番茄紅素抗突變作用的實驗研究

1、7890-=番茄紅素抗突變作用的實驗研究李欣,張靜,楊穎,黃俊明熊習(xí)昆(廣東省疾病預(yù)防控制中心毒理所，廣東廣州 510300)Study on the Role of Lycopene Anti-mutationLI Xin, ZHANG Jing, YANG Ying,HUANG Jun-ming, XIONG Xi-kun(Lab of Genetic Toxicology, Center of Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510300, Guangdong, China)【摘要】 背景與目

2、的： 研究番茄紅素對突變劑誘導(dǎo)的遺傳損傷的抑制作用。 材料與方法： 采用修改的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗和Ames試驗：按食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法試驗，計數(shù)微核數(shù)、回復(fù)突變菌落數(shù)，計算微核率，相對菌落數(shù)和抑制率。 結(jié)果：小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗中預(yù)先給予番茄紅素的試驗組與環(huán)磷酰胺陽性組比較微核率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01），番茄紅素對環(huán)磷酰胺誘發(fā)小鼠胸骨骨髓微核的抑制率達(dá)到59以上。番茄紅素預(yù)處理突變劑的Ames試驗中TA98、TA100均有相對回變菌落數(shù)的減少，與致突變物對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01），且呈明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；番茄紅素與突變劑同時加入的Ames試驗中只有T

3、A98在140 g/皿劑量組有抑制作用。 結(jié)論： 番茄紅素能有效抑制突變劑誘導(dǎo)的遺傳損傷，具有一定的拮抗突變的作用?！娟P(guān)鍵詞】 番茄紅素； 微核； Ames試驗中圖分類號： Q343文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 1004616X(2006)04032704【ABSTRACT】 BACKGROUND AIM: To study the inhibition of lycopene on the genetic damage induced by mutagens MATERIAL AND METHODS： In accordance with the “Procedures and Methods

4、 for Toxicological Assessment on Food Safety”, and the modified micronucleus test and Ames test were used. The numbers of micronuclei and bacteria colonies were scored, then the micronucleus frequencies in polychromatic erythrocytes(fMPCE), relative bacteria colonies and the rates of inhibition were

5、 calculated. RESULTS: To compare with the positive control group treated with CP(Cyclophosphamide), the fMPCE in test groups pretreated with lycopene was significantly decreased(P0.01). The rate of inhibition of lycopene on fMPCE induced by CP was over 59. Compared with the positive group, the relat

6、ive bacteria colonies of TA98、TA100 were reduced in Ames test in which the mutagens were pretreated by lycopene, and there was adose-related were responses. But only the relative bacteria colonies of TA98 showed significant rise at 140 g/dish in Ames test in where the mutagens and lycopene were adde

7、d at the same time. CONCLUSION: Lycopene could effectively inhibit the genetic damage induced by mutagens, and to some degree it could play an anti-mutation role. 【KEY WORDS】 lycopene; micronucleus; Ames test流行病學(xué)研究已經(jīng)證實大量攝食水果蔬菜可有效降低人類腫瘤的發(fā)病風(fēng)險。對膳食中能夠預(yù)防遺傳損傷和抑制腫瘤毒性物質(zhì)的成分的研究也成為近年的熱點，番茄紅素(Lycopene,LP)就是其中之一

8、，它是廣泛存在于番茄及番茄制品、西瓜、胡蘿卜、草莓等果實蔬菜中的天然色素，是一種重要的類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)人類前列腺癌發(fā)病率與血漿中番茄紅素水平呈負(fù)相關(guān)1。通過飲食攝入番茄紅素還對肺癌和胃癌具有明顯的預(yù)防作用,宮頸癌、直腸癌、食管癌、口腔癌的發(fā)病率與番茄紅素的攝入成反比2。而腫瘤形成的內(nèi)在機(jī)制多為遺傳物質(zhì)的改變，我們就番茄紅素在消除或預(yù)防外來化學(xué)物引起的遺傳損傷方面的初步研究報告如下。1材料與方法1.1材料1.1.1樣品來源及制備受試物系由廣東某有限公司提供的番茄紅素軟膠囊，批號20020610，純度為每100 g產(chǎn)品中含番茄紅素2.8 g，其它成分主要為精制大豆油和防止番茄紅素氧化的天然抗氧

9、化劑。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗中以粟米油配制樣品，Ames試驗中以二甲基亞砜溶解樣品。1.1.2實驗動物選用廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心的普通級動物，合格證號00A025，NIH(National institutes of Health)種小鼠50只，體重1822 g，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。室溫22 24 ；濕度5075。1.1.3菌株及S9的制備經(jīng)組氨酸缺陷、脂多糖屏障缺陷、R因子、四環(huán)素抗性、uvrB修復(fù)缺陷及自發(fā)回變率鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA98、TA100，于37 振蕩培養(yǎng)10 h后，待用。用經(jīng)多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿微粒體酶系(Co-factor suppleme

10、nted post-mitochondrial fraction, S9)并加相應(yīng)的輔助因子(6磷酸葡萄糖、輔酶II)配制成體外代謝活化系統(tǒng)。1.2方法1.2.1小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗1.2.1.1劑量分組設(shè)陰性對照組、致突變物對照組和根據(jù)廠家提供的產(chǎn)品每日推薦量13.833 mg/kg得番茄紅素日推薦量0.387 mg/kg，據(jù)此設(shè)低、中、高濃度番茄紅素劑量組,陰性對照組采用粟米油；致突變物對照組采用50 mg/kg環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)；番茄紅素低劑量組為1.16 mg/kg,相當(dāng)于推薦日服量的3倍；中劑量組為3.87 mg/kg,相當(dāng)于推薦日服量的10倍；高劑量

11、組為11.6 mg/kg,相當(dāng)于推薦日服量的30倍。1.2.1.2實驗方法采用修改的小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗：按食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法試驗3，實驗組預(yù)先經(jīng)口給予番茄紅素連續(xù)30 d，每天一次，試驗?zāi)┢?最后兩天)，實驗組及致突變物對照組經(jīng)口給予CP(50 mg/kg)兩次(間隔24 h)，實驗組給予CP 1 h后再給予番茄紅素，第二次給予CP 6 h后，處死小鼠取胸骨骨髓材料制片、染色、鏡檢，每只動物觀察1 000個嗜多染紅細(xì)胞(Polychromatic erythrocytes, PCE)，記錄含微核(Micronucleus, MN)的PCE數(shù)，計算微核率(Micronucleus

12、frequencies, MNF)。計算抑制率，抑制率計算方法如下：A()=100式中 A: 抑制率;C: 致突變物對照組微核率;D: 受試樣品組微核率; E: 空白對照組微核率1.2.2鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(Ames試驗)1.2.2.1劑量分組設(shè)聯(lián)合染毒組即致突變物和不同劑量的番茄紅素聯(lián)合染毒、致突變物對照組、溶劑對照組。番茄紅素的最高劑量為140 g，以下設(shè)4個劑量，每個劑量設(shè)3個平皿，均包括加S9和不加S9兩種情況。致突變物的選擇：TA98、TA100加S9選用2-氨基芴(2-Aminofluorene, 2-AF)，不加S9 TA98選用敵克松，TA100選用疊氮鈉。1.2.2.

13、2改良的Ames試驗方法(平板滲入法)受試樣品預(yù)處理致突變物后的Ames試驗：0.1 ml致突變物及0.1 ml番茄紅素同時加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)中，加或不加S9，于37 水浴，預(yù)培養(yǎng)20 min，再加入0.1 ml菌液，取少量該懸液做細(xì)菌存活試驗，其余一同加入2 ml(45 水浴)頂層培養(yǎng)基，迅速傾入底層培養(yǎng)基，平放固化，37 培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)。受試樣品與致突變物同時作用的Ames試驗：將0.1 ml同樣體積的番茄紅素、致突變物與菌液共同加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)中，加或不加S9，于37 水浴，預(yù)培養(yǎng)20

14、 min，余步驟同上。1.2.2.3存活試驗(即細(xì)菌活力鑒定)將細(xì)菌懸液用磷酸鹽緩沖液稀釋106倍，取0.1 ml稀釋液加入2 ml(45 水浴)頂層培養(yǎng)基，傾入營養(yǎng)肉湯瓊脂平板，平放固化，37 培養(yǎng)24 h，計數(shù)菌落數(shù)。計算相對菌落形成率A()、相對菌落數(shù)D及抑制率F()。A()=B/C，式中B為受試樣品組菌落數(shù)(存活試驗)，C溶劑對照組菌落數(shù)(存活試驗)。D=E/A，式中E為各組實際菌落數(shù)(抗突變試驗)。F()=(GH)/(GI)，G 致突變物對照組相對菌落數(shù)，H為受試樣品組相對菌落數(shù)，I 為溶劑對照組實際菌落數(shù)。1.3統(tǒng)計學(xué)方法微核采用RC列聯(lián)表的卡方檢驗后再進(jìn)行卡方分割分析，按性別分別

15、進(jìn)行；相對菌落數(shù)采用單因素方差分析，在SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包上進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1蕃茄紅素對環(huán)磷酰胺誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的影響致突變物對照組(CP)的微核率高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)，表明致突變物對照組成立。番茄紅素各劑量組與致突變物對照(CP)組比較，無論雄鼠還是雌鼠微核率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果見表1。2.2蕃茄紅素對突變劑誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變菌落數(shù)的影響2.2.1受試樣品預(yù)處理突變劑后的Ames試驗番茄紅素與致突變物(加或不加S9)作用20 min后再加菌株共同培養(yǎng)，對TA98、TA100均有相對回變菌落數(shù)的減少，與致突變

16、物對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)，且呈現(xiàn)隨番茄紅素劑量增加相對菌落數(shù)減少、抑制率增加的趨勢。結(jié)果提示番茄紅素可直接滅活致突變物，且對這3種致突變物，番茄紅素均有滅活作用(表2)。2.2.2番茄紅素與突變劑同時加入的Ames試驗不同濃度的番茄紅素與致突變物(加或不加S9)及菌株共同作用20 min后，僅在140 g/皿劑量組有抑制作用，且對疊氮鈉而言無抑制作用。這說明在高濃度條件下，較高濃度番茄紅素可以抑制致突變物對菌株的誘變作用(表3)。3討論研究報道番茄紅素具有抗氧化、抑制突變、降低核酸損傷、預(yù)防和抑制腫瘤等多種功能。由于番茄紅素是飲食中的天然成分，安全可靠，目前已成為保健食品研究

17、的重點。研究中發(fā)現(xiàn)番茄紅素在較低濃度(1.16 mg/kg)即可對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的遺傳損傷具有保護(hù)作用，預(yù)先給予番茄紅素后環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的胸骨骨髓微核率顯著降低(P0.01)，抑制率雌、雄兩性分別達(dá)到59.92、73.91。Velmurugan等4在研究番茄紅素對N甲基N硝基N亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)誘導(dǎo)大鼠股骨微核試驗中，雖然番茄紅素在給予MNNG前5 d才開始給予番茄紅素1.25 mg/kg，同樣能觀察到番茄紅素使MNNG誘導(dǎo)微核率下降而且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Rauscher等5應(yīng)用大劑量(180 mg/kg)一次給予番茄紅素

18、和環(huán)磷酰胺(200 mg/kg)，同樣發(fā)現(xiàn)番茄紅素對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠股骨微核有降低作用，即使一次給藥抑制率都可達(dá)29.6。我們連續(xù)30 d給予番茄紅素后，可使環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠微核率下降達(dá)60.3173.91，明顯起到對遺傳損傷的保護(hù)作用。Ames實驗是常用的檢測外源性化合物致突變作用的試驗之一，它可以有效地從基因水平檢測各種誘變效應(yīng)。TA98可檢測各種移碼型誘變，而TA100可檢測引起堿基置換的誘變。本試驗采用敵克松、2-氨基芴(2-AF)、疊氮鈉這三種已知的強(qiáng)誘變劑分別對TA98、TA100進(jìn)行處理，并從兩個方面探討了番茄紅素的抗誘變作用及其可能的抗誘變機(jī)制。結(jié)果顯示，番茄紅素直接滅活致

19、突變物的作用較強(qiáng)，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且在較低濃度時仍表現(xiàn)有抑制效應(yīng)。當(dāng)番茄紅素與致突變物及菌株同時作用時，只有在高劑量才表現(xiàn)出對基因突變的抑制作用，且對疊氮鈉誘導(dǎo)的突變無拮抗作用，提示番茄紅素的抗突變能力與致突變物的種類或強(qiáng)度有關(guān)。本研究結(jié)果表明番茄紅素對外來化學(xué)物造成的遺傳損傷有保護(hù)預(yù)防作用，是一種十分有發(fā)展前途的保健食品成分。參考文獻(xiàn):1 Gann PH, Ma J, Giovannucci E, et al. Lower prostate cancer risk in men with elevated plasma lycopene levels: results of a prospective analysisJ.Cancer Res,1999,59():1 2251