植物生物技術(shù)

1、緒論一、植物生物技術(shù)的概念v 廣義植物生物技術(shù)：提高和改良植物產(chǎn)量和品質(zhì)的所有技術(shù)。它主要包括植物組織培養(yǎng)（植物細(xì)胞工程）、植物基因工程和分子標(biāo)記及其輔助育種三大部分。v 狹義的植物生物技術(shù)：利用植物器官、組織、細(xì)胞以及分子水平上的操作，促進(jìn)植物繁殖、有用物質(zhì)生產(chǎn)和品種遺傳改良的技術(shù)。3、基因工程改良的目標(biāo)v 投入特征& 主要是指幫助植物降低成本、提高產(chǎn)量或減少使用防治病蟲害以及雜草的各種費(fèi)用。研究內(nèi)容： 抗各種蟲害的危害；抗各種除草劑；抗病毒、細(xì)菌、真菌等各種病害；忍耐高溫、低溫、澇害以及高鹽脅迫等各種環(huán)境脅迫。v 產(chǎn)出特征 主要是指幫助植物提高品質(zhì)和增加產(chǎn)量。v 附加特征五、細(xì)胞工

2、程的應(yīng)用細(xì)胞工程的應(yīng)用（1）快速繁殖 細(xì)胞工程的應(yīng)用(2) 脫毒苗的生產(chǎn)細(xì)胞工程的應(yīng)用（3）胚培養(yǎng)細(xì)胞工程的應(yīng)用（4） 單倍體和多倍體的培養(yǎng)細(xì)胞工程在育種上的應(yīng)用（5）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交細(xì)胞工程的應(yīng)用（6） 種質(zhì)資源的離體保存細(xì)胞工程的應(yīng)用（7）次生代謝物的生產(chǎn) 細(xì)胞工程的應(yīng)用（8）人工種子的生產(chǎn)第一章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)和離體操作技術(shù)一植物組織培養(yǎng)的概述（一）植物組織培養(yǎng)的幾個(gè)基本概念§ 植物組織培養(yǎng)（Plant tissue culture） 通過無菌操作，把植物體的器官、組織、細(xì)胞甚至原生質(zhì)體，接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長、繁殖

3、或長出完整植株的技術(shù)和方法。用來培養(yǎng)的材料即外植體通常是離體的，所以又叫植物離體培養(yǎng)(plant in vitro culture)。 § 外植體 ( Explant ) 從活體上切取下來用于培養(yǎng)的那部分組織、器官或細(xì)胞。§ 植物細(xì)胞全能性(totipotency)：一個(gè)生活細(xì)胞具有的產(chǎn)生完整生物個(gè)體的潛在能力稱之為細(xì)胞的全能性（植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)）§ 脫分化(dedifferentiation) ：一個(gè)成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程。 § 去分化(redifferentiation) ：離體培養(yǎng)的植物組織和細(xì)胞形成的處于脫分化狀態(tài)的細(xì)胞（愈傷組織），

4、再度分化成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至最終再生成完整植株的過程。（二）植物組織培養(yǎng)的分類§ 培養(yǎng)方式1 . 根據(jù)培養(yǎng)方式Ø 固體培養(yǎng)（Solid culture ）Ø 液體培養(yǎng)（Liquid culture ） 液體培養(yǎng)又有液體懸浮培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)之分。Ø 固液培養(yǎng)（Solid- liquid culture ）Ø 看護(hù)培養(yǎng)（ Nurse culture ）Ø 飼喂層培養(yǎng) (Feeder layer culture)Ø 微室培養(yǎng) (Microchamber culture) 最常用的是固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，它們相比，

5、各自的優(yōu)缺點(diǎn)表現(xiàn)為：固體培養(yǎng)§ 優(yōu)點(diǎn)：通氣性較好，若有污染，只污染局部§ 缺點(diǎn)：使培養(yǎng)材料與培養(yǎng)基接觸不充分，有毒物質(zhì)易積累。 液體培養(yǎng)§ 優(yōu)點(diǎn)：有利于培養(yǎng)材料與培養(yǎng)基充分接觸且有毒物質(zhì)不易積累。缺點(diǎn)：一旦污染，則材料全部污染，且通氣性不好。 § 2 根據(jù)培養(yǎng)過程§ 初代培養(yǎng)(Primary culture) 從活體植株上切取下來進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。§ 繼代培養(yǎng)（Subculture） 經(jīng)過初代培養(yǎng)的材料，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的過程。§ 3. 根據(jù)培養(yǎng)材料(外植體) § 組織培養(yǎng)§ 器官培養(yǎng)§

6、; 胚胎培養(yǎng)§ 細(xì)胞培養(yǎng) § 原生質(zhì)體培養(yǎng)二、植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基1. 無機(jī)營養(yǎng)(Inorganic element) 根據(jù)國際植物生理協(xié)會(huì)的建議：將植物所需元素的濃度以0.5 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)分為大量元素與微量元素。 2.有機(jī)化合物 糖是組培材料必不可少的碳源和能源，此外糖類的添加還有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓的功能。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖、果糖也是較好的碳源。3。植物生長調(diào)節(jié)劑生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著形態(tài)分化的方向。4. 凝固劑、pH和其他成分第二章 植物細(xì)胞形態(tài)建成一、愈傷組織的誘導(dǎo)1、概念n 愈傷組織:原指植物組織受到傷害后表面形成的保護(hù)組織。n 愈傷組織:在組

7、織培養(yǎng)中,是指在培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)活躍生長的薄壁細(xì)胞。用途：愈傷組織可以通過液體懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生單細(xì)胞， 也可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下再生出完整的植株。2、誘導(dǎo)1）. 外植體的選擇大小要適宜,不宜太小。外植體的組織塊要達(dá)到2萬個(gè)細(xì)胞（5-10mg）以上才容易成活；同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差別；通常植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織；不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。理論上講用于培養(yǎng)的外植體包括根、莖、葉、果實(shí)、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。但外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜。2）. 外植

8、體的消毒3）. 愈傷組織誘導(dǎo)過程n 起動(dòng)期 又稱為誘導(dǎo)期，是愈傷組織形成的起點(diǎn)。這時(shí)在外觀上雖然未見明顯變化，但實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動(dòng)態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞正積極為下一步分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。 n 分裂期 外植體切口邊緣開始膨大，外層細(xì)胞通過一分為二的方式進(jìn)行分裂，從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過程。這時(shí)組織細(xì)胞代謝十分活躍，發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。n 形成期 是指外植體的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了具有無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織時(shí)期。這個(gè)時(shí)期特征是細(xì)胞大小不再發(fā)生變化，愈傷組織表層的分裂逐漸減慢和停止，接著內(nèi)部組織細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加。4）. 愈傷組織的形態(tài)特征Ø 質(zhì)

9、地不同的愈傷組織之間有時(shí)是可以互換的，有時(shí)則是不可逆的。 不同類型之間的愈傷組織互換主要通過改變激素濃度的方法來實(shí)現(xiàn)。培養(yǎng)基中加入高濃度的生長物質(zhì)，可使堅(jiān)實(shí)的愈傷組織變?yōu)樗纱?；反之，減少或去除生長物質(zhì)，則使松脆的愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)閳?jiān)實(shí)的愈傷組織。二、繼代培養(yǎng)n 愈傷組織培養(yǎng)一段時(shí)間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼續(xù)正常生長，更換一次培養(yǎng)基稱為一代繼代培養(yǎng)(subculture) 。ÿ 為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？n 培養(yǎng)基中的養(yǎng)分大量消耗；n 培養(yǎng)基中的水分散失；n 瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑(因?yàn)橹参锝M織在培養(yǎng)前幾周有時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒素物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基);n 由于植物材料的原因使培

10、養(yǎng)基pH降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化；n 生長物已充滿培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)物擴(kuò)繁的需要；三、器官建成Ø 形態(tài)建成，又叫形態(tài)發(fā)生，指有機(jī)體生長發(fā)育中組織結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生一系列變化，形成或再生成特定結(jié)構(gòu)和器官的過程。Ø 器官建成：又叫器官發(fā)生，指培養(yǎng)細(xì)胞在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生不定芽和不定根等器官的過程。1. 器官發(fā)生在適合的激素濃度和配比以及溫光條件下，愈傷組織細(xì)胞會(huì)發(fā)生生理代謝上的改變，促使細(xì)胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂逐漸形成分生細(xì)胞團(tuán)和分生組織，進(jìn)一步再分化形成維管結(jié)節(jié)直至分化成芽和根等器官。2. 植株再生的方式Ø 先芽后根Ø 根芽同生&#

11、216; 先根后芽3. 影響器官建成的因素影響器官建成的因素1外植體p 物種、種、甚至品種間再生能力是不同的p 同一植株不同器官或同一器官不同部位的外植體，其再生能力不同；p 外植體在原植物體上所達(dá)到的發(fā)育程度和結(jié)構(gòu)與功能對(duì)器官離體再生也有較大差異；p 取材時(shí)間（季節(jié)）不同再生能力不同；p 外植體的大小對(duì)再生也有較大影響。影響器官建成的因素2培養(yǎng)基成分p 植物激素的濃度、比例p 乙烯p 碳源的種類和濃度影響器官建成的因素3培養(yǎng)環(huán)境條件p 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)液固狀態(tài)、滲透壓p 培養(yǎng)基的化學(xué)性質(zhì)pHp 光照光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、光照周期 （連續(xù)/間隔）、光質(zhì)p 溫度四、體細(xì)胞胚胎建成n 體細(xì)胞胚胎建成

12、：又叫體細(xì)胞胚胎發(fā)生，指誘導(dǎo)體細(xì)胞形成體細(xì)胞胚，并進(jìn)一步再生出完整植株的過程。體細(xì)胞胚又叫胚狀體，是組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu) 。n 從胚狀體的這個(gè)概念可以看出：n 胚狀體不同于合子胚，因?yàn)樗皇莾尚约?xì)胞融合的產(chǎn)物；n 胚狀體不同于孤雌胚或孤雄胚，因?yàn)樗皇菬o融合生殖的產(chǎn)物；n 胚狀體不同于組織培養(yǎng)中通過器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根，因?yàn)樗男纬身毥?jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過程，而且成熟的胚狀體是一個(gè)雙極性結(jié)構(gòu)。1.體細(xì)胞胚胎的產(chǎn)生方式n 胚狀體一般來源于單細(xì)胞，可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可以從外植體表面或內(nèi)部已分化的細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞

13、產(chǎn)生。2. 體細(xì)胞胚的發(fā)育n 一個(gè)正常胚的發(fā)育一般要經(jīng)過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最后發(fā)育成完整的小植株。但有些植物如柑橘胚培養(yǎng)胚狀體的發(fā)育可能缺乏某一形態(tài)時(shí)期，這種胚狀體有時(shí)稱為畸形胚。五、人工種子人工種子：以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)過人工薄膜包裝得到的類似種子的單位。n 胚（胚狀體）：胚狀體、不定芽、頂芽和腋n 人工胚乳的成分：培養(yǎng)基+植物激素+有益微生物+殺蟲劑+除草劑+。n 人工種皮：要求不但能控制種子內(nèi)水分和營養(yǎng)物質(zhì)的流失, 而且能通氣和具有機(jī)械保護(hù)作用。如，藻酸鈉。2. 人工種子的特點(diǎn)n 不受季節(jié)限制，可周年生產(chǎn)；n 短期內(nèi)可以獲得大

14、量材料，可對(duì)一些“珍、稀、奇、特”以及基因工程植物進(jìn)行大量繁殖；n 不會(huì)造成性狀改變，方便運(yùn)輸和儲(chǔ)藏；n 目前，生產(chǎn)成本較高尚不能進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。第三章、植物離體快繁技術(shù)一、概念植物離體快繁又叫微繁，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。 二、離體快繁的一般方法l 無菌培養(yǎng)物的建立1、采樣外植體的選擇原則：外植體類型的選擇，一定程度上是由所要采用的莖芽繁殖方式?jīng)Q定的。外植體的生理狀態(tài)對(duì)莖芽的反應(yīng)能力有明顯的影響 選取相對(duì)較為幼嫩、生長能力較強(qiáng)的部位的材料2、消毒根據(jù)外植體的特點(diǎn)選擇適宜的消毒劑種類、濃度和消毒時(shí)間進(jìn)行外植體的表面消毒。參考第

15、一章外植體的消毒技術(shù)。3、接種4、培養(yǎng)l 莖芽的增殖1、原球莖途徑 原球莖：是蘭花的種子發(fā)芽過程中特有的一種形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，是縮短的、成珠狀、由胚性細(xì)胞組織的類似嫩莖的器官。 在組培中常從莖尖或側(cè)芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生。2、胚狀體途徑利用體細(xì)胞胚狀體來進(jìn)行無性系的大量繁殖具有極大的潛力。其特點(diǎn)是：繁殖系數(shù)高、成苗快、結(jié)構(gòu)完整不存在嵌合現(xiàn)象3、不定芽途徑葉腋和莖尖以外的任何其他地方所形成的芽，由愈傷組織分化出的莖芽也稱為不定芽。4、頂芽和腋芽萌發(fā)途徑l 無根苗的生根1、試管內(nèi)生根方法：把大于1cm的芽苗，接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。誘導(dǎo)條件：（1）較低的無機(jī)鹽濃度 常采用1/2或1/4強(qiáng)度的MS培養(yǎng)基或低無機(jī)鹽

16、的White培養(yǎng)基。（2）生長素 加入適量的生長素（較常用的是NAA和IBA） ，可促進(jìn)根的誘導(dǎo) 。（3）較低的糖濃度 降低糖濃度也有利于根的誘導(dǎo)。（4）一定的光照強(qiáng)度 有研究表明，較強(qiáng)的光照能促進(jìn)根的發(fā)育，并使植株變得堅(jiān)忍。 絕大多數(shù)植物在2-4周內(nèi)即可生根 .2、試管外生根離體條件下形成的枝條作為微插條進(jìn)行扦插生根。l 壯苗、煉苗和移栽移栽注意事項(xiàng): 第一，移栽前必須把附著于小苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，以免由于污染而導(dǎo)致小苗死亡；同時(shí)注意避免根頸部損傷引起小苗感染。第二,移栽時(shí)介質(zhì)要疏松通氣，保水但濾水性能好。常用的介質(zhì)以粗粒狀的蛭石、珍珠巖、草炭、粗沙或?qū)⑺鼈円砸欢ǖ谋壤旌蠎?yīng)用較好。&#

17、252; 第三，移栽后保持小苗的水分供需平衡。常采用加覆塑料薄膜或燒杯等措施盡量使植株周圍空氣濕度接近100，使葉面蒸騰減少，同時(shí)注意使植株的生活環(huán)境保持與周圍空四、離體無性繁殖存在的一些問題 一、物種的局限性 二、無性系變異 三、培養(yǎng)物污染 四、玻璃化玻璃化是植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃化苗與正常苗相比，其特點(diǎn)有： 生長速度下降，甚至最后死亡； 植株矮小腫脹，節(jié)間很短或幾乎沒有，葉片水漬化，半透明，厚而狹長，皺縮或縱向卷曲，脆弱易碎，葉片缺少角質(zhì)層，沒有功能性氣孔。 顯微觀察表明，玻璃化苗葉片沒有柵欄組織，僅有海綿組織。 生理生化研究表明，玻璃化苗細(xì)胞中含水量高、葉綠素、

18、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等含量低； 此外，一些酶的活性也發(fā)生了變化。§ 五、褐化褐化是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。是離體繁殖中發(fā)生比較普遍的一種現(xiàn)象。 褐化的發(fā)生與植物種類和品種、外植體年齡、大小和取材時(shí)間等都有一定關(guān)系。 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)及成分、繼代時(shí)間及培養(yǎng)環(huán)境對(duì)褐化的發(fā)生也有重要的影響。六、黃化黃化是試管苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁的現(xiàn)象。五、離體無性繁殖的商業(yè)化生產(chǎn)植物離體快繁的理論增殖值的計(jì)算 Y=mXn Y：代表年理論增殖總數(shù) m：代表外植體個(gè)數(shù) X：代表增殖倍數(shù) n：代表年理論增殖周期數(shù)第四章、無病毒苗培育五、植物脫

19、毒方法Ø 1. 熱處理原理：病毒和寄主細(xì)胞對(duì)高溫的忍耐程度不同，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r(shí)間，可使寄主體內(nèi)病毒的濃度降低，運(yùn)行速度減慢或失活，而寄主細(xì)胞仍然存活，并加快分裂和生長，從而達(dá)到脫毒的目的。不足：不能排除所有病毒，而且處理效果不一。§ 康乃馨花葉病毒在40 下處理，頂部病毒雖有減少，但基部病毒仍很多。§ 熱處理對(duì)部分球狀病毒（葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒）或線狀病毒（馬鈴薯X、Y病毒）有效，而對(duì)桿狀病毒則不起作用。Ø 2. 莖尖培養(yǎng)原理：病毒在植物體內(nèi)的分布不均勻，頂端分生組織無病毒或病毒濃度低。Ø 3. 微型嫁接脫毒Ø 4. 胚

20、培養(yǎng)與珠心胚培養(yǎng)Ø 5. 愈傷組織培養(yǎng)原理：愈傷組織是一系列排列疏松的細(xì)胞，帶毒植株上取得外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織，并不是每個(gè)細(xì)胞含病毒。因此，由愈傷組織再生的植株部分不含病毒。Ø 6. 熱處理+莖尖培養(yǎng)六、脫病毒植株的檢測(cè)和鑒定 直接觀察法 指示植物鑒定法植物病毒病都有一定的寄主范圍，并在某些寄主植物上表現(xiàn)特定的癥狀，這種能鑒別某種病毒的植物通常稱為指示植物或鑒別寄主。指示植物是指對(duì)某種或某幾種病毒及類似病原物或株系有敏感反應(yīng)，并表現(xiàn)明顯癥狀的植物。（1）指示植物法的意義（2）指示植物的要求指示植物對(duì)所指示的病毒類病原物敏感指示植物對(duì)所指示的病毒類病原物專一表現(xiàn)癥狀快易于

21、繁殖七、脫毒苗植株的保存和繁殖 保存 脫毒植株并不具有特殊的抗病性，可重新被感染，因此脫毒植株應(yīng)建防蟲紗網(wǎng)溫室內(nèi)保存。 繁殖 脫毒植株的繁殖可采用任何離體快繁的方法，但由于通過愈傷組織再生時(shí)變異頻率高、不定芽再生時(shí)發(fā)生嵌合的幾率大，所以多數(shù)情況下采用芽生芽的方式。第五章 單倍體和多倍體的培養(yǎng)一、花藥、花粉培養(yǎng)的概念及意義二、花藥培養(yǎng)的方法1、外植體的選擇 外植體的遺傳背景、生理狀態(tài)和花粉發(fā)育時(shí)期。 選擇花粉發(fā)育適宜時(shí)期（一般是單核中晚期到雙核早期）的花蕾。 鏡檢花粉發(fā)育時(shí)期，并根據(jù)發(fā)育時(shí)期與花蕾大小、外觀形態(tài)和顏色等的相關(guān)性，選擇適宜的花蕾。2、材料預(yù)處理 取花粉發(fā)育適宜的花蕾進(jìn)行預(yù)處理，低溫

22、處理一般在3-5處理3-10d，高溫處理一般在35處理1-3d。為避免花蕾失水，可將花蕾置于內(nèi)裝有浸濕的濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行處理。 3、材料消毒 消毒方法與其它組織消毒相同。4、接種 盡可能地避免花藥受到損傷；接種速度盡量快；注意接種密度。5、培養(yǎng) 1）基本培養(yǎng)基 因植物不同所用基本培養(yǎng)基不同，MS、N6、B5等。 2）糖濃度和糖的種類 培養(yǎng)基中蔗糖濃度比其它組織培養(yǎng)高，尤其早期培養(yǎng)，一般5%10%。原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長，而利于花粉的生長。 3） 激素 激素種類和濃度對(duì)花藥和花粉培養(yǎng)很重要。大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)用2,4-D

23、 和KT，但有些植物用BA和NAA。一般來說，高濃度2,4-D主要誘導(dǎo)花藥形成愈傷組織，不能形成胚狀體，增加了二倍體細(xì)胞發(fā)育的機(jī)會(huì)，所以2,4-D激素水平要相對(duì)較低。花藥壁分化程度高，重新分裂需要較高的激素濃度才能啟動(dòng)。因此，花藥培養(yǎng)激素水平要相對(duì)較低才能抑制二倍體細(xì)胞的分裂。確定適宜的激素濃度，使花粉細(xì)胞分裂的同時(shí)又抑制花藥二倍體細(xì)胞分裂是成功獲得單倍體的關(guān)鍵。 4）培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件 培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng) 雙層培養(yǎng) 培養(yǎng)條件： 溫度 光照 6、單倍體植株的誘導(dǎo)7、單倍體植株的加倍 秋水仙素誘導(dǎo)加倍三、影響花藥培養(yǎng)的因素1、基因型 不同基因型的培養(yǎng)難易及植株再生有很大差別。 2、供體

24、植株的生理狀態(tài)和環(huán)境條件 供體植株的年齡和所經(jīng)歷的環(huán)境條件如：光周期、光照強(qiáng)度、溫度等對(duì)以后的花粉離體培養(yǎng)有很大影響。一般田間比溫室，幼齡比老齡植株易于培養(yǎng)。3、花粉發(fā)育時(shí)期 只有發(fā)育到某一時(shí)期的花粉對(duì)離體刺激才最敏感。 因此選擇合適的花粉發(fā)育時(shí)期的花藥很關(guān)鍵，多數(shù)植物單核期（單核后期）的花粉培養(yǎng)容易成功。4、預(yù)處理 花粉或花藥從植株上取下來直接培養(yǎng)，往往誘導(dǎo)頻率極低，采用低溫、高溫、離心等預(yù)處理方法可以促進(jìn)花粉啟動(dòng)，提高再生頻率。5、培養(yǎng)基成分 基因型不同，所需培養(yǎng)基種類，蔗糖濃度以及添加激素種類和濃度不同。加入活性炭可提高花粉植株的誘導(dǎo)率。6、花藥壁因子7、培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件五、胚乳培養(yǎng)二

25、、影響胚乳形成愈傷組織的因素：1）胚乳發(fā)育時(shí)期Ø 發(fā)育早期的胚乳，接種不方便，愈傷組織的誘導(dǎo)頻率很低。Ø 處于旺盛生長期的胚乳，離體條件下最易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。Ø 接近成熟或完全成熟的胚乳，愈傷組織誘導(dǎo)頻率很低。2）培養(yǎng)基（WT、MS、LS植物激素） 對(duì)一般植物，生長素細(xì)胞分裂素合理搭配，效果更好。 大麥2,4-D、獼猴桃玉米素 棗+任何一種生長素（無特別要求）3）胚在胚乳培養(yǎng)中的作用 旺盛期的未成熟胚乳，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上無需原位胚的參與，就能形成愈傷組織。 完全成熟的胚乳，生理活動(dòng)很弱，在誘導(dǎo)脫分化前，必須借助于原位胚的萌發(fā)，使其活化?？赡茉蚴桥咴诿劝l(fā)時(shí)產(chǎn)生某種

26、物質(zhì)“ 胚因子”。外源GA3能部分取代胚因子。4）其他因素 培養(yǎng)基中的蔗糖濃度、光照、pH等。三、胚乳愈傷組織再生植株1、胚狀體途徑2、器官發(fā)生途徑第六章 原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合一、原生質(zhì)體概念以及原生質(zhì)體研究中的幾個(gè)重要成就原生質(zhì)體（protoplast)：指去除細(xì)胞壁的裸露的具有活力的植物細(xì)胞。 核質(zhì)體(nuclearplast) ：由原生質(zhì)體膜和薄層細(xì)胞質(zhì)形成的小原生質(zhì)體，也稱為微小原生質(zhì)體（miniprptoplast）。 胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而只含部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。二、原生質(zhì)體分離2、影響原生質(zhì)體分離的因素外植體來源 生長旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活力原生

27、質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。 用于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、原球莖、花瓣、葉表皮、愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物等。 前處理p 進(jìn)行表面消毒，除非材料來源于無菌條件。p 為了保證酶液充分進(jìn)入組織， 可撕去葉片下表皮，如果葉片的下表皮撕不掉或很難撕掉，可把葉片切成小塊，如果是其他組織可直接切成小塊。為了促進(jìn)酶液的滲入也可結(jié)合真空抽濾。p 此外，高滲處理、激素處理、低溫處理、激素處理與低溫處理結(jié)合等方法。 分離培養(yǎng)基分離植物原生質(zhì)體的酶液主要由分離培養(yǎng)基、酶和滲透壓穩(wěn)定劑組成。 常用的分離培養(yǎng)基主要是CPW鹽溶液，也有用鈣(CaC

28、l2·2H2O)和磷(KH2PO4)鹽組成的溶液或1/2MS鹽溶液等。酶的種類和濃度 常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶，酶解花粉母細(xì)胞和四分體小孢子時(shí)還要加入蝸牛酶。 酶的水平應(yīng)根據(jù)不同植物材料而有所變化。常用的纖維素酶濃度是1%3%，果膠酶為0.1%0.5%，離析酶為0.5%1%，半纖維素酶為0.2%0.5%。 滲透壓穩(wěn)定劑酶液中滲透壓對(duì)平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透壓、維持原生質(zhì)體的完整性和活力有很重要的作用。一般來說，酶液、洗滌液和培養(yǎng)液中的滲透壓應(yīng)高于原生質(zhì)體內(nèi)的滲透壓；較高的滲透壓可防止原生質(zhì)體破裂或出芽，但同時(shí)也使原生質(zhì)體收縮并阻礙原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂。酶解條件和時(shí)間 &

29、#216; 酶解時(shí)間視材料而定，范圍為2-8h，一般不超過24h。Ø 酶解的溫度一般為23-32；Ø 酶解的pH值因使用酶的不同而不一樣，一般在5.65.8，過高或過低均不適于原生質(zhì)體分離。 四、原生質(zhì)體融合（一）、概念 原生質(zhì)體融合(protoplast fusion)，是指不同親本的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程。 表示方法：“a(+)b”，其中a和b是兩個(gè)融合親本，(+)表示體細(xì)胞雜交。 幾種表述方式 細(xì)胞融合(cell fusion) 體細(xì)胞雜交(somatic hybridization) 超性雜交(parasexual hybridiza

30、tion) 超性融合(parasexual fusion)（二）、原生質(zhì)體融合的方法1、自發(fā)融合 2、誘發(fā)融合 (三）、原生質(zhì)體融合的方式 對(duì)稱融合 非對(duì)稱融合 配子-體細(xì)胞融合 亞原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合(四)、體細(xì)胞雜種的篩選與鑒定3、雜種植株的鑒定 形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。 細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定、染色體原位雜交。 生化鑒定：同功酶鑒定。 分子鑒定：RFLP、RAPD、SSR等分子標(biāo)記鑒定(五)、體細(xì)胞雜種的核質(zhì)遺傳概念 核遺傳：雙親之和，少數(shù)有重組和丟失。 線粒體遺傳：往往有重組，柑橘上例外，僅來自愈傷組織親本。 葉綠體遺傳：隨機(jī)分離，也有共存現(xiàn)象。第七章

31、 植物遺傳轉(zhuǎn)化一、 植物基因工程的研究現(xiàn)狀1.植物基因工程的概念 植物基因工程是以植物為受體的一種基因操作，即以分子生物學(xué)為理論基礎(chǔ)，采用基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以正確表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，從而使受體獲得新性狀的技術(shù)體系。5. 植物遺傳轉(zhuǎn)化的分類遺傳轉(zhuǎn)化根據(jù)是否需要載體分為非載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。 二、 植物基因工程載體的種類載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。目前所用的載體有細(xì)菌的質(zhì)粒、噬菌體或病毒，但更多使用的是改造過的載體。§ 1.質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體:質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外

32、存在的一種能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，其大小從1kb到200kb不等。可以自我復(fù)制和傳代。各種不同類型的Ti質(zhì)粒都具有T-DNA區(qū)、毒性區(qū)、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)、質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)和冠癭堿分解位點(diǎn)。其中以T-DNA區(qū)和毒性區(qū)在植物轉(zhuǎn)化中最為重要。2. 病毒載體目前，以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體有很多，如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒等等。3.整合載體三、受體材料的選擇 受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。 良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：p 1、高效穩(wěn)定的再生能力；p 2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；p 3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；p 4、對(duì)篩選劑敏

33、感；p 5、轉(zhuǎn)化率高1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。2.直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。3、原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。4.胚狀體再生系統(tǒng) 是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。三、 植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和方法一）、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因 3. 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素A、農(nóng)桿菌菌株 不同的農(nóng)桿菌菌株有不同的宿

34、主范圍，并有其特異侵染的最適宿主。不同類型的農(nóng)桿菌菌株的毒力（侵染力）不同。 一般而言，三類農(nóng)桿菌菌株的侵染力的排列順序?yàn)椋恨r(nóng)桿堿型（琥珀堿型）菌株（如A281）>胭脂堿型菌株（C58）>章魚堿型菌株（Ach5，LBA4404）。B、農(nóng)桿菌菌株的生長時(shí)期 高侵染活力的菌株一般處在對(duì)數(shù)生長期，也即0.31.8 OD600范圍。一般用0.31.0 OD600農(nóng)桿菌菌液接種植物材料。1.0 OD1x109 cell/ml。C 、基因活化的誘導(dǎo)物 Vir 區(qū)基因的活化是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的先決條件。酚類化合物、單糖或糖酸、氨基酸、磷酸饑餓和低pH都影響Vir區(qū)基因的活化。在操作過程中，最常用的誘導(dǎo)物是乙酰丁香酮（AS）和羥基乙酰丁香酮（HO-AS），但AS效果更佳。D、外植體的類型和生理狀態(tài) 細(xì)胞具有分裂能力是轉(zhuǎn)化的基本條件。一般來說，發(fā)育早期（幼年期）的組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng) 。E、外植體的預(yù)培養(yǎng) 外植體的預(yù)培養(yǎng)有以下作用：促進(jìn)細(xì)胞分裂，使受體細(xì)胞