別為：Cd- PC 標(biāo)準(zhǔn)品（(美國 Waters公司），Cys和GSH 備用液，置于4冰箱保存。 花生中GSH，PC等總含量的測定 配置含1.6 mmol /L 的埃爾曼試劑試劑顯色劑(含6.3 mmol /L的DTPA)的200 mmol /L的HEPPS 緩沖液（pH = 7.6），避光保存，取花生組織提取液 300 L 加到300L DTNB顯色劑中，混勻后在30下反應(yīng)3 min，其

24、中GSH，PC和TNB會發(fā)生反應(yīng)，生成黃色化合物，非蛋白巰基化合物與黃色化合物含量符合1:1的比例關(guān)系，依據(jù)有差別的花生樣品在420 nm下的吸光度值不同，便可計(jì)算出花生樣品中巰基含量。 衍生試劑(mBBr)的配制及柱前衍生反應(yīng) 衍生試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，用100%的乙腈正確配制250mmol /L的mBBr衍生試劑，搖勻后，置于4冰箱避光保存。柱前衍生化反應(yīng)為將10 L 25mmol/ L的mBBr和670 L 200 mmol/LHEPPS(pH = 8.0 )加到300L 的4種標(biāo)準(zhǔn)液和植物組織上清液中，充分混合，37孵化反應(yīng)40min，于200 L 的1 mmol/L MSA激波旋渦抖動，

25、停止反應(yīng)，并作試劑空白的衍生反應(yīng)，反應(yīng)液在4冰箱避光保存，等待高效液相色譜法測定。（1） 實(shí)驗(yàn)的色譜條件：選用洗脫劑為 0 .1 % 三氟乙酸 ( TFA)乙腈進(jìn)行梯度淋洗， 流速為0.2mL /min；淋洗梯度條件見表1.1；設(shè)置柱溫為30；220-280 nm的二極管陣列檢測；進(jìn)樣容量為10ml。表1.1 淋洗梯度時(shí)間（M）三氟乙酸(0. 1%)乙腈(色譜純)流速（0.2mL/mi n）0100200.210100200.240201000.260100200.2（2）質(zhì)譜條件：柱子型號為SB- C18；電噴霧電離的方式，噴霧電壓：3.5 kV；掃描范圍是：m / z 600-1500；錐

26、電壓為：25 V；采樣錐電壓：20 V；溶劑氣體溫度為：360；采樣錐電壓：20 V；氣體溫度和溶劑：360；脫溶劑氣流量：110m L /h。第2章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論2.1 PCs標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的色譜分離 經(jīng)提取的GSH，PCs巰基化合物和衍生試劑(mBBr) 在45的條件下衍生反應(yīng)40min 以后，生成帶有熒光的衍物mBSR， 在MBSR流線（ACN 0.1% TFA）下，一定濃度的混合樣品的4種化合物和GSH的分離是很清楚的，依次是GSH PC2 PC3 PC4這樣的分離順序。見圖2.1 0 10 20 30 40t/min圖2.1 混合樣品中標(biāo)準(zhǔn)PC，GSH化合物的色譜分離2.2 鎘對花

27、生體內(nèi)PC和GSH含量和PCs狀態(tài)的影響由圖2.2可得到，在濃度為60 mol/L的Cd 的脅迫作用下，花生體內(nèi)GSH與未加毒的比較相比含量無有明顯差別，這是由于土壤環(huán)境中有Fe 或者Zn等金屬離子的存在使得在無Cd的對照組中也檢測到 了PC2 ，通過設(shè)置多重比較，可知，花生經(jīng)Cd 處理后誘導(dǎo)花生產(chǎn)生了PC4，在Cd的影響下花生體內(nèi)產(chǎn)生的含量最大的是PC3，PC4與PC2 含量沒有明顯的差異。圖2.2 花生樣品中GSH，PCs的分離色譜圖圖2.3 Cd脅迫下花生中GSH，PCs的 含量2.3 花生樣品中PC4的含量檢測選擇HPLC質(zhì)譜條件 選用正離子模式，負(fù)離子形式分別掃描濃度為 1.0mg

28、/L 的PC標(biāo)準(zhǔn)溶液，證實(shí)PC4在負(fù)離子模式下信號反應(yīng)很弱，在正離子模式下反應(yīng)信號比較靈敏。優(yōu)化正離子掃描條件下各種條件，例如錐電壓為：25 V；噴霧電壓為：3.5 kV； 溶劑氣體溫度的去除：350；采樣錐電壓：20 V；透鏡電壓l2.0 V； 錐孔溫度為：105；脫溶劑氣流量為：110m L/h ； 全掃描范圍m /z 為：500-1200，反吹氣流量為：80m L /h。圖 2.4為條件優(yōu)化以后PC4的總離子流圖，圖 2.5為PC4化合物在正離子模式下的掃描質(zhì)譜圖。 圖2.4 PC 的總離子流圖圖2.5 正離子質(zhì)譜圖 PC4分子式為(-G l u-Cys) 4-A la ，分子量為101

29、8.22。從圖6b可以得出，信號反應(yīng)最強(qiáng)的是m/z1018的M +母離子峰；m /z 698的是M-Glu-Cys-Ala+離子峰，m/z 929的為M-Ala+離子峰，均為斷裂峰；m/z1019為 M + H +離子峰，m /z 521為M+H+ Na2 +離子峰，m /z 1056為 M- H + K +離子峰，大概是由于環(huán)境，樣品和容器含鉀，N和其他堿金屬，由于去除堿金屬樣品存在困難，所以在質(zhì)譜，K離子往往往作為一個(gè)特征離子。 將PC標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為 0.5、1.0、5 .0、10.0和 20.0mg /L的梯度溶液，用色譜-質(zhì)譜方式測定，橫坐標(biāo)用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度表示，縱坐標(biāo)用峰面積表示

30、，繪制這個(gè)條件下標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線。當(dāng)濃度為0.520.0mg/L時(shí)，線性方程為 y = 4351.3x+ 80275（r=0.9972）當(dāng)信噪比 S/N=3時(shí)，儀器檢出限為0.21mg /L，定量限為0.62mg /L。 回收率和精密度選用統(tǒng)一花生樣品進(jìn)行重復(fù)的精密度實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置試劑作為空白，結(jié)果見表 2.1，結(jié)果表明，本方法對濃度水平為 25.5mg /kg的樣品中 ，測定的PC4平均回收率達(dá) 89.3 % ；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)4.26 %。表格 2.1反映了回收率與精密度分析的結(jié)果 。表格2.1 實(shí)驗(yàn)的回收率與精密度的分析結(jié)果 ( n = 3)NUMBER分析結(jié)果mg/kg回收率(%)RSD

31、124.688.14.26223.382.64.26325.589.34.26 實(shí)際花生樣品的分析 選用HPLC-MS檢測方法，在兩種不同鎘水平下測定了兩個(gè)花生品種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花生樣品均有不同濃度的PC4化合物的發(fā)現(xiàn)，表2.2是測定結(jié)果，PC4花生樣品譜圖如圖2.6所示。文獻(xiàn)表明，含（-谷氨酸-半胱氨酸）植物螯合肽的N-丙氨酸肽鏈結(jié)構(gòu)，有豆類，但沒有報(bào)告花生中包含植物螯合肽。本實(shí)驗(yàn)建立了獨(dú)特的檢測方法被證明花生含有丙氨酸類PC化合物。表 2.2 花生樣品中植物螯合肽測定結(jié)果第1組PC4含量(mg/kg)第2組PC4含量（mg/kg）13.27.519.412.444.559.5圖2.6 花

32、生樣品中PC4的質(zhì)譜圖第3章 結(jié)論3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)論 植物螯合肽在花生里存在，而且主要以PC4的形式存在；植物螯合肽可以螯合多種重金屬離子，在花生中，對金屬鎘的螯合能力最強(qiáng)；關(guān)與測定方法，目前有：液相色譜法，分光光度比色法，凝膠過濾法，毛細(xì)管電泳法比較被認(rèn)可，而液相色譜法測定方法應(yīng)用最廣，選用mBBr 柱前衍生與高效液相色譜測定 PC則更簡單，重現(xiàn)性更好，靈敏度更高，也具有較好的分離能力。3.2研究展望本研究性實(shí)驗(yàn)在先前的基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，還有好多工作需進(jìn)一步研究。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明豆科植物及花生中植物螯合肽的存在，而且螯合肽的種類主要以PC4的形式存在，螯合肽PC的生成受哪些基因調(diào)控，或者

33、細(xì)胞所處周期時(shí)間不同會不會影響PC的種類，有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證。 參考文獻(xiàn)1張紅,王艷紅,王珊珊.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定花生中的螯合肽J.分析化學(xué)簡報(bào),2009,37(6):881-883.2 張靜,常青曉,孫傳范,段桂蘭.HPLC法測定鎘和砷脅迫下水稻根系的植物螯合肽J.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(7):1550-1555.3 婁來清,沈振國.金屬硫蛋白和植物螯合肽在植物重金屬耐性中的作用J.生物學(xué)雜志,2001,18(3):1-4.4 李安明,李德華,鄧青云汪宜宇.植物螯合肽合成酶的研究進(jìn)展J.植物生理學(xué)報(bào),2011,47(1):27-36.5 蔡保松,雷梅,陳同斌,張國平,陳陽.植物螯

34、合肽及其在抗重金屬脅迫中的作用J.生態(tài)學(xué)報(bào),2003,13(3):2127-2131.6 全先慶.植物鰲合膚及其功能J.生命的化學(xué),2007,27(3):213-215.7 姜瑛楠.重金屬鎘污染J.植物生態(tài)學(xué)報(bào),2005,29(4):659-66.8 蔡保松,雷梅.土壤砷污染對蔬菜砷含量食用安全性的影響J.生態(tài)學(xué)報(bào) 2003,23(10):2125-2132.9張玉秀,柴團(tuán)耀.植物耐重金屬機(jī)理研究進(jìn)展J.植物學(xué)報(bào),1999，41(5):453-457.10 茹炳根,潘愛華.金屬硫蛋白J.分析化學(xué)簡報(bào)1991,18(4):254-259.致謝請您刪除一下內(nèi)容，O(_)O謝謝！Many peopl

35、e have the same mixed feelings when planning a trip during Golden Week. With heaps of time, the seven-day Chinese請您刪除一下內(nèi)容，O(_)O謝謝！National Day holiday could be the best occasion to enjoy a destination. However, it can also be the easiest way to ruin how you feel about a place and you may become more

36、 fatigued after the holiday, due to battling the large crowds. During peak season, a dream about a place can turn to nightmare without careful planning, especially if you travel with children and older people. As most Chinese people will take the holiday to visit domestic tourist destinations, crowd

37、s and busy traffic are inevitable at most places. Also to be expected are increasing transport and accommodation prices, with the possibility that there will be no rooms available. It is also common that you' ll wait in the line for one hour to get a ticket, and another two hours at th

38、e site, to only see a tiny bit of the place due to the crowds. Last year, 428 million tourists traveled in China over the week-long holiday in October. Traveling during this period is a matter that needs thorough preparation. If you are short on time to plan the upcoming "Golden Week" it m

39、ay not be a bad idea to avoid some of the most crowded places for now. There is always a place so fascinating that everyone yearns for. Arxan is a place like this. The beauty of Arxan is everlasting regardless of the changing of four seasons. Bestowed by nature, its spectacular seasonal landscape an

40、d mountains are just beyond word. Arxan is a crucial destination for the recommended travelling route, "China Inner Mongolia Arxan Hailar Manzhouli". It is also the joint of the four prairies across the Sino-Mongolian border, where people gravitate towards the exotic atmosphere mixed with

41、Chinese, Russian, and Mongolia elements. As a historic site for the Yitian Battle, Arxan still embodies the spirit of Genghis Khan. Walking into Arxan, you will be amazed by a kaleidoscope of gorgeous colors all the year round - the Spring azaleas blooming red in the snow, the Summer sea wavering bl

42、ue in the breeze, the Autumn leaves painted in yellow covering volcanic traces, and the Winter woods shining white on the vast alpine snowscape. Hinggan League Arxan city is situated in the far eastern area of Inner Mongolia Autonomous Region. Its full name "Haren Arxan" means "hot ho

43、ly water" in the Mongolian language. Arxan is a tourism city in the northern frontier with a blend of large forest, grand prairies, vast snowfield, heaven lake cluster, thermium, as well as volcanic cluster. It is a rare and unique ecotourism base filled with healthy sunshine, clean air and uns

44、poiled green.  Nestled close to the country's largest virgin forest, and known for its spring and ecological environment, Arxan is marveled at by many tourists as the purest land on earth.  You cannot miss out the Autumn of Arxan. It is definitely the best with brightly-colored scenery

45、 full of emotions.  Autumn in the northern part of the country comes earlier than the South. A September rain followed by the footprints of Autumn brings more colors to the once emerald green mountain and blooming grassland.  Shutterbugs flock to see for themselves the marvel of splendid c

46、olors around the mountains and waters, many of whom have travel a long distance and even camp here only to capture a moment of the nature wonder.  The silver birch turns golden, while the larch is still proudly green. You will find yourself drowned in the intoxicating red of the wild fruits as

47、well as the glamour of flowers in full blown. And your heart will be lingering on the woods as it's time for the wild fruits to ripe. The picturesque Arxan in Autumn is indeed a fairyland only exists in a dream that satisfies all your fantasies. If it rains heavily on Saturday night, some e

48、lderly Chinese will say it is because Zhinu, or the Weaving Maid, is crying on the day she met her husband Niulang, or the Cowherd, on the Milky Way. Most Chinese remember being told this romantic tragedy when they were children on Qixi, or the Seventh Night Festival, which falls on the seventh day

49、of the seventh lunar month, which is usually in early August. This year it falls on Saturday, August 2. Folklore Story As the story goes, once there was a cowherd, Niulang, who lived with his elder brother and sister-in-law. But she disliked and abused him, and the boy was forced to leave home with

50、only an old cow for company. The cow, however, was a former god who had violated imperial rules and was sent to earth in bovine form. One day the cow led Niulang to a lake where fairies took a bath on earth. Among them was Zhinu, the most beautiful fairy and a skilled seamstress. The two fell in lov

51、e at first sight and were soon married. They had a son and daughter and their happy life was held up as an example for hundreds of years in China. Yet in the eyes of the Jade Emperor, the Supreme Deity in Taoism, marriage between a mortal and fairy was strictly forbidden. He ordered the heaven troop

52、 to catch Zhinu back. Niulang grew desperate when he discovered Zhinu had been taken back to heaven. Driven by Niulang's misery, the cow told him to turn its hide into a pair of shoes after it died. The magic shoes whisked Niulang, who carried his two children in baskets strung from a shoulder p

53、ole, off on a chase after the empress. The pursuit enraged the empress, who took her hairpin and slashed it across the sky creating the Milky Way which separated husband from wife. But all was not lost as magpies, moved by their love and devotion, formed a bridge across the Milky Way to reunite the family. Even the Jade Emperor was touched, and allowed Niulang and Zhinu to meet once a year on the seventh night of the seventh month. This is how Qixi came to be. The festival can be traced back to the Han Dynasty (206 BC-AD 220). Traditionally, people would look up at the sky and find a bright